邵婉璐 李月靈 高 松 李鈞敏,3* 梁宗鎖

(1.浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，杭州 310018； 2.臺州學(xué)院植物進化生態(tài)學(xué)和保護浙江省重點實驗室，臺州 318000； 3.臺州學(xué)院生態(tài)研究所，臺州 318000)

植物果實穩(wěn)定、均勻的著色和香味是果實品質(zhì)重要的特性。果實色素主要包括花色素、番茄紅素、類胡蘿卜素等，在自然界中花青素廣泛存在于各種植物的花瓣、果實、種子等植物器官中，產(chǎn)生不同的顏色來幫助植物吸引傳粉授粉的昆蟲，保護植物免于紫外線等非生物的損傷以及病原體等的生物攻擊[1～2]?；ㄇ嗨貙儆邳S酮類色素，具有高效的抗氧化活性，可以提高視力[3]，還具有預(yù)防慢性病如炎癥[4]、腫瘤[5]、老齡化疾病[6]、心血管疾病[7]等的生理功效。在自然界中已發(fā)現(xiàn)400多種花青素，其中高等植物中普遍存在的有6種[2]?；ㄇ嗨厣锖铣傻拇x途徑是類黃酮合成途徑中的一個分支，在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、玉米(Zeamays)、金魚草(Antirrhinummajus)以及矮牽牛(Petuniahybrida)等植物中已經(jīng)被詳細解釋[8]，并從中分離克隆了一些參與花青素合成與調(diào)控相關(guān)基因[9]?；ㄇ嗨睾铣赏緩街邪ū奖彼峤獍泵富?PAL)，查耳酮合成酶基因(CHS)，查耳酮異構(gòu)酶基因(CHI)，二氫黃酮醇4-還原酶基因(DFR)，類黃酮-3′羥化酶基因(F3′H)，花色苷合成酶基因(ANS)和類黃酮3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶基因(UFGT)等關(guān)鍵酶基因。Dubos等[10]對擬南芥花青素的合成途徑進行分析，認為主要可以分為三個階段，第一階段起始于苯丙氨酸，在苯丙氨酸裂解酶(PAL)、肉桂酸羥化酶(C4H)、香豆酸CoA連接酶(4CL)的作用下生成4-香豆酰輔酶A；第二個階段是在查爾酮合成酶(CHS)、查爾酮異構(gòu)酶(CHI)、黃烷酮3-羥化酶(F3H)和類黃酮-3′羥化酶基因(F3′H)的作用下合成二氫黃酮醇的過程；第三階段是在二氫黃酮醇4-還原酶基因(DFR)、花色苷合成酶基因(ANS)和類黃酮3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶基因(UFGT)的催化下生成穩(wěn)定的花色素苷。而植物花青素的生物合成除了受結(jié)構(gòu)基因的調(diào)控外，還受到調(diào)控基因的影響。參與花青素合成調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子主要分為3類MYB、bHLH和WD40，這些轉(zhuǎn)錄因子通過與結(jié)構(gòu)基因啟動子中相應(yīng)的作用原件結(jié)合，一起調(diào)節(jié)花青素合成途徑中的一個或者多個基因的表達，從而控制花青素的合成。

植物生存的環(huán)境對果實著色有著很大的影響，其中光是很重要的影響因子之一。光和花青素生物合成之間的關(guān)系是園藝育種與栽培過程中一個重要的研究方向[11]。研究蘋果(Malus×domestica)光照強度實驗時發(fā)現(xiàn)，一天中相對光照大于30%高光照區(qū)域，三主枝開心形的單果質(zhì)量、花青苷含量、硬度、可溶性固形物含量顯著高于其他冠形結(jié)構(gòu)[12]。在對兔眼藍莓(Vacciniumashei)的研究中發(fā)現(xiàn)，果實的總酚物質(zhì)、類黃酮、花青素、維生素C含量整體隨光照減弱而降低[13]。遮蔭對大櫻桃(Cerasuspseudocerasus)的研究結(jié)果表明，與對照處理相比，遮蔭降低了枝條上果實的可溶性固形物含量和硬度，而且果實著色變差[14]。研究還發(fā)現(xiàn)，在果實生長的不同時期對果實進行弱光處理，都會不同程度的降低果實中糖、酸和花青素的含量[15]。有相關(guān)研究認為，弱光對果實的影響主要是因為光照不足導(dǎo)致光合作用下降，從而降低了提供給果實的同化物量，最終導(dǎo)致果實的品質(zhì)降低[16]。

草莓(Fragaria×ananassaDuch)是廣泛栽培的重要經(jīng)濟植物。其外觀呈果狀圓形或心形，具有極高的營養(yǎng)價值，富含豐富的維生素C、花青素等[17]，有特殊且濃郁水果芳香，被人們譽為“果中皇后”，深受市場歡迎。研究表明光質(zhì)對豐香草莓(Fragaria×ananassa‘Toyonoka’)葉片的光合特性有較大影響[18]。而不同光質(zhì)也會影響草莓果實的香氣成分[19]。近年來，草莓大多數(shù)花青素合成相關(guān)功能基因和轉(zhuǎn)錄因子逐步被分離出來，其中Duan[20]等研究表明FpCHS、FpCHI、FpF3H、FpDFR、FpANS、FpUFGT及轉(zhuǎn)錄因子MYB10在五葉草莓紅果和白果之間的表達有很大差異，表明不同果色的果實中色素相關(guān)的基因及轉(zhuǎn)錄因子表達強度不同。而有研究表明轉(zhuǎn)錄因子MYB10的過表達顯著提高了草莓植株的葉、根、果實、和柱頭等植物器官的花青素苷水平[21]。但光照強度變化對草莓花青素的合成的調(diào)控機制的研究較少。因此利用光照來調(diào)控其花青素也成為草莓提高商業(yè)價值的重要目標之一。紅顏草莓(Fragaria×ananassaDuch. ‘Benihoppe’)生長勢強，是我國目前主要的早熟栽培品種，其栽培區(qū)占地面積很大，從南到北緯度跨度廣，受光照影響較大，因此研究不同光照強度對紅顏草莓果實著色、花青素含量及其生物合成相關(guān)基因的表達，可為紅顏草莓生產(chǎn)中適宜的補光研發(fā)提供理論依據(jù)，具有重要的實踐價值。

1 材料與方法

1.1 試驗材料處理及采樣

供試材料為栽培紅顏草莓(文中簡稱“草莓”)。實驗于2017年4月24日在臺州學(xué)院溫室大棚外試驗基地上進行。選取在正常光照條件下完成授粉的草莓，用不同遮蔭網(wǎng)進行遮蔭處理。用照度計在一段時間內(nèi)分別不同時間段多次進行測定自然條件下光照和各處理遮蔭網(wǎng)下的光照強度，取平均數(shù)確定不同遮蔭下的透光率。試驗設(shè)計分別為：自然光照(無遮蔭網(wǎng)，透光率100%)；輕度遮陰(2層白色遮蔭網(wǎng)，平均透光率75%)；中度遮蔭(1層黑色遮蔭網(wǎng)，平均透光率25%)。每種處理材料不少于10株。25 d后，待各處理的草莓成熟后摘取果實，樣品采集拍照后，一部分馬上用于花青素含量測定，另一部分液氮速凍后存于-70℃保存，用于后續(xù)分子實驗。每個處理取6個果實，以單株為重復(fù)。

1.2 草莓果實花青素含量測定

采用日本島津高效液相色譜儀(型號LC-20A)進行花青素含量的測定。試樣制備[22]：取2.5 g草莓果實放入液氮中研磨成粉末，加入10 mL含0.1% HCl的甲醇，室溫萃取24 h，然后在6 650 r·min-1條件下離心15 min，上清液過0.45 μm濾膜，待上樣測試。紫外檢測器為SPD-20A紫外檢測器；色譜柱：ODS-2 C18柱(型號250 mm×4.60 mm 5 μV)；紫外檢測波長：520 nm；流速：0.7 mL·min-1。柱溫：35℃。進樣量：20 μL；A相：0.05%甲酸水溶液(體積比)；B相：0.05%甲酸+乙腈；梯度洗脫：0～5 min：5%B，5～10 min：5%～10%B，10～25 min：10%～90% B，25～30 min：90～5%B。以標樣出峰時間和峰高疊加定性，外標法峰面積定量。每個濃度進樣3次，取3次峰面積平均值。以矢車菊素-3-O葡萄糖苷(C3G)(購自上海詩丹德生物技術(shù)有限公司)為標準品(圖1)進行線性回歸。標準曲線為y=2.659 28e-005×x-0.369 148(R2=0.999 180 2)，線性關(guān)系良好?；ㄇ嗨睾恳云骄鶖?shù)±標準誤表示。

圖1 矢車菊素-3-O葡萄糖苷(C3G)色譜圖Fig.1 Chromatography profiles of C3G

1.3 草莓花青素代謝途徑相關(guān)基因的表達分析

1.3.1 RNA提取及cDNA合成

草莓果實總RNA參照RNeasy Plant Mini kit試劑盒(Qiangen)操作進行提取，總RNA提取后，分別用瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop超微量分光光度計(Thermo)檢測質(zhì)量和濃度。然后每個樣品取5 μL總RNA，參照PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)使用說明合成cDNA。使用Primer Premier 5.0軟件，設(shè)計選取查爾酮合成酶基因(FaCHS)、查爾酮異構(gòu)酶基因(FaCHI)、黃烷酮-3-羥化酶基因(FaF3H)、類黃酮-3′-羥化酶基因(FaF3′H)、二氫黃酮醇4-還原酶基因(FaDFR)、花色苷合成酶基因(FaANS)、類黃酮-3-葡糖基轉(zhuǎn)移酶基因(FaUFGT)及轉(zhuǎn)錄因子MYB10、MYB1為研究對象，分別設(shè)計上述基因?qū)崟r熒光定量PCR引物(表1)[20]，引物由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司合成。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.3.2 熒光定量PCR分析

實時熒光定量PCR在Eco定量PCR儀器(美國Illumina公司)上完成，參照SYBR Premix試劑盒(大連寶生物)的使用說明進行操作。反應(yīng)總體積為：10 μL：5 μL 2×SYBR qPCR Mix，上、下游引物各0.2 μL(10 mmol·L-1)，1 μL cDNA模板和3.6 μL滅菌雙蒸水。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；40個循環(huán)：95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s。以草莓18S rRNA為內(nèi)參基因[20]，每個樣品設(shè)3個重復(fù)。采用2-△△CT方法[23]計算FaCHS、FaCHI、FaF3H、FaF3′H、FaANS、FaDFR、FaUFGT基因以及轉(zhuǎn)錄因子FaMYB10、FaMYB1的表達量，所有結(jié)果重復(fù)3次，以平均數(shù)±標準誤表示。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用單因素方差方法分析不同處理間草莓色素含量及基因表達量的差異性。采用最小顯著極差法進行不同光照強度處理之間的多重比較。采用Pearson相關(guān)系數(shù)分析色素含量與基因表達的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 光照對草莓果色的影響

光照強度影響草莓果實的著色，隨著光照強度的下降草莓果實的顏色由紅色逐漸減弱，低透光率下果色呈現(xiàn)淺色(圖2)。

圖2 不同光照處理下草莓果實著色的影響 A. 100%透光下的果實；B. 75%透光的果實；C. 25%透光的果實Fig.2 Effects of different light conditions on the coloration of strawberry fruits A. Fruit of 100% transmittance; B. Fruit of 75% transmittance; C. Fruit of 25% transmittance

2.2 光照對草莓果實花青素含量的影響

HPLC檢測顯示3個處理在520 nm波段處均檢測到花青素類物質(zhì)，與標準品比對后確認為C3G。根據(jù)參考標樣的滯留時間和峰面積可以看出，隨光照強度降低草莓果實積累的花青素含量降低，草莓果實顏色越深色素積累含量越高。75%和25%透光率下草莓果實合成的花青素含量分別為100%透光率下的58.42%和7.46%(圖3)。

圖3 不同光照下草莓果實花青素含量 100%. 透光率100%；75%. 透光率75%；25%. 透光率25% 不同字母表示不同處理之間存在顯著性差異，下同。Fig.3 The content of anthocyanin in strawberry fruits under different light conditions 100%. Light transmittance 100%; 75%. Light transmittance 75%; 25%. Light transmittance 25% Different small letters indicate there is significant difference between different treatments,the same as below.

2.3 光照對草莓果實花青素合成相關(guān)基因表達的影響

如圖4所示，F(xiàn)aCHS、FaCHI、FaF3H、FaF3′H、FaDFR、FaANS、FaUFGT等基因的表達均隨光照強度的降低而下降，在75%透光率下各基因表達分別下降了41.87%、41.91%、46.47%、39.69%、24.57%、41.02%、31.81%，而在25%透光下各基因表達分別下降了39.21%、62.81%、71.57%、87.74%、46.64%、57.26%和50.31%。

2.4 光照對草莓果實花青素合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子表達的影響

如圖5所示，轉(zhuǎn)錄因子FaMYB10及FaMYB1在草莓果實中的表達也隨光照強度降低而降低，F(xiàn)aMYB10在75%透光和25%透光下的表達率相對于100%透光下分別下降了25.85%和46.24%，而FaMYB1則分別下降了39.49%、35.47%。但FaMYB1在75%和25%透光下的表達差異不顯著。

2.5 色素含量與基因表達量的相關(guān)性分析

從表2可以看出，在不同光照處理下草莓果實花青素(C3G)含量與基因FaDFR和FaUFGT的相關(guān)性達到顯著水平；與FaF3′H的相關(guān)性達到極顯著水平；而與其它基因FaCHS、FaCHI、FaF3H和FaANS以及轉(zhuǎn)錄因子FaMYB10和FaMYB1相關(guān)性不顯著。

3 討論

花卉、果實豐富的顏色是由花色素苷決定的，不穩(wěn)定的花色素形成后，在UFGT的作用下進一步與葡萄糖糖苷形成穩(wěn)定的花色素苷。而光照是影響著色的重要環(huán)境因子。孟祥春等[24]對非洲菊(Gerberehybrida)花色素苷積累的研究結(jié)果也表明阻斷光照后，花不能正常著色。本研究發(fā)現(xiàn)遮光條件可以影響草莓果實的著色和花青素的含量，隨著光照強度的降低，草莓成熟果實中花青素含量也減少，這表明光照的強弱是影響草莓果實著色和花青素合成的關(guān)鍵因子之一。

圖4 不同光照下草莓果實花青素合成相關(guān)基因的表達Fig.4 Expression of anthocyanin biosynthesis related gene in strawberry fruits under different light conditions

圖5 不同光照下草莓果實花青素合成相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達Fig.5 Expression of anthocyanin biosynthesis related transcription factors in strawberry fruits under different light conditions

對花青素合成途徑相關(guān)基因的表達分析顯示，光照對草莓果實花青素合成過程中涉及到的酶基因FaCHS、FaCHI、FaF3H、FaF3′H、FaANS、FaDFR、FaUFGT以及轉(zhuǎn)錄因子FaMYB10、FaMYB1的表達均有影響。周波[25]研究草莓果實對光的響應(yīng)時發(fā)現(xiàn)，光敏感性不同的草莓果實在花青素合成過程中最終合成的花青素含量不同，花青素合成相關(guān)基因CHS、DFR、ANS在光不敏感型草莓果實“女峰”果實遮光部分和受光部分的表達沒有明顯差異，而部分光敏感型草莓“豐香”果實遮光部分比受光部分表達量減少。本實驗中得到的FaCHS、FaDFR、FaANS在不同光照下的表達結(jié)果與光敏感型草莓結(jié)果一致，表明本實驗采用的紅顏草莓為一種光敏感型草莓。C3G是一類3′-4′-羥化化合物，而F3′H是控制花青素B環(huán)羥化的重要功能酶，F(xiàn)3′H基因的上調(diào)會導(dǎo)致Penstemonbarbatus其花從藍色到紅色的顏色變化[9]，是C3G和花翠素合成的重要決定因子。本研究中，在強遮光條件下FaF3′H基因的表達量呈現(xiàn)出顯著下調(diào)，說明草莓的果實的著色與其密切相關(guān)。DFR處于花青素代謝途徑中的中下游，催化二氫黃酮醇形成不穩(wěn)定原花色素，我們發(fā)現(xiàn)FaDFR基因表達與色素含量呈現(xiàn)顯著相關(guān)性，這與Espley RV[26]及Yoshio Itoh[27]等報道的DFR基因的表達活性與蘋果果皮色素含量呈緊密相關(guān)性相一致。UFGT是花青素合成過程中最后一個的關(guān)鍵酶，主要作用是在花青素形成后對碳骨架進行糖基化修飾[28]，它能使不穩(wěn)定的花青素通過糖基化作用轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的花青苷，在色素形成過程中發(fā)揮重要作用。我們結(jié)果顯示FaUFGT基因的表達同色素含量呈現(xiàn)顯著相關(guān)性，這一結(jié)果同一些在蘋果、梨、葡萄中的報道也相一致[29～30]。FaF3′H、FaDFR和FaUFGT基因表達都和C3G的合成密切相關(guān)。色素合成途徑中各基因的表達趨勢在果實的不同發(fā)育階段常不同[31]，進一步的研究可以分析不同光照條件下草莓不同發(fā)育階段果實花青素含量及與合成相關(guān)基因表達的相關(guān)性，以深入闡明光照對草莓花青素合成的影響分子機制。

表2不同光照強度下草莓色素含量與花青素合成基因的相關(guān)性分析

Table2Thecorrelationcoefficientsbetweenthecontentofanthocyaninandtherelativeexpressionoftheanthocyaninsynthesisrelatedgenesunderdifferentlightconditions

指標IndexFaCHSFaCHIFaF3HFaF3'HFaANSFaDFRFaUFGTFaMYB10FaMYB1色素Pigment0.8030.9690.9740.999**0.9540.996*0.994*0.9920.781

注：*表示0.05顯著差異；**表示0.01極顯著差異
Note：*indicates the significant level of 0.05;**indicates the significant level of 0.01

植物中對花青素合成途徑中起調(diào)控作用的重要轉(zhuǎn)錄因子主要有MYB、bHLH和WD40，這些轉(zhuǎn)錄因子與結(jié)構(gòu)基因的啟動子結(jié)合，激活或抑制花青素生物合成途徑中一個或多個結(jié)構(gòu)基因的表達，影響色素的合成[32～33]。Yao等[34]通過對梨(Pyrus)果皮花青素合成的研究驗證了PyMYB114的功能，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子PyMYB114和PyMYB10的功能存在著互作及疊加的效應(yīng)，這兩種基因在煙草和草莓上的共轉(zhuǎn)化導(dǎo)致花青素的生物合成增強。目前，和草莓花青素合成有關(guān)的報道中，涉及到的MYB轉(zhuǎn)錄因子主要有FaMYB1和FaMYB10。Wang等[21]研究表明FaMYB10在煙草葉片體系中可直接激活擬南芥DFR基因。Medina-Puche等[35]研究報道MYB10基因在草莓紅色果實發(fā)育過程中，與色素含量呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，且可影響花青素合成基因FaDFR的表達。Kadomura-Ishikawa等[36]發(fā)現(xiàn)FaF3′H基因的表達量也受到FaMYB10的調(diào)控。Ai等[37]研究菊花花青素調(diào)控關(guān)鍵基因時發(fā)現(xiàn)，將RsMYB1基因轉(zhuǎn)入到矮牽牛中時，高表達的RsMYB1基因可以顯著提高花青素生物合成過程中的結(jié)構(gòu)基因的表達，從而增加菊花花瓣等植物器官中的花青素含量。這些結(jié)果表明草莓中的FaMYB10和FaMYB1轉(zhuǎn)錄因子在花青素合成途徑上對這些結(jié)構(gòu)基因有著直接或間接作用。而在我們的結(jié)果中在100%透光率下草莓果實色素含量最高且成熟度最高時轉(zhuǎn)錄因子FaMYB10及FaMYB1表達量最高，說明光照對轉(zhuǎn)錄因子也存在著顯著的作用進而影響到了相關(guān)基因的表達。遮光實驗說明光照對草莓中的影響可能是通過相關(guān)的光受體，進而影響轉(zhuǎn)錄因子的活性[36]，最終影響了花青素的合成。本研究也發(fā)現(xiàn)了FaMYB1的表達在25%和75%光照強度下沒有顯著性差異，表明其與FaMYB10對花青素合成途徑相關(guān)基因的調(diào)控及階段可能不同，應(yīng)在后續(xù)的研究中作為重點。

綜上所述，紅顏草莓為光敏感型草莓品種，光照強度可對其成熟果實的著色與花青素含量產(chǎn)生顯著影響，其可能是通過轉(zhuǎn)錄因子影響花青素合成相關(guān)基因的表達來實現(xiàn)。紅顏草莓栽培種在果實發(fā)育期需注重光照，在光線不足的情況下需人工補光以獲得較好的果實品質(zhì)。另外草莓中花青素的合成代謝具有復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機制，相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制還需要進一步研究。