位 珍 程玉祥 夏德安

(東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室,哈爾濱 150040)

束狀阿拉伯半乳聚糖蛋白(fasciclin-like arabinogalactan proteins，F(xiàn)LA)是阿拉伯半乳聚糖蛋白(arabinogalactan proteins，AGPs)的一個亞家族，在植物根、莖、種子生長發(fā)育中起著重要作用。同時擁有fasciclin結(jié)構(gòu)域和AGP-like糖基化區(qū)域的氨基酸特征序列，被認為是FLA家族成員,fasciclin結(jié)構(gòu)域約有110個氨基酸，但其分子功能還不清楚[1]。根據(jù)結(jié)構(gòu)域的不同，F(xiàn)LA被分成4個亞類(A-D)，其中A類包含一個fasciclin結(jié)構(gòu)域，其兩邊有AGP糖基化區(qū)域[2]。一些研究表明這個亞類FLA介入植物次生細胞壁功能：楊樹PopFLA1-10表達水平被受到的張力及壓力調(diào)控[3]；擬南芥AtFLA11和AtFLA12參與次生壁沉積[4～6]，AtFLA11/12雙突變體莖硬度和韌性均降低且微纖絲角增加[7]；百日菊ZeFLA11特異性表達在其木質(zhì)部組織[8]；過表達桉樹FLA導致轉(zhuǎn)基因植株細胞壁糖含量中木糖和果糖比例發(fā)生變化[9]。然而，樹木FLA基因敲除的表型，卻是值得關(guān)注或探究的。

樹木遺傳雜合度高、多伴進行異交，傳統(tǒng)的基因突變方法或策略很難應(yīng)用于林木，導致無林木純合突變體應(yīng)用于其基因功能鑒定。Cas9/gRNA基因組定點編輯技術(shù)，通過單鏈導向RNA(single guide RNA,gRNA)來識別目標DNA序列，引導核酸酶Cas9剪切目標DNA雙鏈、產(chǎn)生核酸編輯[10]，這一技術(shù)恰好避開了傳統(tǒng)方法制作林木純合突變體所遇的障礙。目前，Cas9/gRNA已經(jīng)應(yīng)用于擬南芥、大豆、煙草、玉米等植物基因組編輯[11～14]，然而模式木本植物—毛果楊中該技術(shù)應(yīng)用還未見報道。

本研究中我們通過生物信息學方法識別毛果楊PtrFLA基因家族，進化樹分析表明PtrFLA31和PtrFLA34屬于FLA的A亞族，且共同位列在進化樹的一個小分支上。基于Cas9/gRNA技術(shù)，我們制備出PtrFLA31/34雙基因突變體材料，為進一步鑒定該基因功能奠定前提。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

溫室里栽培的3個月的毛果楊(Populustrichocarpa)幼樹用于基因表達分析，1個月的無菌組培幼苗用于遺傳轉(zhuǎn)化實驗。

植物總RNA提取試劑pBIOZOL Reagent(Bioflux)，植物基因組DNA快速提取試劑(Bioteke)，cDNA合成用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA eraser(Takara)，高保真DNA聚合酶為KOD-Plus(Toyobo),膠內(nèi)DNA采用Silica Bead DNA Gel Extrction Kit(Thermo Scientific)回收。質(zhì)粒采用E.A.N.A Plasmid Mini Kit(Omega)提取，基因引物合成以及DNA測序由Invitrogen公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 毛果楊PtrFLAs家族成員識別

分別以21個擬南芥FLA家族成員氨基酸序列，在毛果楊基因組數(shù)據(jù)庫Phytozome 12.0中進行同源性檢索，并結(jié)合fasciclin和fasciclin-like關(guān)鍵詞檢索，去除重復(fù)基因后對所有潛在的FLA成員用SMART[15]確認存在fasciclin結(jié)構(gòu)域(SM00554)。對識別出的FLA家族成員，用SignalP 4.1[16]預(yù)測成員N端是否有信號肽，手動分析AGP-like糖基化區(qū)域。用MEGA軟件構(gòu)建擬南芥和毛果楊FLA家族成員的進化樹。

1.2.2植物總RNA分離、總cDNA合成和基因組DNA提取

各個組織莖節(jié)的總RNA提取參照試劑盒提取步驟進行，植物總RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進一步合成cDNA，基因組DNA提取采用一步法提取。

1.2.3 植物靶基因編輯載體構(gòu)建

用高保真DNA聚合酶KOD-plus擴增PtrFLA31/34靶位點的gRNA片段，片段膠內(nèi)回收后在核酸內(nèi)切酶BsaⅠ和高濃度DNA連接酶作用下，連接到植物基因編輯載體pHSE401[17]。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，經(jīng)Kana抗性篩選后得到含pHSE401-gRNA重組質(zhì)粒菌液，DNA測序確認重組質(zhì)粒正確。提取質(zhì)粒后轉(zhuǎn)入GV3101農(nóng)桿菌，用于毛果楊遺傳轉(zhuǎn)化實驗。

1.2.4 毛果楊遺傳轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)基因植株鑒定

取25～35 d生長狀況良好的毛果楊作為遺傳轉(zhuǎn)化材料，采用農(nóng)桿菌介導法進行毛果楊轉(zhuǎn)基因[18]。取轉(zhuǎn)基因植株的少量葉片，提取基因組DNA后用作模板，用DT1-F0/DT2-R0和zCas-U/D引物進行PCR擴增鑒定轉(zhuǎn)入的gRNA和Cas9基因。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)靶基因位點編輯鑒定

取轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA作模板，以FLA31-U/D及FLA34-U/D引物，進行覆蓋靶位點片段的PCR擴增。片段從膠內(nèi)回收后連接到pMD18-T載體，將連接產(chǎn)物取3 μL轉(zhuǎn)入DH5α大腸桿菌，氨芐抗性篩選獲得陽性菌液進行插入DNA的測序。與野生型比對測序結(jié)果，統(tǒng)計靶基因位點編輯情況，所用引物及序列(表1)。

表1 所用引物及序列

表2 毛果楊FLA家族成員

圖1 毛果楊和擬南芥FLA基因進化分析Fig.1 Phylogenetic analysis of FLAs from Arabidopsis thaliana and P.trichocarpa

2 結(jié)果與分析

2.1 楊樹FLA家族識別

用生物信息學方法我們從毛果楊基因組上鑒定出46個FLA家族成員(表2)，命名為PtrFLA1到PtrFLA46。在這46個PtrFLA家族成員中，其推測氨基酸長度從214到466個。39個PtrFLA成員預(yù)測有信號肽，38個成員有1個Fas結(jié)構(gòu)域，8個成員有2個Fas結(jié)構(gòu)域。

為了分析PtrFLA家族成員的同源關(guān)系，構(gòu)建了21個擬南芥AtFLA和46個毛果楊PtrFLA進化樹(圖1)。進化樹表明毛果楊FLA家族成員分處在4個亞類上(A、B、C和D)，其中A亞類包含了毛果楊FLA家族的大多數(shù)成員(27個)，比另外3個亞類(分別為6、6、7個)的總數(shù)還多。此外，擬南芥A亞類FLA卻只有6個成員，暗示這些基因可能參與木本植物高度發(fā)達的次生生長相關(guān)。

2.2 PtrFLA31和PtrFLA34基因組織轉(zhuǎn)錄表達

提取野生型毛果楊木質(zhì)部、韌皮部、根、頂芽、葉柄、幼葉、老葉以及第1至10莖節(jié)的總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成了總cDNA。在用Actin2內(nèi)標基因?qū)Ω鹘M織總cDNA定量后，PtrFLA31和PtrFLA34基因半定量RT-PCR結(jié)果表明，PtrFLA31和PtrFLA34均在木質(zhì)部高豐度轉(zhuǎn)錄表達，在韌皮部也有一定量的表達水平，而根、頂芽、葉柄、幼葉和老葉內(nèi)幾乎不表達(圖2)。此外，第1、2莖節(jié)中PtrFLA31和PtrFLA34轉(zhuǎn)錄量極低，從第3至6節(jié)轉(zhuǎn)錄量表達逐漸增加，第7至10節(jié)維持在較高的表達水平(圖2)。

圖2 PtrFLA31和PtrFLA34的組織表達分析 1～10. 第1～10莖間Fig.2 Analysis of PtrFLA31 and PtrFLA34 gene expression in Populus 1-10. Internodes 1-10

2.3 PtrFLA3/34基因Cas9/gRNA載體構(gòu)建

PtrFLA31和PtrFLA34在進化樹的一個小分支，且兩者氨基酸序列一致性達86.9%，顯示這兩個基因功能可能存在冗余。為了鑒定其敲除的功能，我們采用Cas9/gRNA編輯技術(shù)敲除PtrFLA31/34基因。先設(shè)計2個PtrFLA31/34基因特異靶位點的gRNA(圖3a)，T1-PtrFLA31/34(gRNA)針對PtrFLA31/34基因，而T1-PtrFLA34(gRNA)僅針對PtrFLA34。經(jīng)PCR擴增出含這2個gRNA的片段，在酶切后連接到植物基因編輯載體pHSE401(圖3b)。將構(gòu)建的pHSE401-PtrFLA31/34(gRNA)載體進行DNA測序，確認Cas9/gRNA載體構(gòu)建成功。

圖3 pHSE401-PtrFLA31/34(gRNA)載體構(gòu)建 a.靶點位置及序列；b.CRISPR/Cas9植物基因編輯載體Fig.3 Construction of pHSE401-PtrFLA31/34(gRNA)a. Position and sequence of target site； b. Physical map of CRISPR/Cas9 vectors

2.4 pHSE401-PtrFLA3/34(gRNA)轉(zhuǎn)基因楊樹及分子鑒定

選擇生長至一個月的無菌組培幼苗(圖4a①)，切取第2至4莖節(jié)成1 cm莖段，農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化后莖段暗室培養(yǎng)48 h(圖4a②)，脫菌清洗后放入選擇培養(yǎng)基(圖4a③)，培養(yǎng)30 d后愈傷組織分化出抗性芽(圖4a④)，轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)(圖4a⑤)，等抗性芽長至3～5 cm盆栽到土壤中(圖4a⑥)。實驗得到3棵轉(zhuǎn)基因植株(L1、L2和L3)，分別提取這三棵轉(zhuǎn)基因植株基因組DNA，PCR擴增Cas9和gRNA這2個目標基因，結(jié)果表明該基因已經(jīng)轉(zhuǎn)入到毛果楊基因組上(圖4b)。

圖4 轉(zhuǎn)pHSE401-PtrFLA31/34(gRNA)基因楊樹制備及分子鑒定 a.楊樹轉(zhuǎn)基因過程簡圖：①毛果楊無菌組培幼苗；②轉(zhuǎn)化后48 h共培養(yǎng)莖段；③轉(zhuǎn)化后篩選培養(yǎng)基的莖段；④長出轉(zhuǎn)基因抗性芽的莖段(箭頭所示)；⑤抗性植株的生根；⑥轉(zhuǎn)基因植株盆栽 b.轉(zhuǎn)基因植株分子鑒定Fig.4 Transformation of pHSE401-PtrFLA31/34(gRNA) in Populus and its molecular determination a. Transgenic process of pHSE401-PtrFLA31/34(gRNA) in Populus: ①Young plantlets of tissue culture; ②Cocultured stem segments after transformation; ③The stem segments in selective medium; ④Hygromycin-resistant shoots(arrows); ⑤Hygromycin-resistant plants on rooting medium; ⑥Transgenic plants on soil b.Molecular determination of transgenic plants

圖5 PtrFLA31/34基因編輯分析 a.PtrFLA31和PtrFLA34的編輯情況；b.PtrFLA31和PtrFLA34基因編輯后推測氨基酸Fig.5 Analysis of PtrFLA31/34 gene editing in transgenic Populus a. PtrFLA31 and PtrFLA34 gene editing identified from the cloned PCR fragments; b. The presumed amino acids of PtrFLA31 and PtrFLA34 after editing

2.5 PtrFLA31/34基因靶位點編輯分析

PtrFLA31/34基因位點編輯結(jié)果如圖5a所示，對于T1-PtrFLA31/34(gRNA)，L1和L3轉(zhuǎn)基因植株P(guān)trFLA31基因靶位點被編輯、減少1個T堿基，L2中PtrFLA31靶位點減少2個T堿基。PtrFLA34靶位點在L1和L2中也被編輯減少1個T堿基，而L3中PtrFLA34呈現(xiàn)雙等位編輯，分別增加和減少1個T。對于T2-PtrFLA34(gRNA)，L1和L2植株體內(nèi)PtrFLA34靶位點分別被減少199和20個堿基，而L3植株體內(nèi)PtrFLA34靶位點未被編輯。分析PtrFLA31/34基因兩個靶位點編輯后的序列，推測其氨基酸結(jié)果如圖5b所示，因移碼而產(chǎn)生目標基因編碼的終止子提前出現(xiàn)，導致了L1、L2和L3體內(nèi)PtrFLA31和PtrFLA34均被敲除，形成了fla31/34雙基因突變體。

3 討論

隨著植物基因組資源增多，多個植物FLA基因家族被識別報道，如：擬南芥、水稻和棉花分別有21、24和19個FLA基因[2,19～20]。我們從毛果楊中識別出46個PtrFLA基因(表1)，基因數(shù)量明顯比已報道的草本植物FLA的多，這暗示林木FLA基因家族產(chǎn)生了顯著擴張。FLA是植物細胞壁的成分蛋白，這種基因數(shù)量的擴張很可能是滿足樹木從草本進化成木本植物的需要，因為樹木進化出高度發(fā)達的次生壁組織。我們進化樹分析進一步表明毛果楊FLA家族成員同樣分為4個亞類(圖1)，與草本植物FLA分類相同。然而，引人關(guān)注是PtrFLA家族A亞類包含27個基因，約占據(jù)其整個家族成員的一半，這種基因擴張可能與毛果楊某種生長性狀(例如發(fā)達的次生壁組織)密不可分。

FLA作為一種植物細胞壁蛋白參與植物細胞伸長、感應(yīng)外界環(huán)境因子信號等，而AtFLA11和AtFLA12已被報道與植物次生壁形成相關(guān)[7]。在本研究中我們通過基因轉(zhuǎn)錄表達分析確定，PtrFLA31和PtrFLA34主要在毛果楊次生生長發(fā)達的組織內(nèi)高豐度表達，如莖節(jié)和木質(zhì)部(圖2)，這個結(jié)果提示此亞類FLA成員很可能參與楊樹木材的生長和發(fā)育。有一個研究報道，在桉樹FLA家族中A亞類的3個成員EniFLA1/2/3也在木質(zhì)部高豐度表達[6]。然而，PtrFLA31和PtrFLA34在木材形成上的功能，需要利用其突變體來準確鑒定。

Cas9/gRNA植物基因組編輯技術(shù)已應(yīng)用在多個植物物種，包括：擬南芥、大豆、煙草、玉米等[11～14]，對林木物種來說，非常適合應(yīng)用Cas9/gRNA基因編輯技術(shù)幫助鑒定其基因功能和輔助分子育種，然而這方面的研究報道甚少。本研究中我們創(chuàng)建模式樹毛果楊的Cas9/gRNA基因編輯技術(shù)體系，嘗試并實現(xiàn)了對毛果楊PtrFLA31和PtrFLA34雙基因同時編輯(圖5)。編輯后的PtrFLA31和PtrFLA34基因序列產(chǎn)生終止子提前，形成這兩基因被敲除的雙突變體。Cas9/gRNA技術(shù)在毛果楊中被有效的建立，解決了用傳統(tǒng)方法幾乎很難制作林木基因突變體的困境，這個技術(shù)將加速林木功能基因組鑒定的進展。此外，我們獲得的3株毛果楊fla31/34敲除突變體，為下一步深入研究PtrFLA31和PtrFLA34基因功能提供了遺傳材料。