李效文，姚日生，閔磊磊，李鳳和

（1.合肥工業(yè)大學(xué)，安徽 合肥230009；2.安徽安生生物化工科技有限公司，安徽合肥230002）

替米考星（Tilmicosin）是新一代大環(huán)內(nèi)酯類畜禽專用抗生素，具有抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)、耐藥性低、與其他類別的抗生素?zé)o交叉耐藥性等特點(diǎn)，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌和革蘭氏陰性細(xì)菌以及霉形體、螺旋體等均有抑制作用，被廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療動(dòng)物的呼吸道疾病[1]。但是替米考星味道極苦，動(dòng)物使用該藥時(shí)的依從性差，采藥量不均衡，甚至拒絕采食混飼投藥的含藥飼料[2]。目前掩味技術(shù)主要有：①添加矯味劑；②添加麻痹劑提高苦味閾值；③制備包合物；④制備微囊或微球；⑤包衣等。但前四種方法各具有一些缺陷如：添加矯味劑的掩味效果不理想，增加制劑成本；添加麻痹劑不僅麻痹了對(duì)苦味的感受，同時(shí)也麻痹了對(duì)其他味覺(jué)的感受；制備包合物對(duì)藥物分子量有特定要求，且包合物的載藥量較低，只適合低劑量藥物，還可能會(huì)存在輔料用量過(guò)大而增大服用量占用飼料配比空間；制備微囊或微球需要使用到溶劑，輔料用量較大，可能會(huì)影響藥物溶出，制備成本高及制備工藝復(fù)雜[3]。故利用包衣技術(shù)進(jìn)行掩味處理具有較好的普適性、較低的生產(chǎn)成本、簡(jiǎn)便的操作工藝，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

因此，開發(fā)研究新型的包衣替米考星很有必要。為此，本試驗(yàn)以考查包衣替米考星為目標(biāo)開展掩味性研究。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

①使用三種不同的包衣材料E100（甲基丙烯酸甲酯（MMA）、甲基丙烯酸丁酯（BMA）、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯（DMAEMA）按1∶1∶2比例溶液聚合而成）；E30DⅠ（MMA、BMA、DMAEMA按 1∶1∶2乳液聚合而成）；E30DⅡ（MMA、BMA、DMAEMA按 1∶1∶2經(jīng)溶液-乳液聚合而成），并設(shè)計(jì)不同增重包衣（5%、10%、15%、20%）。不同包衣材料進(jìn)行包裹自制替米考星顆粒（20%，30～40目）。包衣后用電鏡掃描考查包衣顆粒的微觀形態(tài)、包衣膜嚴(yán)密性、是否均勻連續(xù)、有無(wú)裂痕等；②進(jìn)行包衣替米考星在口腔唾液環(huán)境中的溶出試驗(yàn)考查。考查在口腔環(huán)境中是否有替米考星溶出。如果包衣效果不好，替米考星在口腔環(huán)境溶出或滲出，相當(dāng)于與舌苔直接接觸，造成實(shí)際苦味，從而達(dá)不到遮掩苦味效果；③進(jìn)行包衣替米考星在胃液環(huán)境中的溶出試驗(yàn)考查。探究掩味包衣后包衣膜是否會(huì)影響替米考星顆粒溶出。

1.2 主要原料及儀器

替米考星（99.9%，新科信動(dòng)物藥業(yè)有限公司）；淀粉（藥用級(jí)，悅康藥業(yè)集團(tuán)安徽天然制藥有限公司）；糊精（藥用級(jí)，悅康藥業(yè)集團(tuán)安徽天然制藥有限公司）；羥丙甲基纖維素（藥用級(jí)，悅康藥業(yè)集團(tuán)安徽天然制藥有限公司）；微晶纖維素（藥用級(jí)，悅康藥業(yè)集團(tuán)安徽天然制藥有限公司）；乳糖（食品級(jí)，悅康藥業(yè)集團(tuán)安徽天然制藥有限公司）；E100（藥用級(jí)，悅康藥業(yè)集團(tuán)安徽天然制藥有限公司）；E30DⅠ（藥用級(jí)，安徽安生生物化工科技有限公司）；E30DⅡ（藥用級(jí)，安徽安生生物化工科技有限公司）。

ZRC-6ST智能溶出度測(cè)定儀（天津創(chuàng)興電子設(shè)備制造有限公司）；LC20A高效液相色譜儀（Shimadzu）；SPD-20A檢測(cè)器（Shimadzu）；GL-ODS3色譜柱（Shimadzu）；FLP-3流化床（常州佳發(fā)制粒干燥設(shè)備有限公司）；QZL550球形拋丸機(jī)（常州佳發(fā)制粒干燥設(shè)備有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)操作

1.3.1 包衣操作

配制包衣液：①E100乙醇溶液配制：取E100樹脂200 g用95%乙醇1 800 g將其溶解；②E30DⅠ包衣液配制：取滑石粉6 g溶于400 g純化水中，待分散均勻后緩緩倒入667 g E30DⅠ（固含量30%）乳液中攪拌30 min后用40目篩網(wǎng)濾過(guò)即得；③E30DⅡ包衣液配制：取滑石粉6 g溶于600 g純化水中，待分散均勻后緩緩倒入667 gE30D（固含量30%）乳液中攪拌30 min后用40目篩網(wǎng)濾過(guò)即得。

采用流化床底噴操作，按設(shè)備要求接好各管路，調(diào)節(jié)噴槍噴霧角度約30°。向料斗中倒入自制替米考星顆粒1 kg。密封設(shè)備開啟引風(fēng)機(jī)，調(diào)節(jié)風(fēng)機(jī)頻率至替米考星顆粒在料斗中呈現(xiàn)均勻沸騰狀為宜（本設(shè)備風(fēng)機(jī)頻率為22 Hz），開啟加熱待進(jìn)風(fēng)溫度達(dá)到50℃，出風(fēng)溫度達(dá)到25℃時(shí)，同時(shí)開啟噴液及清灰功能。包衣過(guò)程中定時(shí)從取樣口取樣觀察顆粒狀態(tài)，若顆粒較濕，有粘連現(xiàn)象，則調(diào)小包衣液流速；反之，若顆粒干燥，且溫度較高，應(yīng)調(diào)大包衣液流速。保持包衣過(guò)程處于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。當(dāng)包衣增重達(dá)到要求時(shí)，從取樣口取樣分析。

1.3.2 掩味效果測(cè)試操作

隨著掩味技術(shù)的發(fā)展，與掩味相關(guān)的評(píng)價(jià)技術(shù)也取得了巨大進(jìn)展，目前國(guó)內(nèi)外藥學(xué)中的苦味評(píng)價(jià)方法有四種：人群口感實(shí)驗(yàn)、電子舌檢測(cè)法、溶出試驗(yàn)法、電生理法，其中人群口感實(shí)驗(yàn)較傳統(tǒng)，但也是最能直接表征掩味效果好壞的方法，溶出試驗(yàn)法利用溶出儀和液相色譜定量分析在特定溶出介質(zhì)中溶出的微量藥物，結(jié)果較精確[4]。

本次包衣替米考星的苦味掩味性研究采用人群口感實(shí)驗(yàn)-溶出試驗(yàn)結(jié)合的方法來(lái)評(píng)價(jià)，以達(dá)到實(shí)驗(yàn)結(jié)果既有直觀表現(xiàn)又有定量數(shù)據(jù)表征的效果。

由于《中國(guó)獸藥典》中沒(méi)有包衣替米考星顆粒劑型的檢測(cè)方法，故參考《中國(guó)藥典》中溶出度與釋放度測(cè)定法，使用智能溶出度測(cè)定儀進(jìn)行溶出實(shí)驗(yàn)，采用槳法操作，一般豬的正常體溫在38.5℃～39.3℃之間，故控制溶出介質(zhì)溫度為39℃±0.5℃。胃液中溶出實(shí)驗(yàn)為在溶出介質(zhì)為人工胃液（取稀鹽酸16.4 mL，加水800 mL與胃蛋白酶10 g，搖勻后加水稀釋至1000 mL即得）設(shè)計(jì)分別在10 min、20 min、30 min、1 h時(shí)取樣檢測(cè)，攪拌轉(zhuǎn)速100 r/min。唾液中的溶出實(shí)驗(yàn)為在溶出介質(zhì)為人工唾液（自制仿Glandosane），考慮到藥物在口腔中滯留時(shí)間有限且最多不會(huì)超過(guò)10 min，故設(shè)計(jì)在30 s、5 min、10 min時(shí)分別取樣檢測(cè)，鑒于口腔中有咀嚼翻轉(zhuǎn)，機(jī)械擾動(dòng)強(qiáng)度較大，故將攪拌轉(zhuǎn)速提高至150r/min。每次取樣后應(yīng)及時(shí)補(bǔ)充相當(dāng)量的溶出介質(zhì)，自取樣至微孔濾膜，過(guò)濾在30 s內(nèi)完成，取濾液通過(guò)高效液相色譜檢測(cè)。

口嘗評(píng)價(jià)課題組對(duì)招募的志愿者進(jìn)行了包括苦味敏感度等在內(nèi)的嚴(yán)格篩選，最終選擇12名健康志愿者（男8名、女4名、35歲以下10名、35以上2名）作為受試者，在試驗(yàn)前簽訂知情同意書。先對(duì)空白顆粒進(jìn)行測(cè)試，分別取1 g空白顆粒由志愿者含于口中，計(jì)時(shí)30 s，此間口腔做漱口動(dòng)作，以使舌根及舌測(cè)的苦味感受區(qū)能夠感受藥物苦味，并被告知該顆粒的苦度分級(jí)和具體苦度值，吐出，漱口5次，至口腔內(nèi)感覺(jué)無(wú)苦味后20 min再繼續(xù)測(cè)定。并依照下述“藥物苦味描述表”，根據(jù)同一級(jí)別內(nèi)各顆粒的相對(duì)苦度大小，在該級(jí)別的苦度值允許取值范圍內(nèi)，給所嘗樣品賦予一個(gè)具體的苦度值[5];之后漱口5次，至口腔內(nèi)感覺(jué)無(wú)苦味后20 min再繼續(xù)測(cè)定。此外，實(shí)驗(yàn)中受試人員對(duì)樣品測(cè)試時(shí)，均采用高包衣增重向低包衣增重、單盲的方法對(duì)樣品進(jìn)行逐步測(cè)試。且由于人群口感實(shí)驗(yàn)主觀性較強(qiáng)，個(gè)體味覺(jué)敏感性差異較大，故為保證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性，不對(duì)實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)值做檢驗(yàn)和剔除[6]，結(jié)果見(jiàn)表 1。

表1 掩味效果測(cè)試結(jié)果

1.3.3 液相定位及標(biāo)準(zhǔn)曲線

替米考星標(biāo)品定位，取2.04 mg/mL替米考星標(biāo)品溶液經(jīng)高效液相色譜檢測(cè)，出峰在11.09 min。高效液相色譜法色譜條件：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（島津ODS-3）；以水-磷酸二丁胺溶液〔取二丁胺16.8 mL,加磷酸溶液（1→10）70 mL,邊加邊攪拌，放冷后用磷酸調(diào)節(jié) pH 值至 2.5±0.1，加水至 100 mL〕（975∶25）為流動(dòng)相A，以乙腈為流動(dòng)相B；按表2進(jìn)行梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm；流速為1.0 mL/min，柱溫30℃[7]。

表2 替米考星液相定位梯度洗脫條件

標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：將替米考星對(duì)照品用磷酸溶液（取水900 mL,加磷酸5.71 g,用12.5 mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至2.5±0.1，加水至1 000 mL）配成約0.4、0.6、1.2、1.8、2.4 mg/mL，上述溶液各進(jìn)樣 10μL，以濃度mg/mL為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作圖，求回歸方程。結(jié)果表明，在0.4～2.4 mg/mL范圍內(nèi)，替米考星濃度與其峰面積線性相關(guān)，線性回歸方程為Y=-292 803.404 62+7.295 4E6X,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 6。

圖1 替米考星液相定位圖

圖2 替米考星液相標(biāo)準(zhǔn)曲線

2 結(jié)果與討論

2.1 溶出實(shí)驗(yàn)分析

圖3 空白替米考星顆粒在人工唾液及胃液中的溶出效果

從圖3可以看出，當(dāng)替米考星顆粒未經(jīng)包衣時(shí)，在唾液中0.5 min可溶出35.4%，在10 min內(nèi)可幾乎全部溶出，達(dá)到96.9%，且溶出速度較均勻。這說(shuō)明自制的空白替米考星顆粒有效物質(zhì)在顆粒中分布較均勻，顆粒致密度較高，且在唾液中較易崩解和溶出，若不經(jīng)包衣處理直接入口苦味明顯。而其在胃液中2 min溶出28.8%，10 min可達(dá)到99.9%，溶出完全，這說(shuō)明自制替米考星顆粒含量及在胃液中的崩解溶出均無(wú)異常，可作為進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)研究的原材料。

圖4 三種包衣材料包衣的替米考星顆粒在不同包衣增重下在唾液中的溶出效果

從圖4可以看出，當(dāng)包衣增重均為5%時(shí)E30D與E30DⅡ包衣的替米考星顆粒在唾液中0.5 min溶出分別為28.6%和23%，相比于E100乙醇溶液包衣的替米考星顆粒0.5 min溶出為12.9%，包覆效果較差。而當(dāng)包衣增重不斷增大，分別達(dá)到10%、15%、20%時(shí)，三種包衣材料包覆的替米考星顆粒在唾液中的溶出均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。當(dāng)包衣增重在15%時(shí)，用E30DⅡ包覆的替米考星顆粒唾液中0.5 min溶出7%，10 min溶出18.7%，與用E100包衣的顆粒在唾液中的溶出效果相差無(wú)幾。而當(dāng)包衣增重達(dá)到20%時(shí)，E30DⅠ與E30DⅡ包覆的替米考星顆粒唾液0.5 min溶出分別為0.2%和0.05%，10 min時(shí)溶出量為5.1%和2.3%，包覆掩味效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于使用E100包衣的顆粒。

圖5 樹脂有機(jī)溶劑包衣和水分散體包衣原理圖

出現(xiàn)這種現(xiàn)象主要是由于有機(jī)溶劑包衣原理和水分散體體系包衣原理不同。如圖5所示，有機(jī)溶劑包衣體系是將固體樹脂溶解于有機(jī)溶劑中，聚合物鏈充分舒展，包衣時(shí)可均勻附著于顆粒表面，通過(guò)溶劑蒸發(fā)引起聚合物濃度不斷增大，聚合物鏈之間相互纏繞，高分子溶液從溶膠變?yōu)槟z直至最終形成膜。水分散體包衣體系中聚合物是以10 nm～1μm的固態(tài)或半固態(tài)類球狀粒子分散于水中所形成的體系，通過(guò)噴涂水分散體，聚合物粒子在顆粒表面不斷堆積。與此同時(shí)，由于水分的蒸發(fā)及水和聚合物之間的界面張力，膠體顆粒相互接觸融合，形成緊密排列的結(jié)構(gòu)，最后在毛細(xì)管作用力下，各聚合物粒子相互結(jié)合形成致密的膜[8]。但是當(dāng)包衣增重較低時(shí)，聚合物顆粒總量不足以均勻覆蓋顆粒表面，也就無(wú)法借助毛細(xì)管作用相互融合形成完整的衣膜，導(dǎo)致包覆的藥物會(huì)從未包覆處滲出，造成突釋。當(dāng)包衣增重增加到某一臨界值時(shí)，聚合物顆粒可在毛細(xì)管作用下迅速接觸融合擠出空隙中的氣體，形成一層致密的、較厚的包衣膜。而有機(jī)溶劑包衣體系中聚合物鏈充分舒展，在包衣時(shí)可均勻附著于顆粒表面，在包衣增重較低時(shí)也可形成連續(xù)的包衣膜，只是膜厚度較薄，隨著包衣增重不斷提高，膜厚度也不斷增加。但是常用于溶解E100的有機(jī)溶劑的表面張力遠(yuǎn)小于水，且包衣時(shí)蒸發(fā)速度較快，故形成的包衣膜致密性相較于水分散體包衣膜較差。綜上所述，導(dǎo)致在包衣增重較低時(shí)，有機(jī)溶劑包衣體系的掩味效果優(yōu)于水分散體包衣體系，而當(dāng)包衣增重較高時(shí)，水分散體的包衣掩味效果較好。

通過(guò)對(duì)三種材料包衣后的替米考星顆粒（增重20%）在人工胃液中的溶出考查，發(fā)現(xiàn)使用E30DⅠ包衣的顆粒溶出較快，10 min就已完全溶出，而使用E100乙醇溶液包衣的顆粒和使用E30DⅡ包衣的顆粒溶出效果相似，均在25 min左右溶出完全。這可能是由于使用E30DⅠ包衣的顆粒實(shí)際包封效果較差，水分易通過(guò)包衣膜上的裂隙進(jìn)入顆粒內(nèi)部，加速顆粒的崩解溶出。而E30DⅡ與E100包封效果相似，在胃液中的溶出經(jīng)過(guò)兩個(gè)過(guò)程：①包衣膜在胃液中的自我溶解；②胃液進(jìn)入顆粒內(nèi)部引發(fā)顆粒崩解溶出，所以溶出時(shí)間較長(zhǎng)。但總體來(lái)說(shuō)，使用E30DⅡ包衣的顆粒與使用E100的包衣效果不管是在唾液中還是在胃液中溶出效果相近，說(shuō)明E30DⅡ水分散體包衣后掩味效果極佳，且不影響藥物在胃中的釋放。

圖6 三種包衣材料包衣的替米考星顆粒（包衣增重20%）在胃液中的溶出效果

2.2 人群口感實(shí)驗(yàn)分析

圖7 替米考星顆?？趪L苦度值及其分布圖

圖7中1號(hào)樣品為未包衣顆粒，2～5號(hào)樣品為E100包衣的顆粒，增重分別為 5%、10%、15%、20%；6～9號(hào)樣品為E30DⅠ包衣的顆粒增重分別為5%、10%、15%、20%；10～13號(hào)樣品為E30DⅡ包衣的顆粒增重分別為5%、10%、15%、20%。圖中心點(diǎn)為人群打分的平均數(shù)，誤差線為標(biāo)準(zhǔn)差。

從圖中可以看出，未包衣的替米考星顆粒苦味較重，屬于Ⅴ等級(jí)（不能忍受的苦味），而經(jīng)過(guò)三種包衣材料包衣處理后顆粒的口感苦味等級(jí)隨包衣增重的增加均呈下降趨勢(shì)。其中用E100包衣增重達(dá)到20%時(shí)人群對(duì)該組顆粒打分均數(shù)為1.0且集中在Ⅰ等級(jí)，說(shuō)明該組顆粒掩味效果較好，在口腔中30 s內(nèi)基本不會(huì)嘗出苦味。而使用E30DⅠ包衣的顆粒在增重20%時(shí)人群對(duì)該組顆粒打分均數(shù)為1.7，且分布介于Ⅰ、Ⅱ等級(jí)之間，說(shuō)明此組顆粒包衣效果較差，對(duì)苦味相對(duì)不敏感的人群可能覺(jué)得苦味可以接受，但對(duì)于苦味較敏感的人群就難以接受。對(duì)于使用E30DⅡ包衣的顆粒，當(dāng)包衣的顆粒在增重20%時(shí)，人群對(duì)該組顆粒打分均數(shù)為0.8，且分布較為集中，相較于使用E100包衣的顆粒掩味效果更好，這與溶出試驗(yàn)得到的結(jié)果相一致。

2.3 掩味包衣替米考星顆粒掃描電鏡分析

圖8 替米考星顆粒掃描電鏡圖

為驗(yàn)證以上論述，對(duì)包衣的替米考星顆粒進(jìn)行了掃描電鏡分析，對(duì)比圖 8 中（a）（c）（e）三圖可知，當(dāng)包衣增重在5%時(shí)，E30D包衣的顆粒表面形成了斑點(diǎn)狀的包衣膜，突起及凹陷處均未被覆蓋，而E30DⅡ包衣的顆粒情況稍好，表面已形成了局部的連續(xù)包衣膜，但突起部分和較深的凹陷處仍未被包覆，這便導(dǎo)致了在溶出實(shí)驗(yàn)中藥物突釋。反觀E100乙醇溶液包衣的替米考星顆粒，在5%包衣增重下已形成了一層較薄但比較連續(xù)的包衣膜，各突起及凹陷部分都已被覆蓋。這也解釋了在低包衣增重條件下乙醇溶液包衣顆粒的掩味效果比水分散體包衣的顆粒好的原因。對(duì)比圖 8（b）（d）（f）三圖可知，當(dāng)包衣增重達(dá)到20%時(shí)，E30D包衣的顆粒表面已形成一層均勻的膜，僅有少數(shù)大小不一的孔分布其上，但孔底部均已被膜覆蓋；而E30DⅡ與E100包衣的顆粒表面都形成了一層致密均勻的膜，突起及凹陷都被很好地覆蓋，也未發(fā)現(xiàn)有孔洞出現(xiàn)，但可以明顯看出E30DⅡ包衣膜致密性更好，這也是E30DⅡ包衣的替米考星顆粒掩味效果最好的原因。

3 結(jié)論

通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明，用E100乙醇溶液包衣的30～40目替米考星顆粒在低包衣增重時(shí)效果好于用水分散體包衣，當(dāng)包衣增重大于15%時(shí)，水分散體（E30D、E30DⅡ）包衣的替米考星包衣膜趨于完整致密，掩味性較強(qiáng)，且不影響藥物在胃中溶出，這說(shuō)明水分散體不僅具有低毒、環(huán)保、安全的優(yōu)勢(shì)，在使用性能上也完全可以替代樹脂有機(jī)溶劑體系包衣，在獸用乃至人用制劑掩味防潮方面有較好的應(yīng)用前景。