戚 鑫，陳曉明，2*，肖詩琦，張祥輝，田 甲，勾佳磊，卓馳夫，羅學剛

（1.西南科技大學生命科學與工程學院，四川 綿陽 621010；2.西南科技大學國防重點實驗室，四川 綿陽 621010）

隨著全球經(jīng)濟的迅速發(fā)展，特別是在礦石的開發(fā)、冶煉、加工、運輸?shù)冗^程中，會產(chǎn)生大量含重金屬的廢棄物，從而造成土壤和水源的嚴重污染，且重金屬可以通過食物鏈富集在人類體內(nèi)，危害人類健康[1-2]。現(xiàn)今土壤重金屬污染治理主要包括物理、化學、生物三類方法。微生物被應用于土壤重金屬污染的治理，是利用某些微生物的活性，對重金屬污染物進行吸附、吸收、溶解、沉淀、轉(zhuǎn)化等，以達到降低重金屬污染物含量或其生物活性的目的[3-4]。

固定化微生物修復是微生物修復的一種，是利用物理或化學方法，使游離微生物固定在一個區(qū)域并保持高度富集和活性，來滿足應用的生物技術[5]。相比游離微生物，固定化微生物具有富集濃度高、活性較高、生物穩(wěn)定性較好、環(huán)境的耐受性較強、可以長時間保存且重復使用等優(yōu)勢[6-7]。固定化微生物技術在土壤中主要應用于石油等有機污染中[8]，但在重金屬污染土壤治理中的應用研究相對較少。載體的選擇對固定化微生物技術尤為重要，生物炭是具有高度多孔性和較高比表面積的碳質(zhì)材料，表面含有多種含氧官能團，主要的基團包括羧基、羰基、酚羥基、內(nèi)酯等[9]。這些性質(zhì)就使得生物炭本身具有良好的吸附性能，因此，理論上可以作為固定化載體應用于環(huán)境污染物控制方面的研究。

本研究采用實驗室前期研究的3株對鈾（U）具有高耐受性和高去除率的菌株進行菌種組合，篩選出對U、鎘（Cd）去除效果最好的組合。以玉米秸稈生物炭為載體，采用吸附固定和包埋固定兩種不同的方法制備固定化微生物，用于研究其對U、Cd污染土壤的修復效果。

1 材料與方法

1.1 供試菌種

選取本實驗室前期研究的3株對U具有高耐受性和高去除率的菌株枯草芽孢桿菌（革蘭氏陽性菌）、檸檬酸桿菌（革蘭氏陰性菌）和蠟樣芽胞桿菌（革蘭氏陽性菌），分別記為A、B、C。

1.2 供試土壤

土壤取自西南科技大學校園實驗田，挑揀出植物殘體及石子后，陰涼處風干并磨碎過1 mm篩。將一定量的 CdCl2與 UO2（CH3COO）2·H2O 溶解于去離子水溶液，噴灑到四分之一份供試土壤中，攪拌均勻，再將剩余四分之三份土壤放入且不斷攪拌使之充分混勻，置于20℃培養(yǎng)箱繼續(xù)老化一個月，待用。最終土壤中重金屬濃度、有機質(zhì)（OM）含量及陽離子交換量（CEC）見表1。

表1 供試土壤理化性質(zhì)及重金屬含量Table 1 Physical-chemical properties of the soil

1.3 實驗設計

1.3.1 生物炭的制備與表征

玉米秸稈粉碎后分別放入坩堝中，置于馬弗爐內(nèi)350℃缺氧炭化2 h，待馬弗爐溫度降至室溫后取出黑色殘渣，磨碎，過100目篩得到生物炭。用CHNS-O元素分析儀測定生物炭C、H、N、O元素的百分含量。1.3.2微生物對U、Cd的去除作用

本研究通過考察單個菌種與菌種組合（兩兩及三者等比混合）對U、Cd的吸附能力，篩選出對U、Cd同時具有高去除率的微生物或組合作為固定化材料。將3種菌分別接種到100 mL LB液體培養(yǎng)基中，在30℃、120 r·min-1條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期，離心收集菌體，將菌體A、B、C分別用0.85%的生理鹽水制成10 g·L-1的菌懸液，再兩兩及三者等比混合后制作成終濃度為10 g·L-1的微生物組合菌液，記為A-B、A-C、B-C、A-B-C。用0.85%的生理鹽水配制U、Cd濃度分別為30 mg·L-1和 3 mg·L-1的溶液，于250 mL錐形瓶中滅菌，吸取上述7種菌懸液2 mL分別加于各錐形瓶中，同時均設加2 mL無菌水的處理組為空白對照，所有處理組均設3個平行樣。各處理在30℃、125 r·min-1條件下培養(yǎng)2 d，離心20 min，用電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）測定各處理上清液中U、Cd濃度，計算微生物對U、Cd去除率。

式中：C為空白處理中U、Cd濃度；C0為微生物處理組中U、Cd濃度。

1.3.3 固定化微生物制備

選取1.3.2中U、Cd去除作用最好的微生物菌液用于制備固定化微生物。

（1）吸附固定：生物炭和菌懸液以 10∶100（m∶V）的比例分組混合于錐形瓶中，置于30℃、120 r·min-1振蕩器上振蕩24 h后過濾，用無菌水充分清洗后再經(jīng)過真空冷凍干燥得到復合鈍化劑。

（2）包埋固定：生物炭和菌懸液以10∶100（m∶V）的比例混合于錐形瓶中，置于30℃、120 r·min-1振蕩器上振蕩2 h，然后與配制的2%（m∶V）海藻酸鈉溶液等體積混合，充分攪拌均勻后用注射器逐滴加入到滅菌的200 mL 4%CaCl2溶液中，邊滴邊攪拌，形成固定化小球，小球保留在CaCl2溶液中硬化12 h，用無菌水充分清洗后真空冷凍干燥得到復合鈍化劑。

1.3.4 鈍化劑對U、Cd污染土壤的鈍化

供試土壤風干粉碎后過20目篩，稱取經(jīng)預處理的供試土壤于盆中，每盆200 g（以干質(zhì)量計）。設置4個處理，未添加鈍化劑的土壤作為對照（CK），另外3個處理中分別加入生物炭（C）、吸附固定微生物生物炭（X）和包埋固定微生物生物炭（G）。每個處理設置3個添加量，分別為土壤質(zhì)量的1%、2%、3%（均以干質(zhì)量計），充分混勻，并調(diào)節(jié)到土壤田間持水量的70%，同時每個處理設3個重復。在培養(yǎng)過程中，分別于第15、45、75 d采集樣品，測定土壤樣品可提取態(tài)U、Cd含量。

1.4 土壤可提取態(tài)重金屬測定

DTPA復合提取劑浸提：稱取1.967 g DTPA溶于15.6 mL三乙醇胺和少量水中，再將1.47 g CaCl2·2H2O溶于水，一并轉(zhuǎn)入1000 mL容量瓶中，加水至約950 mL，用6 mol·L-1HCl調(diào)節(jié)pH至7.30，最后用水定容。

浸提步驟：稱取25 g風干過20目篩的土樣放入150 mL硬質(zhì)玻璃三角瓶中，加入50 mL DTPA浸提劑，于室溫下往復振蕩，3000 r·min-1離心 60 min，再用ICP-MS測定上清液中U、Cd的含量。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 9.0、SPSS 22.0等軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理，文章所出現(xiàn)的圖表數(shù)據(jù)都是3次重復的平均值±標準差（SE），并采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和最小顯著差異法（LSD）比較不同數(shù)據(jù)的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物對U、Cd的去除作用

純種菌株及按一定比例組合后對U、Cd的去除作用如圖1所示。純種菌株A、B、C對U去除率分別為65.45%、61.34%、64.15%，菌種組合A-B、A-C、B-C對U去除率分別為57.18%、66.66%、62.12%，A-B-C組合對U的去除率最高，達到74.58%（p＜0.05）。該結(jié)果表明3株微生物組合對U的去除具有協(xié)同效應。B-C和A-B-C處理對Cd的去除率最高，分別為56.06%、55.31%。可見含B-C的組合對去除Cd具有協(xié)同作用。綜合以上結(jié)果，選取A-B-C對U、Cd同時具有高去除率的微生物組合作為固定化材料進一步研究。

圖1 U和Cd的去除率Figure 1 Removal percentages of U and Cd

2.2 生物炭的表征

生物炭的理化性質(zhì)及元素組成如表2所示。研究所用生物炭pH值為堿性，有研究表明，生物炭施加到土壤能夠提高土壤的pH、增加土壤表面活性位點，從而提高土壤對重金屬離子的吸附能力[10]。同時供試生物炭具有較高的OM含量與CEC，分別為55.9 g·kg-1和118.2 cmol·kg-1，因此理論上具有較高的改良土壤、提高土壤肥力和對重金屬離子的離子交換能力。元素組成分析是判斷物質(zhì)結(jié)構與性質(zhì)的最簡單的重要方法之一，高溫缺氧會改變秸稈原料的表面元素組成比例，提高產(chǎn)物生物炭對極性污染物的親和能力，例如生物炭表面可以與重金屬離子發(fā)生吸附作用[11-12]。

生物炭的掃描電鏡圖片見圖2。炭化后的生物炭骨架結(jié)構清晰，熱解作用使得生物質(zhì)內(nèi)部不穩(wěn)定、易揮發(fā)的結(jié)構消失，從而形成松散多孔的結(jié)構。圖2為各個角度下生物炭的結(jié)構，可以看出其具有表面凹陷的多孔顆粒狀結(jié)構，微孔密集地分布于炭層上，形成鏤空形態(tài)，而表面向內(nèi)凹陷形成塌陷的孔隙，又大大增加了生物炭的比表面積。生物質(zhì)炭具有多孔結(jié)構，在施入土壤后能夠增強透氣性，可為土壤中微生物提供生存繁殖的空間，促進養(yǎng)分轉(zhuǎn)化，并起到改良土壤物理結(jié)構的作用[12-13]。

表2 生物炭性質(zhì)及元素組成Table 2 Physical-chemical properties and elemental composition of biochar

圖2 生物炭的SEM圖Figure 2 SEM photography of biochar

圖3為生物炭的FTIR圖，確定了生物炭表面存在的官能團。3430 cm-1附近的峰型是由于-OH的伸縮振動引起，2920 cm-1處是脂肪性-CH2不對稱伸縮振動[14]，1570 cm-1和1437 cm-1處對應芳香環(huán)上的C=O伸縮振動[15]，1030 cm-1上的強吸收峰是由纖維素上的脂肪族醚類（C-O-C）和醇羥基（-OH）等含氧官能團的振動引起的[16]。876 cm-1和789 cm-1處的吸收峰為呋喃γ-CH以及吡喃β環(huán)等雜環(huán)化合物伸縮振動引起，這說明生物炭具有高度芳香化和雜環(huán)化結(jié)構[17]。上述表面官能團活性的存在是生物炭與重金屬離子之間發(fā)生吸附作用的原因。

2.3 鈍化劑對土壤中可提取態(tài)重金屬的影響

添加鈍化劑后各處理土壤的鈍化效果如圖4所示。在對照組中，隨著時間的延長土壤中可提取態(tài)的U、Cd含量無顯著變化。同時可以看出，對于重金屬Cd的提取，DTPA可提取出的重金屬濃度較高，約占土壤總Cd含量的73%。對于重金屬U的提取，DTPA可提取出的重金屬濃度較低，約占土壤總U含量的3%。

圖3 生物炭的FIIR圖譜Figure 3 FTIR spectrogram of biochar

各鈍化劑處理后，土壤中可提取態(tài)的U、Cd含量均有所下降，鈍化45 d時，各處理組可提取態(tài)重金屬的去除率已達顯著水平，其中X3組（添加3%吸咐固定微生物生物炭）達到了52%、37%。且隨著鈍化時間的延長，可提取態(tài)的U、Cd含量持續(xù)降低。土壤經(jīng)75 d鈍化處理后達到更好的鈍化效果，X3處理組鈍化效果最為顯著（p＜0.05），75 d處理后，土壤中可提取態(tài)的U、Cd含量分別下降了69%、56%。3種鈍化劑的鈍化效果呈現(xiàn)顯著差異，即X＞C＞G，添加量越大，鈍化效果越顯著，這一結(jié)果與很多文獻[18-19]一致。因此，在實際應用過程中，適當增加鈍化劑的施入量可能對于降低可提取態(tài)重金屬起到更好的作用，從而降低重金屬的生物有效性。此外，在本研究中，對于不同重金屬元素，同種鈍化劑處理存在差異，對U的修復效果優(yōu)于Cd。

2.4 鈍化劑對土壤性質(zhì)的影響

本研究還考察添加鈍化劑75 d后各處理土壤理化性質(zhì)變化，如表3所示。由于供試生物炭呈堿性，施加3種含生物炭的鈍化劑后提高了土壤的pH值，且隨著添加量的增加，pH呈上升趨勢。C和X處理組土壤中pH增加大于G處理組，這可能是由于經(jīng)海藻酸鈉包埋后載體生物炭與土壤接觸減小，導致其對土壤pH影響降低。高陽離子交換量有利于重金屬離子的固定，本研究中與對照組相比，經(jīng)過鈍化處理后的各組土壤陽離子交換量均有所升高，其中，C處理組對土壤陽離子交換量的提高效果最為顯著（p＜0.05）。同時可以看出，各鈍化劑處理后土壤總有機質(zhì)含量均有不同程度的升高，3個處理組相比，C、X處理組較G處理效果顯著。

表3 鈍化75 d后各處理土壤理化性質(zhì)的變化Table 3 Properties of soil with different treatments after 75 d

圖4 各鈍化處理對土壤可提取態(tài)U、Cd含量的影響Figure 4 Effects on extractable heavy metal concentrations by passivation treatments

3 討論

生物炭具有堿性、多孔、表面官能團豐富、高有機質(zhì)、高陽離子交換量等特性，故而施入重金屬污染土壤后能夠?qū)ν寥牢锢砘瘜W性質(zhì)產(chǎn)生影響[20]。本研究中，施加堿性含生物炭的鈍化劑后導致土壤pH值升高，所以處理后土壤呈弱堿性，有利于降低土壤重金屬離子的活性，降低其生物可利用性，但是天然土壤自身具有一定的緩沖能力，而又不會致土壤過堿而影響植物的生長，導致植株產(chǎn)量降低。高陽離子交換量有利于重金屬離子的固定[21]，本研究中與對照組相比，經(jīng)過鈍化處理后的各組土壤陽離子交換容量均有所升高，因此鈍化劑的施加引起的土壤陽離子交換量的變化可能是降低土壤中可提取態(tài)重金屬離子含量的原因之一。一般來說，有機質(zhì)含量的增加有利于改善土壤肥力，促進植物生長，同時有利于固定土壤重金屬元素[22]。本研究中各鈍化處理后土壤總有機質(zhì)含量也均有不同程度的升高，其中生物炭處理組和吸附固定微生物生物炭處理組有機質(zhì)增加較包埋固定微生物生物炭處理組效果顯著，這可能是由于生物炭經(jīng)海藻酸鈉包埋后難被釋放到土壤中形成有機質(zhì)。

重金屬在環(huán)境中的賦存形態(tài)決定了它的生物可利用性及其對生物的毒害性，即不同形態(tài)的重金屬其生物有效性不同。用不同提取劑提取的重金屬其環(huán)境學意義不同，DTPA用于提取含有較少的過渡金屬的近中性鈣質(zhì)土壤中水溶態(tài)、可交換態(tài)、有機物結(jié)合態(tài)和氧化物結(jié)合態(tài)的重金屬元素[17]。土壤DTPA提取態(tài)重金屬與其生物可利用性密切相關，因此可用土壤中DTPA提取態(tài)重金屬的含量表征其生物毒性。有研究發(fā)現(xiàn)，生物可利用性強的重金屬（例如Cd）更易作為利用態(tài)提取出來，相反生物可利用性較弱的重金屬（例如Pb、Cr）可被提取出來的濃度更低，約只占總濃度的百分之幾[23]。本研究發(fā)現(xiàn)雖然土壤中總Cd濃度遠小于總U濃度，但是Cd的DTPA提取態(tài)濃度卻大于U的DTPA提取態(tài)濃度，這可能是由于與U相比，Cd在土壤中更加活躍，移動性更高，生物可利用性更強，因而更容易作為可利用態(tài)被提取出來。在本研究中，與鈍化15 d后相比，土壤經(jīng)75 d鈍化處理后的鈍化效果更好。該結(jié)果表明鈍化劑不僅可以在短期內(nèi)降低土壤中重金屬的可提取態(tài)含量，修復土壤重金屬污染，而且其修復能力具有緩釋作用，對重金屬污染修復還具有長效機制[17]。

微生物細胞膜上具有各類型吸附專性蛋白，因此重金屬能在細胞壁和細胞膜上富集結(jié)晶[24-25]。微生物對重金屬的作用具有一定的選擇性，針對復合重金屬污染，采取不同菌株配比組合可能比單個菌種的修復效率高。本研究選取了3株對U具有高耐受性、高去除率的菌株進行兩兩及三者等比組合，考察其對U、Cd的吸附能力，并與單個菌株比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個菌種等比混合后對U、Cd的去除效率最高，這可能是由于菌種間具有協(xié)同作用。重金屬與微生物結(jié)合后雖然不會進入植物體內(nèi)對人體造成危害，但是單獨依靠微生物對重金屬的固定作用仍然存在水體污染的潛在危害。生物炭是一種富有孔隙結(jié)構、含碳量高的碳化物質(zhì)，用于制備生物炭的原材料來源于農(nóng)業(yè)廢棄物，因此其相對比較安全，不會對土壤造成二次污染[25-26]，是一類環(huán)境友好的載體材料，其多孔性質(zhì)有利于微生物的附著生長。以生物炭作為載體，制作成的復合鈍化劑加入土壤可以降低微生物單獨施加后隨下滲或徑流進入地下水或河流而對水體產(chǎn)生污染的潛在危害。同時，生物炭作為載體能提供一個良好的緩沖體系以屏蔽土壤不利條件的侵害，且加入土壤后就會成為土壤的一部分，能改變土壤理化性質(zhì)，顯著提高土壤肥力，從而提升植物對營養(yǎng)元素的吸收效果[8]。不同的固定化方法也是影響修復效果的重要因素，本研究主要通過吸附和包埋兩種方法固定微生物。研究結(jié)果表明，吸附固定微生物生物炭處理組的修復效果優(yōu)于包埋固定微生物生物炭處理組，這可能是由于吸附固定法對微生物活性影響較小，擴散阻力和鈍化劑與土壤接觸面相對較大。所以利用生物炭固定微生物在土壤修復方面的應用值得深入研究[7]。在本研究中，3種鈍化劑的效果呈顯著差異，處理后75 d，X3處理組可提取態(tài)的U、Cd含量最低，鈍化效果最為顯著。綜上所述，比較而言，生物炭作為微生物載體，通過吸附固定方式復合制備的鈍化劑在改善土壤性質(zhì)、修復土壤重金屬污染方面有著很大的潛在應用價值。

4 結(jié)論

（1）4種微生物組合對U、Cd都有去除作用，其中枯草芽孢桿菌、檸檬酸桿菌和蠟樣芽胞桿菌等比組合的去除率最優(yōu)。

（2）與對照組相比各鈍化劑處理后，土壤的pH值升高，且隨著鈍化劑添加量的增加，pH呈上升趨勢。各鈍化處理組中土壤陽離子交換量與有機質(zhì)含量均有所升高，其中，生物炭處理組對土壤陽離子交換量的提高效果最為顯著，3個處理組相比，生物炭處理組和吸附固定微生物生物炭處理組有機質(zhì)增加較包埋固定微生物生物炭處理組效果顯著。

（3）各鈍化劑處理后，土壤中可提取態(tài)的U、Cd含量均有所下降，且隨著鈍化時間的延長，可提取態(tài)的U、Cd含量持續(xù)降低，同時，隨著鈍化劑添加量的增加，鈍化效果顯著。3種鈍化劑的效果有所差異，處理后75 d后，3%吸附固定微生物生物炭處理組可提取態(tài)的U、Cd含量最低，鈍化效果最為顯著。