朱連榮，彭志晴，劉文徽，李楠，藍(lán)云鋒，賈國(guó)棟

方法：共納入90例研究對(duì)象，其中高血壓組60例和正常對(duì)照組30例。測(cè)量并記錄兩組人群初到海南1周內(nèi)、1個(gè)月和3個(gè)月后的血壓情況，比較兩組人群的血清中TNF-α、IL-6 和IL-1β以及PBMC內(nèi)miR-146a基因的表達(dá)情況。

結(jié)果：與1周內(nèi)相比，高血壓患者1個(gè)月和3個(gè)月收縮壓和舒張壓明顯降低（P均＜0.05），TNF-α、IL-1β和IL-6水平以及miR-146a基因表達(dá)也明顯下調(diào)（P＜0.05）。miR-146a基因與TNF-α、IL-1β呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），而與IL-6無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05）。正常對(duì)照組的血壓水平、血清炎性因子濃度和miR-146a基因表達(dá)在三個(gè)時(shí)間段無(wú)明顯差異。

結(jié)論：高血壓患者在海南居住1個(gè)月后血壓改善，可能與TNF-α、IL-1β和IL-6水平以及miR-146a基因表達(dá)降低有關(guān)。

高血壓病是多系統(tǒng)、多因素綜合作用的結(jié)果，越來(lái)越多的研究資料顯示高血壓常伴隨著免疫功能異常，單核細(xì)胞是慢性炎癥的重要參與者[1]，分泌腫瘤壞死因子-α（TNF-α）[2]、白細(xì)胞介素6 （IL-6）[3]和白細(xì)胞介素1（IL-1β）[4]在內(nèi)的多種細(xì)胞因子和趨化因子[1，5]，這些炎性因子在高血壓發(fā)生、發(fā)展中起重要的作用[6]。近年的研究提示，微小RNA （miR）在心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起了重要作用，TNF-α和IL-1β刺激單核細(xì)胞后， 可以通過(guò)核轉(zhuǎn)錄因子（NF）-κB方式誘導(dǎo)miR-146a基因表達(dá)[7]?！昂蝤B(niǎo)”人群是指以追求高質(zhì)量的生活為目標(biāo)，以氣候?yàn)榛A(chǔ)的短期季節(jié)性遷徙的人群，其生活方式、疾病類(lèi)型和醫(yī)療需求與海南常住人口有明顯差異。本研究旨在了解海南地區(qū)“候鳥(niǎo)”高血壓患者的血壓改善情況，并探討外周血單核細(xì)胞（PBMC）內(nèi)miR-146a基因的表達(dá)與血清TNF-α、IL-6和 IL-1β水平的相關(guān)性。

1 資料與方法

研究對(duì)象：采集2014-10至2015-03期間在解放軍總醫(yī)院海南分院就診的單純高血壓患者以及健康查體者。納入標(biāo)準(zhǔn)為：（1）海南省戶籍以外，男女不限，年齡≥40歲；（2）初次到達(dá)海南島，入島時(shí)間在7天以內(nèi)；（3）單純高血壓患者已服藥治療；（4）計(jì)劃在海南生活時(shí)間≥6個(gè)月；（5）經(jīng)體檢除外感染、腫瘤、免疫系統(tǒng)缺陷、嚴(yán)重肝腎功能不全等疾病以及應(yīng)用炎癥抑制藥物者；（6）高血壓患者入組后服用降壓藥和（或）其他藥物與入組前相比未做改變。能定期監(jiān)測(cè)血壓，按時(shí)隨訪。入選對(duì)象均經(jīng)解放軍總醫(yī)院海南分院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并與本人簽署知情同意書(shū)。

分組：高血壓組：選擇冬季遷徙居住在海南地區(qū)的“候鳥(niǎo)”人群中在我院住院和門(mén)診隨診的原發(fā)性高血壓患者60例（男性37例，女性23例），平均年齡（59.9 ±11.2）歲。符合2010年《中國(guó)高血壓防治指南》高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。正常對(duì)照組：選擇同期年齡、性別相匹配的在本院門(mén)診體檢的健康“候鳥(niǎo)”人群30例（男性16例，女性14例），平均年齡（54.5±7.9）歲；其血壓水平從未發(fā)現(xiàn)異常，收縮壓和舒張壓長(zhǎng)期分別在 90～140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）和60～90 mmHg之間。

研究方法：按照“候鳥(niǎo)”人群居住時(shí)間分為四個(gè)時(shí)期：1期：初到海南1周內(nèi)；2期：到海南1個(gè)月；3期：到海南3個(gè)月；4期：到海南4～6個(gè)月（由于4期失訪率超過(guò)40%，故未納入統(tǒng)計(jì)）?！昂蝤B(niǎo)”人群在到達(dá)海南1周內(nèi)、1個(gè)月和3個(gè)月時(shí)共測(cè)量三次血壓水平。

實(shí)驗(yàn)室檢查：血清TNF-α、IL-6 和IL-1β的水平測(cè)定采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），檢測(cè)方法嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)步驟由課題組同一人完成。采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離PBMC，實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time PCR）法檢測(cè)PBMC內(nèi)miR-146a的表達(dá)。分離的PBMC，用一步法多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）提取細(xì)胞總RNA。提取的RNA經(jīng)電泳鑒定未被降解， 再用72-1分光光度計(jì)測(cè)260 nm和280 nm范圍的吸光度值A(chǔ)260 和 A280，所有樣品的A260/A280比值介于1.9～2.1 。根據(jù)A260對(duì)樣品的總RNA進(jìn)行初步定量。用TaKaRa實(shí)時(shí)定量試劑盒配置25 μl反應(yīng)體系。采用miScript Reverse Transcription試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，取5 μl cDNA模板采用mi Script Primer assay 和mi Script SYBR Green PCR試劑盒進(jìn)行PCR。miR-146a 基因擴(kuò)增應(yīng)用miScript通用引物及其各自炎性指標(biāo)特異性引物，同時(shí)以5S作為內(nèi)參，最終在ABI 7500 Real-time PCR儀測(cè)定其相對(duì)表達(dá)量。上述試劑盒購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司， 具體操作步驟均按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：使用 SPSS 19.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±s表示，數(shù)據(jù)類(lèi)型符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)，進(jìn)行比較采用單因素重復(fù)測(cè)量方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

兩組受試者的一般臨床資料及血壓水平比較（表1）：高血壓組和正常對(duì)照組性別和年齡比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。高血壓組中，與 1期比較，患者在2期和3期時(shí)的血壓明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均 ＜0.05），與2期比較，3期時(shí)的血壓雖有所下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。正常對(duì)照組的血壓平穩(wěn)，三個(gè)時(shí)間段的血壓差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均 ＞0.05）。

表1 兩組受試者的一般臨床資料及血壓水平比較（±s）

表1 兩組受試者的一般臨床資料及血壓水平比較（±s）

注：與同組1期比較*P＜0.05。1 mmHg=0.133 kPa

候鳥(niǎo)人群居住時(shí)間1期 (1周內(nèi)) 2期 (1個(gè)月) 3期 (3個(gè)月)收縮壓 (mmHg) 舒張壓 (mmHg)收縮壓 (mmHg)舒張壓 (mmHg) 收縮壓 (mmHg) 舒張壓 (mmHg)正常對(duì)照組 30 16/14 54.5±7.9 121.0±6.6 67.0±8.4 122.0±9.3 66.0±7.4 118.0±10.1 68.0±4.9高血壓組 60 37/23 59.9±11.2 144.0±17.2 82.0±8.9 130.0±14.6 * 68.0±7.3 * 126.0±31.4 * 67.0±5.6 *分組 例數(shù) 男/女 (例) 年齡 (歲)

兩組受試者血清炎性因子水平比較（表2）：（1）與正常對(duì)照組比較，高血壓組1期～3期的血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平均較高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（2）在高血壓組患者中，與1期比較，2期和3期的血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（3）正常對(duì)照組中，三個(gè)時(shí)間段的血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 兩組受試者的炎性因子水平比較（±s）

表2 兩組受試者的炎性因子水平比較（±s）

注：TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-6：白細(xì)胞介素6；IL-1β：白細(xì)胞介素1β。與同期正常對(duì)照組比 *P＜0.05；與高血壓組I期比△P＜0.05

候鳥(niǎo)人群居住時(shí)間1期 (1周內(nèi)) 2期 (1個(gè)月) 3期 (3個(gè)月)正常對(duì)照組 (n=30) 高血壓組 (n=60) 正常對(duì)照組 (n=30) 高血壓組 (n=60) 正常對(duì)照組 (n=30) 高血壓組 (n=60)TNF-α (pg/ml) 1.847±0.09 2.89±0.31* 1.82±0.67 2.45±0.10 * △ 1.78±0.09 2.33±0.17*△IL-1β (ng/ml) 6.61±0.91 10.31±0.55* 4.81±0.21 9.22 ±0.11 * △ 4.64±0.39 8.70±0.75*△IL-6 (pg/ml) 135.12±19.44 277.31±32.89* 129.76±20.11 240.38± 60.43 * △ 131.55±9.12 188.93 ±17.98*△項(xiàng)目

兩組受試者外周血PBMC內(nèi)miR-146a基因的表達(dá)（圖1）：以同時(shí)間點(diǎn)正常對(duì)照組受試者的PBMC內(nèi)miR-146a基因表達(dá)表示為1，則高血壓組患者在1期、2期和3期時(shí)的外周血PBMC內(nèi)miR-146a基因表達(dá)下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），而且隨著時(shí)間推移PBMC內(nèi)miR-146a表達(dá)逐漸降低（P均＜0.05）。（2）正常對(duì)照組三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的外周血PBMC內(nèi)miR-146a基因表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)有上升趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 兩組受試者外周血單核細(xì)胞（PBMC）內(nèi) miRNA-146a基因變化

外周血PBMC內(nèi)miR-146a基因表達(dá)及血清炎性因子水平的相關(guān)性：miR-146a基因與TNF-α（r=0.601，P=0.012 ）、IL-1β（r=0.583，P=0.034 ）呈正相關(guān)（P＜0.05），而與 IL-6（r=0.210，P=0.186 ）無(wú)顯著相關(guān)性。

3 討論

高血壓人群患病率呈逐年上升趨勢(shì)[9]，2010年第六次全國(guó)人口普查數(shù)據(jù)測(cè)算高血壓患病人數(shù)約為2.7億，主要以藥物治療為主。多項(xiàng)研究從多方面揭示了血清炎性因子與疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[5，10-13]，血清炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6等在高血壓的發(fā)病機(jī)制中可能起重要作用。

本研究結(jié)果表明，“候鳥(niǎo)”高血壓人群到達(dá)海南1期、2期、3期（1周、1個(gè)月及3個(gè)月）后血壓呈梯度下降，與到達(dá)海南1期血壓比較，2期和3期后的收縮壓和舒張壓均顯著降低（P＜0.05），提示高血壓患者在海南生活1～3個(gè)月可改善血壓。海南季節(jié)性老年人口遷入使冬季心腦血管意外事件頻發(fā)，其中常見(jiàn)心原性猝死，因其發(fā)病急、后果嚴(yán)重而嚴(yán)重危害潛在人群生命健康[14]，本研究發(fā)現(xiàn)入島“候鳥(niǎo)”老人存在著血壓變化，為高危人群的早期識(shí)別和正確的干預(yù)提供了證據(jù)。

“候鳥(niǎo)”高血壓組患者到達(dá)海南1～3期的血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平均較正常對(duì)照組高（P＜0.05），提示高血壓病患者血清炎性因子處于激活狀態(tài)，抑制炎性因子的激活可能是治療高血壓的新靶點(diǎn)?！昂蝤B(niǎo)”高血壓人群到達(dá)海南1周內(nèi)的血清TNF-α、IL-1β和IL-6三個(gè)炎性因子初始檢測(cè)水平較1個(gè)月后明顯升高，提示該初始檢測(cè)得到的水平可能為高血壓人群的負(fù)荷狀態(tài)。隨著高血壓組成員到達(dá)海南后時(shí)間延長(zhǎng)，PBMC內(nèi)miR-146a基因表達(dá)隨時(shí)間長(zhǎng)度呈梯度下調(diào)，與三個(gè)炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平下降趨勢(shì)相仿，提示炎性因子可能是高血壓病的獨(dú)立危險(xiǎn)因子。

已有研究顯示高血壓患者血清TNF-α水平上升可引起血管內(nèi)皮損傷[15，16]，當(dāng)血壓升高時(shí)，血管內(nèi)皮細(xì)胞受損及平滑肌細(xì)胞增生，均可產(chǎn)生TNF-α。推測(cè)TNF-α與血壓水平相互協(xié)同，血管內(nèi)皮長(zhǎng)期經(jīng)受較高的血壓及異常血流的循環(huán)會(huì)發(fā)生損傷，進(jìn)而激活炎癥反應(yīng)系統(tǒng)，促使組織和器官產(chǎn)生大量炎性因子；反之，高水平炎性因子所引起的炎癥反應(yīng)進(jìn)一步加重內(nèi)皮細(xì)胞損傷，促使血流阻力增加及血管壁彈性降低，使血壓值升高。近年來(lái)，我們?cè)谂R床實(shí)踐中觀察到藥物治療為主，輔以平穩(wěn)的自然生活環(huán)境，對(duì)包括高血壓在內(nèi)的慢性病能夠得到明顯的治療效果。本研究顯示”候鳥(niǎo)”高血壓人群血壓水平與血清中的TNF-α、IL-1β和IL-6三個(gè)炎性因子水平呈正相關(guān)，隨著高血壓患者血壓水平的降低，其血清中的TNF-α、IL-1β和IL-6三個(gè)炎性因子水平也同步下降。本研究從時(shí)間和空間的角度比較了高血壓的變化，高血壓患者從內(nèi)地到海南1周內(nèi)的TNF-α、IL-1β和IL-6炎性因子水平均處于監(jiān)測(cè)期間最高水平，1個(gè)月后的炎性因子水平明顯降低，隨訪期間檢測(cè)炎性因子水平與監(jiān)測(cè)血壓水平降低趨勢(shì)相仿，3個(gè)月后隨訪結(jié)束，高血壓患者的血壓和炎性因子均處于隨訪期間最低值，雖然仍高于正常對(duì)照組，但血壓的明顯改善使內(nèi)皮細(xì)胞損傷減輕。本研究結(jié)果提示海南良好的冬春氣候?qū)Ω哐獕夯颊呖祻?fù)具有正面效應(yīng)。

本研究從更年輕的“候鳥(niǎo)”人群中（40～60歲）佐證了前期課題組的結(jié)論，即海南“候鳥(niǎo)”老人（＞60歲）的慢性病康復(fù)得益于優(yōu)越的氣候環(huán)境[17]。為了進(jìn)一步驗(yàn)證結(jié)果的可靠性，我們參考miR-146a基因表達(dá)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的一項(xiàng)研究[18]，用逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法測(cè)定各期miR-146a的表達(dá)情況，高血壓組患者到達(dá)海南1周、1個(gè)月及3個(gè)月后的時(shí)間里，PBMC 內(nèi)miR-146a基因表達(dá)逐漸下調(diào)。隨著監(jiān)測(cè)期間的血壓逐漸降低，炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平的下降，miR-146a基因表達(dá)同步減弱，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示miR-146a基因表達(dá)與TNF-α和IL-1β水平呈顯著正相關(guān)，IL-6雖同步降低，但與miR-146a無(wú)相關(guān)關(guān)系，可能是樣本量較小和（或）實(shí)驗(yàn)誤差的原因。miR-146a基因表達(dá)與炎性因子TNF-α和IL-1β呈正相關(guān)也進(jìn)一步從基因角度驗(yàn)證了連續(xù)生活3個(gè)月的時(shí)間高血壓人群的血壓水平明顯得到改善，也表明基因研究的進(jìn)展有助于高血壓的臨床診斷和治療[19]。對(duì)生活4個(gè)月以上的人群血壓我們未能找到足夠樣本進(jìn)行比較，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，推測(cè)這種改善將會(huì)持續(xù)?！昂蝤B(niǎo)”人群離島后的血壓是否恢復(fù)入島時(shí)的水平需要進(jìn)一步研究。海南島是個(gè)四季溫差較小的地方[20]，當(dāng)藥物對(duì)病情的控制難以滿意時(shí)，自然環(huán)境似乎是一個(gè)有希望的新途徑[21,22]。