姚曉磊，黃欣愛，肖慎華，鄭臨楓，范麗潔，金宇月，劉孜斐，張艷麗，王 潔，王 鋒*

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，南京210095； 2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)羊業(yè)科學(xué)研究所，南京 210095；3. 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，泰州 225300)

脂聯(lián)素(adiponectin，Adp)是由脂肪細(xì)胞特異分泌的因子，具有調(diào)節(jié)機(jī)體新陳代謝[1]、炎癥[2]和免疫應(yīng)答[3]等生物學(xué)作用。Adp生物學(xué)功能的發(fā)揮是通過脂聯(lián)素受體 (adiponectin receptor，AdpR)介導(dǎo)完成的。迄今為止，已克隆出3種AdpR：AdpR1、AdpR2 和T-鈣粘蛋白(T-cadherin)。AdpR1和AdpR2在下丘腦[4]、垂體[5]、睪丸[6-7]、卵巢[8]中均有表達(dá)，提示下丘腦-垂體-性腺軸(hypothalamus-pituitary-gonad axis，HPG)可能是Adp發(fā)揮作用的重要靶器官。Ocon等[6]研究發(fā)現(xiàn)，AdpR1主要存在于公雞睪丸間質(zhì)細(xì)胞、曲精細(xì)管管壁肌樣細(xì)胞，而AdpR2主要表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞、支持細(xì)胞、精子細(xì)胞、精子中。同時(shí)，研究者也發(fā)現(xiàn)，AdpR1和AdpR2存在于牛精子中[9]。

睪丸間質(zhì)細(xì)胞中存在AdpR1和AdpR2。提示Adp可能與睪酮(testosterone，T)分泌有關(guān)。人注射T后，血漿中Adp水平下降[10]。Tsou等[11]證實(shí)隨著男性青春期發(fā)育和T水平的增加，血漿中的Adp水平下降，說明T水平可能與Adp水平呈負(fù)相關(guān)，這一結(jié)論被Adamczak等[12]研究證實(shí)。但是，后來Landry等[13]研究發(fā)現(xiàn)，Adp能夠促進(jìn)T的合成。這一結(jié)論也得到國內(nèi)外相關(guān)研究證實(shí)[14-15]。關(guān)于血漿中Adp水平與T含量之間相關(guān)性仍然是個(gè)有爭(zhēng)議的問題。因此，明確Adp水平與機(jī)體T含量之間的關(guān)系具有重要的意義。

T合成與分泌受HPG的調(diào)節(jié)。這是由于下丘腦通過分泌促性腺激素釋放激素(gonadotropin releasing hormone，GnRH)，最終作用于睪丸分泌T，促進(jìn)睪丸的發(fā)育。AdpR1和AdpR2存在于下丘腦中，提示Adp可能通過介導(dǎo)下丘腦功能的發(fā)揮對(duì)HPG進(jìn)行調(diào)節(jié)[16]。同時(shí)下丘腦分泌的促性腺激素抑制激素(gonadotropin inhibitory hormone，GnIH)負(fù)反饋抑制GnRH的分泌。據(jù)此推測(cè)，Adp可能與GnRH和GnIH之間存在一定的相關(guān)性。

目前關(guān)于AdpR1和AdpR2在生殖器官中的表達(dá)主要集中在嚙齒類和哺乳動(dòng)物上，雖然已有研究表明，AdpR1和AdpR2在綿羊繁殖器官中表達(dá)[17]，但二者在綿羊不同發(fā)育階段生殖器官中如何變化，還未見報(bào)道。因此，本研究以不同發(fā)育階段的湖羊?yàn)檠芯繉?duì)象，采用qRT-PCR技術(shù)從mRNA水平探究AdpR1、AdpR2及T合成關(guān)鍵基因在不同發(fā)育階段湖羊生殖器官中的表達(dá)規(guī)律；采用ELISA技術(shù)測(cè)定不同發(fā)育階段湖羊血清中Adp、T、GnRH和GnIH含量，分析Adp與GnRH、GnIH、T及T合成關(guān)鍵基因的相關(guān)性；應(yīng)用免疫組化技術(shù)將AdpR1在湖羊生殖器官中進(jìn)行定位，為進(jìn)一步研究AdpR1在性腺發(fā)育過程中如何發(fā)揮作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集

本試驗(yàn)所需湖羊由江蘇省泰州市海倫羊業(yè)有限公司提供。選取3月齡((16.07±0.20)kg)、9月齡((40.07±2.75)kg)、24月齡((76.65±4.38)kg)發(fā)育正常的健康湖羊各5只，共15只，進(jìn)行常規(guī)飼養(yǎng)管理。屠宰前禁食12 h，給予正常飲水，頸靜脈采血，3 000 r·min-1離心15 min，吸取上清，-20 ℃保存；屠宰后，采集下丘腦、垂體、睪丸、附睪頭、體、尾組織，迅速置于液氮中，-80 ℃保存；從每只羊的睪丸、附睪頭、體、尾的相同部位采集組織樣品，約0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm，4.0%多聚甲醛固定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 ELISA檢測(cè) 嚴(yán)格按照綿羊脂聯(lián)素(Adp)、睪酮(T)、促性腺激素釋放激素(GnRH)、促性腺激素抑制激素(GnIH)ELISA試劑盒 (Kmals，上海)說明書分別測(cè)定不同發(fā)育階段湖羊血清中Adp、T、GnRH和GnIH濃度。

1.2.2 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 按照Trizol Reagent試劑盒(Invitrogen公司，美國)說明書分別提取不同發(fā)育階段(n=5)湖羊下丘腦、垂體、睪丸、附睪頭、體、尾總RNA，DEPC水(Invitrogen，美國)溶解，核酸蛋白測(cè)定儀ND-2000(NanoDrop Technologies，美國)測(cè)定總RNA濃度和純度，同時(shí)采用1.5% 凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量。調(diào)整其濃度為1 μg·μL-1左右，反轉(zhuǎn)錄體系為40 μL，按照PrimeScript?RT reagent Kit With gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa，大連)說明書進(jìn)行操作。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA -20 ℃保存。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI上綿羊(Ovisaries)的相關(guān)基因序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物(表1)，由南京擎科生物有限公司合成引物序列。

表1 用于qRT-PCR引物序列

1.2.4 qRT-PCR 以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，對(duì)AdpR1、AdpR2、LHR、StAR、3β-HSD、GAPDH基因進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系為20 μL：SYBR Green Master mix (Roche，德國)10 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.6 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7.8 μL。反應(yīng)條件及步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.5 免疫組化 采用石蠟對(duì)已固定好的組織進(jìn)行包埋，切片厚度為6 μm，37 ℃烤片24 h，常規(guī)脫蠟流程按照SABC試劑盒操作說明進(jìn)行。其中，Rabbit anti-AdpR1(華安生物，杭州；1∶100)，4 ℃過夜，PBS每5 min洗3次；Goat anti-Rabbit(博士德，武漢；1∶100)，37 ℃ 30 min，用PBS每5 min洗3次；SABC(博士德，武漢；1∶100)，37 ℃ 30 min，PBS每5 min洗3次。同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，用PBS代替一抗，并用Nikon生物顯微鏡觀察。

1.3 數(shù)據(jù)分析

各目的基因相對(duì)表達(dá)量采用△△CT法計(jì)算，相對(duì)表達(dá)水平為2-△△CT，各目的基因相對(duì)表達(dá)量均應(yīng)經(jīng)GAPDH校正。其中各目的基因mRNA表達(dá)量分別以3月齡表達(dá)量均值為對(duì)照，其余(9和24月齡)以相對(duì)于對(duì)照的倍數(shù)作圖。比較AdpR1、AdpR2 mRNA 表達(dá)量時(shí)，以AdpR1 3月齡表達(dá)量為對(duì)照。其余月齡相對(duì)于其倍數(shù)作圖。數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果表示為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”。差異顯著性采用One-way ANOVA 和T-test分析，相關(guān)性分析采用Bivariate correlation進(jìn)行，顯著水平為P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 AdpR1 在9月齡湖羊生殖器官中的定位

如圖1A所示，AdpR1 定位于湖羊睪丸間質(zhì)細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞和曲精細(xì)管管壁肌樣細(xì)胞。在附睪頭、體、尾上皮細(xì)胞中均檢測(cè)到AdpR1陽性信號(hào)，即細(xì)胞核被DAB染成深色(圖1B～D)；陰性對(duì)照未檢測(cè)到任何陽性信號(hào)，即細(xì)胞核沒有被DAB染色，因此細(xì)胞核為淺色(圖1E)。

A～D.睪丸、附睪頭、附睪體、附睪尾；E.陰性對(duì)照(A～C和E 400×;D 200×)。PMC.曲精細(xì)管管壁肌樣細(xì)胞；LC.間質(zhì)細(xì)胞；Sc.精母細(xì)胞；St.精子細(xì)胞；PC.主細(xì)胞(上皮細(xì)胞)A-D.Testis, caput, corpus and cauda, respectively；E. Negative control (A-C,E 400×;D 200×). PMC. Peritubular myoid cells; LC. Leydig cells; Sc. Spermatocyte; St. Spermatid, PC.Principal cells圖1 9月齡湖羊生殖器官中AdpR1蛋白表達(dá)Fig.1 Immunohistochemical location of AdpR1 protein in the reproductive tracts of 9 month Hu sheep

2.2 不同發(fā)育階段湖羊血清中Adp、T、GnRH、GnIH含量的變化

由圖2可知，湖羊血清中Adp和T(結(jié)果已另文發(fā)表)含量呈先上升后下降趨勢(shì)，表現(xiàn)為性成熟后(9和24月齡)血清中Adp和T濃度顯著高于性成熟前(3月齡)(P<0.05)，但9與24月齡間差異不顯著(P>0.05)； 血清GnRH含量同樣呈先上升后下降趨勢(shì)，3和 24月齡差異不顯著(P>0.05)；血清GnIH含量在湖羊9月齡時(shí)達(dá)到最高，24月齡時(shí)最低，其中3與9月齡差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于24月齡 (P<0.05)。

不同小寫字母表示不同月齡之間差異顯著(P<0.05)Values with different small letter superscripts mean significant difference among different ages (P<0.05)圖2 不同月齡湖羊血清中Adp、GnRH 和GnIH濃度的變化Fig.2 The concentrations of Adp, GnRH and GnIH in serum at different developmental ages of Hu sheep

2.3 AdpR1和AdpR2在不同發(fā)育階段湖羊性腺軸中mRNA 表達(dá)模式

采用qRT-PCR技術(shù)對(duì)不同發(fā)育階段湖羊性腺軸中AdpR1和AdpR2 mRNA表達(dá)規(guī)律的檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。AdpR1和AdpR2 mRNA 在9月齡湖羊性腺軸組織中呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)，二者在睪丸中的表達(dá)水平顯著高于其他組織(P<0.05，圖3A和3B)；AdpR1 在睪丸和附睪尾中mRNA表達(dá)量隨月齡的增大而升高，均表現(xiàn)為性成熟后(9和24月齡) 顯著高于性成熟前(3月齡)(P<0.05，圖3C和3I)，其中睪丸中AdpR1 mRNA表達(dá)量在9與24月齡 間差異不顯著(P>0.05，圖3C)；AdpR1在不同月齡湖羊附睪頭和附睪體中mRNA表達(dá)量差異不顯著(P>0.05，圖3E和3G)；AdpR2在不同月齡湖羊睪丸、附睪頭和附睪體中mRNA表達(dá)量差異不顯著(P>0.05，圖3D、3F和3H)；AdpR2 mRNA在24月齡附睪尾中的表達(dá)量顯著高于3 和9月齡(P<0.05)， 但3與9月齡差異不顯著(P>0.05，圖3J)。

2.4 AdpR1和AdpR2在不同發(fā)育階段湖羊睪丸中mRNA表達(dá)量比較分析

從圖4可知，各個(gè)月齡睪丸和附睪尾中AdpR1 mRNA表達(dá)量均顯著高于AdpR2 (P<0.05)(圖4A,D)；雖然各個(gè)月齡附睪頭和附睪體中AdpR1 mRNA表達(dá)量均高于AdpR2，但差異不顯著(P>0.05)(圖4B，C)。

2.5 睪酮合成關(guān)鍵基因在不同發(fā)育階段湖羊睪丸中mRNA表達(dá)變化

由圖5可知，湖羊睪丸中LHR和StARmRNA的表現(xiàn)為先上升后下降趨勢(shì)，且各組之間存在顯著差異(P<0.05)，二者都是以9月齡表達(dá)量最高，3月齡表達(dá)量最低；3β-HSDmRNA在不同發(fā)育階段湖羊睪丸中呈現(xiàn)出先上升后下降趨勢(shì)，且性成熟后(9和24月齡)顯著高于性成熟前(3月齡)(P<0.05)，但9與24月齡之間差異不顯著(P>0.05)。

2.6 湖羊血清激素和相關(guān)基因的相關(guān)性分析

由表2可知，湖羊血清中T分別與Adp和GnRH水平顯著正相關(guān)(P<0.05)；AdpR1 mRNA表達(dá)水平與StAR、3β-HSDmRNA表達(dá)水平顯著正相關(guān)(P<0.05)。雖然Adp含量與GnRH正相關(guān)，與GnIH負(fù)相關(guān)，但均差異不顯著(P>0.05)。

3 討 論

Adp作為一種具有多種生理功能的脂肪細(xì)胞因子，通過內(nèi)分泌方式循環(huán)到血液中，繼而發(fā)揮各種功能。檢測(cè)血清Adp水平臨床上對(duì)胰島素抵抗[18]、卵巢綜合征[19]等疾病的發(fā)生進(jìn)行預(yù)測(cè)。而且越來越多研究表明，脂聯(lián)素對(duì)動(dòng)物的生殖功能具有重要影響[20-21]。本研究首先測(cè)定了不同發(fā)育階段湖羊血清Adp含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，性成熟(9和24月齡)湖羊血清中Adp水平顯著高于性成熟前(3月齡)。李云等[22]研究發(fā)現(xiàn)，性成熟皖南花豬血清中Adp含量顯著高于性成熟前。這一現(xiàn)象與前人在公雞[6]上的報(bào)道一致。這說明Adp在動(dòng)物機(jī)體發(fā)育過程中扮演著重要角色。

Adp功能的發(fā)揮需要通過其受體(AdpR1/2)介導(dǎo)來完成。前期研究表明，AdpR1和AdpR2在豬[14]、雞[6-7]、大鼠[23]睪丸中表達(dá)。本試驗(yàn)首先利用免疫組化技術(shù)對(duì)AdpR1在睪丸和附睪中進(jìn)行了定位，研究發(fā)現(xiàn)，AdpR1主要存在于睪丸間質(zhì)細(xì)胞、精母細(xì)胞、精子細(xì)胞、曲精細(xì)管管壁肌樣細(xì)胞以及附睪頭、體、尾中的上皮細(xì)胞中。而Ocón-Grove等[6]研究發(fā)現(xiàn)，AdpR1主要表達(dá)于公雞睪丸間質(zhì)細(xì)胞和曲精細(xì)管管壁肌樣細(xì)胞。這種差異可能與物種差異有關(guān)。附睪是精子成熟的場(chǎng)所，精子在附睪中的成熟不僅受到精子自身因素的作用，還受到附睪微環(huán)境的影響[24]。附睪上皮細(xì)胞能夠分泌種類不同的蛋白質(zhì)及免疫抑制分子，以形成不斷變化的附睪微環(huán)境，精子在附睪內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過程中，附睪液與精子相互作用是精子逐步獲得成熟時(shí)所具備的功能[25]。已有研究發(fā)現(xiàn)，AdpR1 和AdpR2 在牛[9]和綿羊[26]精子中有表達(dá)。提示Adp可能對(duì)精子成熟有一定的影響，但具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

不同小寫字母表示不同組織或不同月齡之間差異顯著(P<0.05)。A、B.AdpR1和AdpR2在9月齡湖羊性腺軸中mRNA表達(dá)；C、E、G、I.AdpR1在不同月齡湖羊睪丸、附睪頭、體、尾中mRNA表達(dá)；D、F、H、J.AdpR2在不同月齡湖羊睪丸、附睪頭、體、尾中mRNA表達(dá)Values with different small letter superscripts mean significant different among different tissues or different ages (P<0.05)A, B.The mRNA expression of AdpR1 and AdpR2 in the gonadal-axis of 9 month Hu sheep, respectively. C, E, G, I.The mRNA expression of AdpR1 in the testis, epididymis caput, corpus and cauda at different developmental stages of Hu sheep, respectively; D, F, H, J.The mRNA expression of AdpR2 in the testis, epididymis caput, corpus and cauda at different developmental stages of Hu sheep, respectively圖3 AdpR1和AdpR2在不同月齡湖羊性腺軸中mRNA表達(dá)Fig.3 The mRNA expression of AdpR1 and AdpR2 in the gonadal-axis at different developmental stages of Hu sheep

A～D.睪丸、附睪頭、體、尾。*.同一月齡AdpR1與AdpR2 mRNA間差異達(dá)顯著(P<0.05)A-D.Indicate testis, epididymis caput, corpus and cauda, respectively.*. Significant difference (P<0.05) between AdpR1 and AdpR2 mRNA abundance at the same ages圖4 AdpR1和AdpR2在不同月齡湖羊生殖器官中mRNA表達(dá)水平的比較Fig.4 Comparison of the mRNA expression levels between AdpR1 and AdpR2 in reproductive organs of Hu sheep at different developmental stages

不同小寫字母表示不同月齡之間差異顯著(P<0.05)Values with different small letter superscripts mean significant difference among different ages (P<0.05)圖5 LHR(A)、StAR(B)和3β-HSD(C)在不同月齡湖羊睪丸中mRNA表達(dá)水平Fig.5 The mRNA expression of LHR(A), StAR (B)and 3β-HSD (C) in the testis of Hu sheep at different ages

表2 不同月齡湖羊血清激素與相關(guān)基因的相關(guān)性分析

*表示縱向指標(biāo)分別與橫向指標(biāo)之間相比顯著相關(guān) (P<0.05)

*indicate significant correlation between longitudinal indexes and horizontal indexes (P<0.05)

AdpR1 和AdpR2 mRNA 在綿羊睪丸和附睪有表達(dá)[17]，但是二者在發(fā)育過程中是如何變化的，目前還未見報(bào)道。因此，本試驗(yàn)進(jìn)一步采用qRT-PCR技術(shù)探究了AdpR1和AdpR2 mRNA在不同發(fā)育階段湖羊睪丸和附睪中的表達(dá)模式。研究發(fā)現(xiàn)，AdpR1 mRNA在睪丸和附睪尾中表達(dá)量呈上升趨勢(shì)，且具有顯著的變化。這與前人發(fā)現(xiàn)的AdpR1 mRNA在不同發(fā)育階段雞[6]和皖南花豬[14]睪丸中變化趨勢(shì)一致。而AdpR2 mRNA在附睪尾中呈上升趨勢(shì)，而在其他生殖器官中無顯著變化。同時(shí)，筆者發(fā)現(xiàn)AdpR1 mRNA表達(dá)量在睪丸和附睪中表達(dá)量均高于AdpR2，其中AdpR1 mRNA在睪丸和附睪尾中具有顯著變化。提示Adp在睪丸和附睪中的作用主要通過AdpR1介導(dǎo)。

AdpR1在睪丸間質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，推測(cè)Adp可能對(duì)T的生成有一定的影響。T的合成受HPG調(diào)節(jié)。而下丘腦是HPG的主要控制中心，通過分泌GnRH和GnIH對(duì)動(dòng)物機(jī)體生殖功能進(jìn)行調(diào)節(jié)。筆者進(jìn)一步檢測(cè)了不同發(fā)育階段血清中T[27]、GnRH和GnIH含量發(fā)現(xiàn)，血清中T含量表現(xiàn)為性成熟后(9月齡)顯著高于性成熟前(3月齡)，而GnRH和GnIH均表現(xiàn)為9月齡最高。這可能是由于湖羊在性成熟過程中，隨著血清中GnRH含量的增加，經(jīng)過一系列內(nèi)分泌調(diào)節(jié)，導(dǎo)致T含量升高，進(jìn)而促進(jìn)睪丸發(fā)育，當(dāng)T含量積累到一定程度，就會(huì)反饋抑制GnRH的釋放，進(jìn)而導(dǎo)致GnIH升高。而當(dāng)湖羊達(dá)到24月齡后，睪丸已經(jīng)發(fā)育完全，對(duì)T的依賴性有所減弱，進(jìn)而導(dǎo)致GnRH和GnIH降低。前期研究表明，隨著男性青春期的發(fā)育和T水平的增加，血漿Adp水平下降[11]。這說明Adp與T含量之間有一定的相關(guān)性。但也有研究卻得出相反結(jié)論，Adp對(duì)T的生成有促進(jìn)作用[13,15]。本研究發(fā)現(xiàn)，在特定的發(fā)育階段，血清中Adp和T含量顯著正相關(guān)，說明Adp能夠促進(jìn)T生成，這一發(fā)現(xiàn)與邵康等[14]在皖南花豬上研究一致。前期研究已證實(shí)，Adp能夠抑制下丘腦GT1-7神經(jīng)細(xì)胞GnRH的分泌[28]。李云等[22]研究表明，Adp與GnRH顯著負(fù)相關(guān)。但是，本研究發(fā)現(xiàn)，Adp與GnRH呈正相關(guān)。這可能與本研究選取的湖羊發(fā)育階段跨度太大有關(guān)。因此，二者相互作用關(guān)系還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

T合成途徑中也受多種類固醇合成酶的調(diào)控。StAR和3β-HSD是睪丸間質(zhì)細(xì)胞中類固醇激素合成途徑的2個(gè)最重要的限速酶[29]。StAR和3β-HSDmRNA表達(dá)量的高低直接影響T的生成[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，StAR和3β-HSDmRNA在9月齡 表達(dá)量最高，表明此階段是T快速合成時(shí)期。StARmRNA顯著變化與邵康等[14]發(fā)現(xiàn)在皖南花豬性成熟前后表達(dá)趨勢(shì)一致。如前所述，AdpR1 mRNA 在睪丸中有顯著的變化，表現(xiàn)為性成熟后(9和24月齡)顯著高于性成熟前(3月齡)。且AdpR1分別與StAR和3β-HSDmRNA 表達(dá)量顯著正相關(guān)。在特定的發(fā)育階段，AdpR1與T合成限速酶有類似的表達(dá)量上升模式，提示它們有協(xié)同升高T的相互作用。

4 結(jié) 論

AdpR1 mRNA表達(dá)量在不同發(fā)育階段湖羊生殖器官中具有顯著性變化，且在各個(gè)階段睪丸和附睪尾中均顯著高于AdpR2，提示Adp在湖羊生殖器官中的作用主要由AdpR1介導(dǎo)。同時(shí)，AdpR1與StAR和3β-HSDmRNA 表達(dá)量顯著正相關(guān)，提示AdpR1介導(dǎo)Adp在湖羊睪丸發(fā)育過程中促進(jìn)T生成。