薛 煥， 金 雁， 于永麗*

(1.東北大學理學院，遼寧沈陽 110819;2.沈陽出入境檢驗檢疫局，遼寧沈陽 110016)

隨著人們對畜禽產(chǎn)品的需求量逐年遞增，畜禽養(yǎng)殖企業(yè)不斷興起和擴大。為追求食品動物養(yǎng)殖的經(jīng)濟利益，越來越多的企業(yè)在動物飼養(yǎng)及治療過程中濫用激素類、抗病毒類以及β-受體激動劑類獸藥。但人類長期食用含有這些獸藥的肉制食品，會導致獸藥在人體累積，擾亂機體的激素平衡，引起藥物中毒，抑制機體的免疫作用，對人體健康極為不利。

目前，國內(nèi)外對于獸藥殘留的檢測方法主要有液相色譜法[1]、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[2]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[3 - 4]等?，F(xiàn)有前處理技術(shù)主要有固相萃取[5]、基質(zhì)固相分散[6 - 7]、超聲波輔助提取[8]、QuECHERS技術(shù)[9 - 12]、中空纖維素膜技術(shù)[13 - 14]等。QuEChERS方法的基本原理是利用吸附劑填料與基質(zhì)中的雜質(zhì)相互作用，吸附基質(zhì)中的雜質(zhì)從而達到除雜凈化的目的。中空纖維素膜技術(shù)已廣泛用于化工、生物工程和環(huán)保等領(lǐng)域，其原理主要是利用具有特殊選擇透過性的有機高分子材料或無機材料，形成不同形態(tài)的膜，對目標物進行分離或凈化。目前，尚未見對畜禽產(chǎn)品中獸藥檢測采用QuEChERS與中空纖維素膜凈化相結(jié)合進行樣品前處理的報道。

本研究基于畜禽產(chǎn)品中的豬肉樣品基質(zhì)特點，將QuEChERS方法與中空纖維素膜凈化相結(jié)合對樣品進行前處理，與單一使用QuEChERS方法相比，本實驗中樣品的前處理方法能夠更好地降低樣品的基質(zhì)效應，提高獸藥的回收率。將處理后的樣品上機，采用超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜法(UPLC-QTrap MS/MS)對豬肉中33種獸藥殘留同時進行檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

Agilent1290 Infinity Ⅱ超高效液相色譜儀(美國)；AB SciexQtrap 6500串聯(lián)三重四極桿-線性離子阱質(zhì)譜儀(美國)；Thermo離心機(美國)；SartoriusCPA 225D分析天平(德國)；EYELAMG-2200氮吹儀(美國)；IKA組織勻漿機(德國)。

標準品：雄烯二酮、丙酸諾龍、諾龍、達那唑、表雄酮、睪酮、美睪酮、群勃龍、氟甲睪酮、寶丹酮、丙酸睪酮、甲睪酮、苯甲酸雌二醇、炔諾酮、17α-羥基孕酮、甲基炔酮、甲羥孕酮、甲地孕酮、美侖孕酮、醋酸氯地孕酮、去氧皮質(zhì)酮、醛固酮、氫化可的松、可的松、甲基潑尼松龍、馬賁特羅、馬布特羅、溴布特羅、克侖特羅、特布他林、萊克多巴胺、金剛烷胺、咪喹莫特，均購自Alta Sientific公司，純度均大于98%。乙腈、甲醇、甲酸為色譜純；十八烷基硅烷(C18)填料、乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)填料、中性Al2O3填料、中空纖維素膜，均購自天津博納艾杰爾公司。

豬肉樣品購于本地市場。

1.2 標準溶液的配制

標準品儲備液：將體積為1 mL的100 μg·mL-1單標溶液用乙腈稀釋為10.0 μg·mL-1的儲備液，置于10 mL棕色容量瓶中，于4 ℃冰箱中保存。混合標準溶液：根據(jù)需要取相應量的標準品儲備液于100 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容、搖勻，置于4 ℃冰箱中保存。

1.3 樣品前處理

取2.0 g肉糜樣品，置于50 mL離心管中，加入5 mL乙腈，經(jīng)均質(zhì)機均質(zhì)。另取5 mL乙腈清洗均質(zhì)機，將兩次均質(zhì)后的乙腈混合，渦旋混勻1 min后，超聲20 min，9 000 r·min-1離心10 min。取6 mL上清液，置于15 mL凈化管中(300 mg C18+150 mg PSA)，渦混1 min，4 000 r·min-1離心5 min。取5 mL上清液，在45 ℃下，采用氮氣吹干儀濃縮至1 mL，取0.5 mL濃縮液，轉(zhuǎn)移至聚丙烯中空纖維素膜組件中，4 000 r·min-1離心5 min，收集濾液，待測。

1.4 儀器條件

色譜條件：色譜柱為AgelaVenusil MP C18柱(50×3.0 mm i.d.，3 μm)，柱溫為25 ℃，樣品室溫度為室溫，進樣體積為5 μL，流速為0.4 mL·min-1，流動相為0.1%甲酸水溶液(A)和0.1%甲酸乙腈溶液(B)，梯度洗脫程序為：3%B(0～1.0 min)，15%～75%B(1.1～9.5 min)，95%B(9.6～11.5 min)，3%B(11.6～13.5 min)。

質(zhì)譜條件：離子源采用Turbo VTM離子源，電噴霧正電離源(ESI+)，氣簾氣25 psi，霧化氣50 psi，輔助加熱氣60 psi，霧化電壓5 500 V，離子源溫度550 ℃。33種獸藥的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 33種獸藥的質(zhì)譜參數(shù)

(續(xù)表1)

SerialnumberCompoundRetention time(min)Ion pair(m/z)Declustering potential(V)Collision energy(eV)19Desoxycorticosterone7.63331.2/97.1*331.2/109.190283020Methyl testosterone7.84303.2/109.1*303.2/97.190343021Androstenedione7.94287.2/97*287.2/10910726302217alpha-Hydroxyprogesterone8.01331.3/97.1*331.3/109.197283323Melengestrol8.31355.2/279.2*355.2/221.270265124D-(-)-norgestrel8.4313.3/109.1*313.3/245.2100342325Epiandrosterone8.42291.2/255.1*291.2/273.27017926Megestrol8.43343.2/325.3*343.2/267.260202527Medroxyprogesterone8.71345.3/123.1*345.3/9780313028Mesterolone8.88305.1/269.2*305.1/173.2120223029Danazol9.56338.3/148.1*338.3/120.130313530Chlormadinone9.63405.2/309.2*405.2/345.370221731Nadrolone propionate10.61331.2/109.2*331.2/145.145333032Testosterone propionate10.82345.3/109.1*345.3/97.110032283317beta-Estradiol-benzoate10.91377.2/105.1*377.2/135.2692420

*Quntification ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測條件的選擇

圖1 33種獸藥混合標準的提取離子色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatogram of mixed standard solution of 33 veterinary drugs20 ng·mL-1,1-33:the names of the substances are shown in Table 1.

本實驗中雄激素類、雌激素類、孕激素類、糖皮質(zhì)激素類藥物均屬于弱極性或中等極性藥物，易溶于乙腈。β-受體激動劑類、抗病毒類藥物屬于水溶性藥物，易溶于水。所以本實驗選擇乙腈和水的混合體系作為流動相，并在流動相中加入0.1%甲酸，以提供質(zhì)譜離子化時所需的H+，保證化合物在質(zhì)譜下的離子化?？紤]到目標物的極性差異較大，為了保證分析物能夠很好地分離，采用梯度洗脫程序，經(jīng)過實驗，確定具體洗脫程序見1.4節(jié)。

根據(jù)33種獸藥的化學性質(zhì)，質(zhì)譜電離條件采用電噴霧正電離源(ESI+)。在正離子模式下，首先進行母離子掃描，確定待測藥物的母離子，然后對其進行子離子掃描，確定其中豐度最強的兩個子離子作為監(jiān)測離子，優(yōu)化子離子的去簇電壓及碰撞能量，結(jié)果見表1。采用本實驗所建立的液-質(zhì)檢測方法對標準品進行檢測，33種獸藥的提取離子色譜圖見圖1。

2.2 樣品前處理方法的優(yōu)化

將33種獸藥的混合標準溶液(每種獸藥的濃度均為5.0 ng·mL-1)加入到空白的豬肉樣品中，以此作為樣品溶液，對QuEChERS方法中采用的提取溶劑和凈化填料以及中空纖維素膜進行了選擇。

2.2.1提取溶劑的優(yōu)化針對所檢測的33種獸藥的性質(zhì)，考察了乙腈/水(體積比90∶10)、乙腈/水(體積比75∶25)、0.1%甲酸乙腈溶液、乙腈四種提取溶劑對獸藥回收率的影響。實驗結(jié)果表明，其中9種獸藥的回收率有較為顯著的差異(圖2)，其余獸藥的回收率在60%～120%之間。結(jié)果表明以乙腈作為提取溶劑，提取效果優(yōu)于其它3種提取溶劑的提取效果。

2.2.2凈化填料的優(yōu)化實驗先分別考察了PSA、C18、Al2O3單一填料對目標物的吸附情況，發(fā)現(xiàn)PSA對目標物的吸附影響最低，所以選擇PSA作為基本填料，再分別加入一定量的C18和Al2O3吸附劑組成混合填料。實驗結(jié)果表明，使用PSA時獸藥的回收率在62.8%～91.4%之間；使用PSA和C18混合填料時回收率在72.3%～97.7%之間，使用PSA和Al2O3混合填料時回收率在49.8%～83.3%之間，所以PSA和C18混合填料的凈化效果最好。然后對PSA和C18混合填料的比例，分別為1∶1、1∶2、1∶3、2∶1、3∶1 時獸藥的回收率進行考察，結(jié)果表明，采用以上混合比例時，33種獸藥的回收率范圍分別為72.3%～97.7%、77.5%～101.2%、70.8%～108.2%、66.4%～94.7%、61.7%～95.8%。從以上數(shù)據(jù)來看，當PSA與C18混合填料比例為1∶2時，33種獸藥的回收率最好。

2.2.3中空纖維素膜的選擇實驗考察了樣品溶液在上機檢測前分別經(jīng)過0.22 μm濾膜和中空纖維素膜過濾凈化后的效果，通過對比兩種情況下獸藥的提取離子色譜圖(圖3)，發(fā)現(xiàn)咪喹莫特等大部分獸藥經(jīng)中空纖維素膜過濾后的響應值明顯高于經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后響應值，藥物的回收率更高。

本實驗采用的中空纖維素膜是在膜的孔表面接枝上丙烯酸基團的聚丙烯中空纖維超濾膜，丙烯酸基團的接枝進一步縮小膜孔的直徑，可以達到接近納濾的作用，可以以物理過濾的方式去除樣品中大分子量雜質(zhì)。因此，在肉類基質(zhì)的獸藥殘留檢驗中，它比傳統(tǒng)的濾膜具有更加徹底的凈化效果，降低基質(zhì)效應，提高獸藥的回收率。

圖2 9種獸藥經(jīng)四種提取溶劑分別提取后的回收率Fig.2 The recoveries of 9 veterinary drugs extracted by four different extraction solvents

圖3 33種獸藥過不同膜的提取離子色譜圖(5 ng·mL-1)Fig.3 Extracted ion chromatograms of 33 veterinary drugs by different membrane(5 ng·mL-1)

2.3 方法學驗證

配制濃度為0.5～80.0 ng·mL-1的基質(zhì)匹配標準工作液進行測定，以獸藥標準色譜峰峰面積(y)對其相應濃度(x)進行回歸分析，得到標準曲線的回歸方程和線性范圍。其中，金剛烷胺、甲基潑尼松龍、醛固酮3種獸藥為2.0～80.0 ng·mL-1，其余30種獸藥為0.5～80.0 ng·mL-1，相關(guān)系數(shù)r為0.9901～0.9995。

在豬肉的空白樣品中添加33種獸藥的混合標準溶液，制成0.5、2.0和10 μg·kg-1的3個添加水平的加標樣品(其中金剛烷胺、甲基潑尼松龍和醛固酮為2.0和10 μg·kg-1的2個添加水平)，按建立的分析方法進行測定。除去馬布特羅在添加水平為0.5 μg·kg-1時回收率為57.1%，其余獸藥在不同添加水平時的回收率為60.9%～102.3%，RSD為1.7%～22.8%。按照國家標準(GB/T27404-2008)[15]中對被測組分含量<0.1 mg·kg-1時回收率需達到60%～120%的要求，除馬布特羅在加標為0.5 μg·kg-1時回收率偏低，其余獸藥的回收率滿足國家標準的要求。以每種獸藥能夠被定量測定的最低限作為定量限，金剛烷胺、甲基潑尼松龍和醛固酮的定量限為2.0 μg·kg-1，其余為0.5 μg·kg-1，以3倍信噪比作為儀器檢出限，檢出限范圍為0.03～0.57 μg·kg-1。能夠滿足中國、日本、歐盟的食品安全標準要求。33種獸藥的線性回歸方程、定量限和回收率見表2。

表2 33種獸藥的線性回歸方程、定量限和回收率(n=6)

(續(xù)表2)

CompoundLinear equationLOD(μg·kg-1)LOQ(μg·kg-1)0.5 μg·kg-12.0 μg·kg-110.0 μg·kg-1Recovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)Bromobuteroly=1.62×106x+2.30×1050.030.585.911.778.53.082.010.9Lmiquimody=9.42×106x-6.97×1050.040.587.18.685.42.589.54.6Mabuteroly=2.88×106x-4790.050.557.110.765.74.479.013.2Mapenteroly=3.95×106x-2.65×1050.100.572.212.680.12.587.216.3Methylprednisoloney=3.75×104x-5.80×1030.572.0//82.411.089.913.7Aldosteroney=1.65×104x-4.92×1030.252.0//86.26.984.17.8Hydrocortisoney=1.99×105x-1.22×1040.070.562.46.979.510.591.83.4Cortisoney=3.04×105x+1.05×1040.040.569.72.285.315.989.66.8Fluoxymesteroney=1.75×105x+4.70×1030.080.582.47.192.42.890.82.9Trenboloney=5.99×105x-1.25×1040.090.574.05.089.22.991.65.2Boldenoney=5.99×105x+5.97×1030.030.584.85.890.82.592.54.4Nortestosteroney=3.99×105x+5.22×1030.090.586.37.689.32.490.13.0Testosteroney=7.89×105x-7.04×1030.040.581.23.778.812.987.64.3Norethindroney=2.63×105x+1.05×1040.060.584.95.690.52.087.33.7Desoxycorticosteroney=8.09×105x+2.91×1030.030.565.24.770.23.789.42.8Methyl testosteroney=4.98×105x+2.33×1040.030.583.75.5102.37.790.03.1Androstenedioney=1.35×106x+6.01×1030.050.589.23.986.16.192.73.017alpha-Hydroxyprogesteroney=5.14×105x-4.42×1040.050.587.84.396.53.892.82.7Melengestroly=7.80×105x-4.00×1030.030.571.311.587.72.789.22.2D-(-)-norgestrely=2.88×105x+9.95×1030.090.588.15.392.67.490.66.1Epiandrosteroney=2.16×105x-4.47×1030.150.561.619.071.42.885.97.2Megestroly=5.02×105x-8.51×1040.120.585.712.090.39.786.73.6Medroxyprogesteroney=1.10×106x-2.41×1040.060.584.23.192.51.790.24.9Mesteroloney=2.83×105x-1.17×1040.090.582.74.285.53.385.66.9Danazoly=1.49×105x-4.66×1030.060.581.45.588.52.086.012.5Chlormadinoney=2.88×105x+5420.030.567.15.880.32.687.113.9Nadrolone propionatey=2.45×105x+1.85×1050.080.574.54.977.76.086.41.7Testosterone propionatey=6.31×105x+1.28×1050.040.575.72.688.15.485.49.517beta-Estradiol-benzoatey=1.51×105x+1.31×1050.140.576.85.082.96.394.56.5

圖4 克倫特羅的提取離子色譜圖Fig.4 Extracted ion chromatogram of Clenbuterol

2.4 實際樣品檢測

應用本研究建立的分析方法對市售豬肉樣品進行了33種獸藥的篩查檢測，檢測結(jié)果為(μg·kg-1)：特布他林0.9，克倫特羅1.6，丙酸睪酮2.5，其它30種獸藥未檢出，圖4為克倫特羅檢測圖。由檢測結(jié)果可知，部分獸藥殘留在豬肉產(chǎn)品中，對人們的身體健康具有潛在的危害。

3 結(jié)論

本研究將QuEChERS方法與中空纖維素膜凈化相結(jié)合，建立了一種新型的樣品前處理技術(shù)，在對液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，利用超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀，建立了可同時檢測33種獸藥的分析方法。該方法的靈敏度高、分析速度快，節(jié)約成本，可滿足實驗室對豬肉樣品日常檢驗分析的要求。