陳治東，管世鶴，楊 凱，張 浩，姚 杰，程婉秋

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是一種雙鏈DNA嗜肝病毒，感染人體后引起急慢性肝炎、肝纖維化、肝硬化甚至肝癌[1-2]。目前，全球約有2.48億感染人群，其中我國慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者約為2 000萬[3-6]。研究[6]表明，HBV感染介導(dǎo)的間接免疫損傷是急慢性肝炎發(fā)病及病情進展重要機制。其中，以肝臟免疫細胞激活及其相關(guān)細胞因子分泌為特征的機體固有免疫，在HBV感染早期發(fā)揮重要作用[1]?？莘窦毎?Kupffer cells， KC)作為肝臟巨噬細胞，其激活不僅參與CHB患者肝臟固有免疫，還在抗病毒治療過程發(fā)揮重要功能[7]。CD68是一種糖基化跨膜蛋白，在人體單核細胞和組織巨噬細胞均有表達，其含量與細胞激活狀態(tài)密切相關(guān)，常用于研究巨噬細胞功能。據(jù)報道，HBV及其結(jié)構(gòu)蛋白能通過肝臟CD68陽性細胞NF-κB信號途徑進而上調(diào)白介素(IL)-1β、IL-6、趨化因子配體8(chemokine cc-motif ligand 8，CXCL8)和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)等細胞因子分泌[2]。然而，目前關(guān)于CHB患者CD68 含量及其與HBV感染關(guān)系尚未明。該研究擬通過分析比較CHB患者和健康對照者血清CD68分子含量及其與肝功能指標(biāo)及HBV血清學(xué)標(biāo)志物間關(guān)系，同時檢測CHB患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)及肝組織CD68的表達情況，以探討CD68能否作為評估CHB患者肝臟損傷程度及HBV病毒載量的免疫學(xué)指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1試劑和儀器 人CD68分子檢測試劑盒購自上海源葉生物科技有限公司；HBV DNA定量和HBV基因分型診斷試劑盒購自上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司；密度梯度分離液購自天津灝洋華科生物科技有限公司；RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Thermo scientific公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)試劑盒購自日本TaKaRa公司；CD68單克隆抗體購自美國Bioworld technology公司；CD68 mRNA引物購自生工生物工程上海股份有限公司；二抗及免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；熒光定量PCR儀Agilent M×3000P購自美國Stratagene公司；酶標(biāo)儀KHB ST-360購自上?？迫A實驗系統(tǒng)有限公司。

1.1.2病例資料 選取慢性乙型肝炎患者共計78例，男53例，女25例。按照《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》慢性乙型肝炎診斷標(biāo)準(zhǔn)：既往有乙型肝炎病史或乙肝表面抗原(HBsAg)陽性超過6個月。

排除標(biāo)準(zhǔn)：① HIV病毒、丙型肝炎病毒及其它種類病毒感染者；② 酒精性肝炎、藥物性肝損傷、肝臟內(nèi)外與膽管有梗阻或者占位病變；③ 較嚴重肝硬化及肝癌；④ 感染性疾病、心血管疾病、內(nèi)分泌疾病、惡性腫瘤；⑤ 自身免疫性肝病、原發(fā)性硬化性膽管炎及其它自身免疫性疾??；⑥ 接受免疫增強或者免疫抑制藥物治療。選擇同期體檢人群健康者84例作為健康對照組。

1.2方法

1.2.1肝功能指標(biāo)及HBV相關(guān)指標(biāo)定量檢測 肝功能指標(biāo)、甲胎蛋白(alpha fetal protein,AFP)及HBV血清學(xué)指標(biāo)分析分別由西門子全自動生化分析儀Dimension? EXLTMwith LM、羅氏全自動電化學(xué)發(fā)光分析儀Cobas e602和雅培全自動化學(xué)發(fā)光分析儀i4000 SR檢測。HBV DNA定量和分型檢測操作按照檢測試劑盒說明書步驟。本研究所有涉及指標(biāo)檢測在安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科完成，且試劑、質(zhì)控品、定標(biāo)品均在有效期之內(nèi)。

1.2.2血清CD68分子測定 按照檢測試劑盒說明書步驟，標(biāo)準(zhǔn)品孔加不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品50 μl；樣本孔加待測樣品10 μl，再加稀釋液40 μl；加入酶標(biāo)記抗體100 μl，封板，37 ℃溫育60 min后洗板；加入底物A、B各50 μl，37 ℃避光孵育15 min后，加終止液50 μl，15 min內(nèi)使用酶標(biāo)儀KHB ST-360在波長450 nm處測定各孔的OD值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按照曲線方程計算各樣本濃度值。

1.2.3實時熒光定量PCR檢測PBMC 中CD68 mRNA 水平 TRIzol法提取PBMC總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。CD68上游引物：5′-CATTCCCCTATGGACACCTCA-3′，下游引物：5′-GTCTCCGGATGATGCAGAAAG-3′；β-actin上游引物：5′-CCTGGCACCCAGCACAAT-3′，下游引物：5′-GGGCCGGACTCGTCATAC-3′。擴增程序：37 ℃ 2 min；94 ℃保溫2 min；94 ℃ 15 s→56 ℃ 45 s，循環(huán)40次；72 ℃ 5 min。56 ℃采集熒光信號。

1.2.4免疫組織化學(xué)染色檢測PBMC及肝組織CD68的表達 PBMC細胞染色：PBMC置于潔凈載玻片，0.4%多聚甲醛固定20 min。0.5%Triton X-100通透20 min。3%H2O2孵育15 min。加預(yù)稀釋CD68單克隆抗體，37 ℃孵育60 min。加二抗，37 ℃孵育30 min。加二氨基聯(lián)苯胺(DAB)，室溫下避光孵育3 min。95%乙醇1 min，無水乙醇1 min加少量樹脂封片。

免疫組化：肝穿組織組織切片后脫蠟、抗原修復(fù)，3%H2O2浸泡10 min，血清封閉37 ℃溫箱30 min；加一抗(1 ∶100)37 ℃溫箱90 min，加酶標(biāo)二抗37 ℃ 30 min，加DAB顯色劑；沖洗后，蘇木精復(fù)染30 s；依次放入70%酒精、80%酒精、90%酒精、95%酒精、100%酒精、100%酒精、二甲苯、二甲苯；中性樹膠封片。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 16.0軟件進行分析，兩組定量數(shù)據(jù)和定性數(shù)據(jù)分別采用t檢驗或χ2檢驗；相關(guān)性分析采用Pearson檢驗。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1人口學(xué)特征及實驗室指標(biāo)本研究納入CHB組78例，健康對照組84例，兩組年齡及性別無統(tǒng)計差異無統(tǒng)計學(xué)意義。CHB組丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransaminase，AST)、谷酰轉(zhuǎn)肽酶(gamma-glutamyl transpeptidase，GGT)、總膽紅素(total bilirubin，TBIL)、直接膽紅素(direct bilirubin，DBIL)顯著高于健康對照組，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、AFP無顯著差異。見表1。

表1 研究對象基線資料

2.2血清CD68含量與HBV血清學(xué)指標(biāo)相關(guān)性分析CHB組血清CD68含量明顯高于健康對照組(P<0.001)，且與HBV DNA載量的增高趨勢相一致，即CHB組血清CD68與HBV DNA呈正相關(guān)性(r=0.355 0,P=0.001 4)，而與HBsAg含量無顯著相關(guān)性(r=0.085,P=0.459)。進一步分析CD68與HBV基因型、乙肝e抗原(HBeAg)(-/+)相關(guān)性顯示，B型(40例)和C型(38例)CHB患者血清CD68含量分別為(0.188±0.033) pg/L、(0.196±0.027) pg/L，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.215)；HBeAg(+)與HBeAg(-)CHB患者血清CD68含量分別為(0.186±0.043)pg/L、(0.195±0.020)pg/L，差異亦無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.200)。見圖1。

2.3血清CD68水平與肝功能關(guān)系相關(guān)性分析ALT、AST、TBIL、DBIL、GGT和ALP是評估肝臟損傷程度常用的生化指標(biāo)，尤其ALT和AST在慢性乙型肝炎臨床分期和治療中具有重要意義。通過分析CHB組血清CD68與肝臟損傷指標(biāo)顯示，血清CD68與ALT和AST均呈正相關(guān)性(r=0.345 0,P=0.002 0；r=0.328 9,P=0.003 3)，而與其它肝臟生物化學(xué)指標(biāo)TBIL、DBIL、GGT、ALP間無顯著相關(guān)性。見圖2。

2.4PBMC中CD68mRNA表達RT-PCR檢測結(jié)果顯示，CHB組患者PBMC CD68 mRNA相對表達量為(15.71±15.04)，健康對照者PBMC CD68 mRNA相對表達量為(13.95±14.01)；兩組間相對表達量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.668 0)。

2.5肝組織及PBMC中CD68表達免疫組化染色結(jié)果顯示，CD68陽性細胞呈棕褐色，正常肝組織未見，CHB患者肝組織CD68表達明顯升高，主要分布于門脈及肝小葉內(nèi)，見圖3A、3B。此外，CD68均可見于CHB患者與健康對照者PBMC，呈低表達，且無明顯差異，見圖3C、3D。

圖1 血清CD68含量與乙肝血清學(xué)指標(biāo)關(guān)系

A:健康對照組與CHB組患者血清CD68表達水平比較；與健康對照組比較：***P<0.0001；B:CHB患者血清CD68含量與HBV DNA載量相關(guān)性分析；C: CHB患者血清CD68含量與HBV基因分型對應(yīng)關(guān)系；D: CHB患者血清CD68含量與HBeAg狀態(tài)對應(yīng)關(guān)系

圖2 CHB組CD68含量與肝功能指標(biāo)關(guān)系A(chǔ):CHB組CD68含量與ALT相關(guān)性分析；B:CHB組CD68含量與AST相關(guān)性分析

圖3 肝組織及PBMC免疫組化染色結(jié)果

A：CHB患者肝組織 ×1 000；B：對照組肝組織 ×1 000；C：CHB患者PBMC ×400；D：對照組PBMC ×400；紅色箭頭：肝組織中CD68陽性細胞呈棕褐色；藍色箭頭：PBMC

3 討論

慢性乙型肝炎病毒感染過程是HBV復(fù)制和宿主免疫反應(yīng)之間相互作用的動態(tài)過程。肝臟免疫功能依賴于其組織結(jié)構(gòu)，包括肝細胞、KC、NK細胞、NKT細胞等固有免疫細胞組成復(fù)雜肝臟免疫系統(tǒng)。其中KC約占肝臟非實質(zhì)細胞的30%以上，數(shù)量顯著高于T細胞，在HBV感染初期憑借誘導(dǎo)炎性細胞因子干攏素α(IFN-α)和IL-6發(fā)揮重要的固有免疫功能[8]。CD68分子是巨噬細胞的重要表面標(biāo)記，常用于巨噬細胞鑒定和功能研究。目前，已明確CD68在HBV相關(guān)慢加急性肝衰竭、自身免疫性肝病、瘧疾、腫瘤等疾病當(dāng)中均能發(fā)揮重要免疫功能[9-10]。然而，CD68分子與CHB發(fā)病關(guān)系并未完全闡明。

本研究顯示，CHB組患者血清CD68分子含量明顯高于健康對照組，且與CHB組患者HBV DNA載量呈正相關(guān)性，提示CHB患者體內(nèi)病毒復(fù)制活躍能刺激巨噬細胞激活并釋放CD68分子。這與劉淵 等[11]研究發(fā)現(xiàn)CHB患者肝組織中CD68陽性巨噬細胞數(shù)量明顯高于健康對照組結(jié)論相符 。在動物模型研究中，Kouwaki et al[12]發(fā)現(xiàn)HBV感染早期肝臟F4/80陽性NK細胞產(chǎn)生針對HBV病毒的干擾素-γ。然而，本研究未顯示血清CD68分子含量和HBV血清學(xué)指標(biāo)HBsAg含量及HBeAg狀態(tài)呈顯著相關(guān)性。HBV感染細胞模型研究顯示，HBsAg可以通過CD1d依賴途徑干擾細胞內(nèi)脂質(zhì)環(huán)境進而激活NKT細胞[13]。HBsAg可以選擇性地阻斷JNK -MARK通路，抑制單核/巨噬細胞TLR2配體誘導(dǎo)的IL-12生成，HBV借此逃避免疫清除作用[14]。CD68分子含量在HBV DNA載量與HBsAg含量及HBeAg狀態(tài)存在差異，究其原因可能與HBV分泌的相關(guān)病毒抗原組分誘導(dǎo)肝臟產(chǎn)生免疫抑制效應(yīng)，包括巨噬細胞呈低反應(yīng)性有關(guān)。本地區(qū)流行HBV基因型主要為B型與C型，研究顯示血清CD68分子含量B型、C型CHB患者間無顯著差異。該兩種基因型HBV均可刺激巨噬細胞活化并增加機體CD68分子釋放。血清ALT與AST是臨床評估肝臟功能最常用的診斷指標(biāo)，血清CD68含量與ALT、AST明顯正相關(guān)。即CHB患者血清CD68含量隨ALT和AST升高而逐漸升高，提示CD68與CHB患者肝臟免疫損傷及疾病嚴重程度也密切相關(guān)。

此外，本研究顯示PBMC CD68 mRNA和蛋白的表達在CHB患者與健康對照者間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在PBMC中表達CD68 的單個核細胞較少，其表達的mRNA 量也比較少。CD68在PBMC 與血清中差異性表達，提示血清中高表達CD68分子可能源于PBMC外細胞分泌。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，CD68在CHB患者肝組織的表達升高，主要分布于門脈及肝小葉區(qū)域，推測升高CD68可能體現(xiàn)HBV感染后巨噬細胞在肝臟局部微環(huán)境中增殖分化，通過調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答反應(yīng)，參與慢性乙型肝炎疾病發(fā)展。

總之，免疫學(xué)標(biāo)志物與疾病進展及抗病毒療效日益受到關(guān)注。本研究結(jié)果表明，CD68分子除了可作為巨噬細胞表面標(biāo)志物，還可能通過參與病毒復(fù)制和肝臟免疫，具有潛在評估CHB患者臨床診療新型指標(biāo)。后續(xù)從HBV感染誘導(dǎo)巨噬細胞分泌CD68分子機制入手，深入研究HBV與機體固有免疫相互作用關(guān)系，并探討抗病毒治療過程中CD68含量的動態(tài)變化，以闡明巨噬細胞CD68分子在病毒感染、復(fù)制及抗病毒治療中可能存在的效應(yīng)機制，為最終揭示HBV致病機制奠定理論基礎(chǔ)。