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(1.西南科技大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院， 四川 綿陽 621010；2.四川德培源中藥科技開發(fā)有限公司， 四川 綿陽 621000)

細(xì)胞遺傳學(xué)主要研究染色體結(jié)構(gòu)，是遺傳學(xué)的重要分支。核型分析研究包括染色體出現(xiàn)時間、染色體數(shù)目及大小、著絲粒位置等染色體信息研究[1]。因為染色體的結(jié)構(gòu)、大小及倍性差異導(dǎo)致不同的表型性狀，不同的植物群體具有特定的核型特征，甚至來源于不同環(huán)境的同一物種也表現(xiàn)出獨特的核型特征[2]。因此染色體特征及其他核型結(jié)構(gòu)研究也是區(qū)分植物遺傳多樣性的有效手段。此外，核型分析對物理圖譜構(gòu)建、目的基因遺傳定位、系統(tǒng)親緣關(guān)系等研究具有重要作用[3]。

北柴胡(BupleurumchineseDC.)為傘形科(Umbellifetae)柴胡屬多年生草本植物，是《中華人民共和國藥典》2015版規(guī)定的正品柴胡基源植物。柴胡作為傳統(tǒng)的中藥材，具有和解表里、疏肝升陽、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、保肝、止咳等功效。因其需求量的不斷增加，我國柴胡野生資源日漸減少，導(dǎo)致我國目前正面臨著柴胡藥用資源短缺的問題[4-6]。同時目前柴胡藥材市場種質(zhì)混亂、產(chǎn)量和質(zhì)量參差不齊，開展系統(tǒng)柴胡基源鑒定，保障柴胡正品用藥極為重要[7]。本研究擬采用新型植物染色體制片方法研究剪根時間、取樣根長、笑氣處理時間及酶解時間對染色體制片效果的影響，以期系統(tǒng)探索北柴胡根尖細(xì)胞核型分析的最佳條件，為柴胡染色體鑒定與分析提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

本研究供試材料采用北柴胡審定新品種川北柴1號(川審藥2015004)。川北柴1號種子由四川德培源中藥科技開發(fā)有限公司提供。

1.2 方 法

1.2.1 材料預(yù)處理與染色體制片

將供試柴胡種子置于25 ℃培養(yǎng)箱中萌發(fā)，待植株胚根長至0.5～1.5 cm時剪取并裝入0.5 mL容量的EP管中以獲得根尖分生組織。將帶新鮮樣品的EP管置于密閉空間進行笑氣(N2O)處理，處理完成后取出胚根，乙酸浸泡5 min后析出。將樣品注入75%乙醇后置于4 ℃條件保存?zhèn)溆谩?/p>

注：A、B為笑氣處理2 h。C、D、E為笑氣處理3 h。E、G為笑氣處理4 h。H、I為笑氣處理5 h。 圖1 笑氣處理時間對柴胡根尖細(xì)胞分裂狀態(tài)的影響

制片前取出固定后保存的北柴胡胚根，用滅菌雙蒸水漂洗掉乙醇。取20μL體積的無菌檸檬酸三鈉緩沖液(含4%的纖維素酶和2%的果膠酶)，分裝于0.2 mL的EP管中。利用干燥濾紙吸干清洗后的北柴胡胚根表面水分，用刀片切取2 mm長的乳白色根尖分生區(qū)，將分生區(qū)組織浸沒于酶解液中，并37 ℃水浴34～42 min。水浴結(jié)束后，利用雙蒸水稀釋漂洗酶液2次后吸干EP管內(nèi)水分，并注入無水乙醇控干。

制片時，將脫水控干的根尖樣品注入乙酸并搗碎后，吸取10μL含組織樣品的乙酸溶液滴于載玻片上，經(jīng)苯酚品紅染色后壓片。制片完成后使用電子顯微鏡(OLYMPUS BX 51)觀察拍照。

1.2.2 剪根時間

剪根取樣時間為08：00—18：00時，每1 h為1個時間段，每個時間段內(nèi)，隔15 min剪根取樣1次。

1.2.3 剪根時胚根長度

北柴胡胚根根尖取樣長度分別為小于0.5 cm、0.5～1 cm、1～1.5 cm、大于1.5 cm，共4個分組。

1.2.4 笑氣處理時間

笑氣處理時間分別為2，3，4，5 h，共4個時間處理。

1.2.5 酶解時間

酶解時間分別設(shè)置為34，36，38，40，42 min。

1.2.6 制片效果鑒定

對不同條件的制片進行鏡檢與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 取樣時間對分裂項效果的影響

在各取樣時間段中，09：00—10：00時和16：00—17：00時2個時間段內(nèi)超過10%的北柴胡根尖細(xì)胞都處于有絲分裂期，該時期根尖細(xì)胞分裂最為旺盛(表1)。而其他時期處于有絲分裂時期的細(xì)胞較少，且很難識別清晰的染色體形態(tài)。

表1 剪根時間對北柴胡分裂項數(shù)目的影響

剪根時間分裂項數(shù)目剪根時間分裂項數(shù)目08:00—09:00+13:00—14:00+09:00—10:00+++14:00—15:00+10:00—11:00++15:00—16:00++11:00—12:00+16:00—17:00+++12:00—13:00++17:00—18:00+

注：“+”數(shù)量代表有絲分裂程度。下同。

注： A為酶解34 min；B為酶解36 min；C為酶解38 min；D為酶解40 min。圖2 酶解時間對北柴胡根尖細(xì)胞染色體制片的影響

2.2 剪根時胚根長度對分裂項數(shù)目的影響

胚根生長長度的取樣實驗中，主胚根長至0.5～1 cm時，北柴胡根尖處于有絲分裂期且染色體清晰可見的細(xì)胞最多，其他生長長度的取材觀察結(jié)果皆次于該長度(表2)。

表2 北柴胡主胚根生長長度對根尖細(xì)胞分裂狀態(tài)的影響

胚根長度(cm)分裂項數(shù)目胚根長度(cm)分裂項數(shù)目 <0.5++0.5～1+++1～1.5++>1.5+

2.3 笑氣處理時間對分裂項效果的影響

笑氣處理2 h時，細(xì)胞內(nèi)形態(tài)較長、相互纏繞，不便于計數(shù)，該時期染色體聚集程度較高(表3，圖1)。處理3 h時，染色體長度縮短，但染色體有重疊。笑氣處理4 h時，根尖細(xì)胞染色體長度適中，染色體間鮮有重疊，便于計數(shù)觀察；笑氣處理5 h時，染色體長度進一步縮短。

2.4 酶解時間對根尖細(xì)胞分裂項效果的影響

對北柴胡根尖細(xì)胞纖維素酶和果膠酶處理，處理時間34 min時，根尖細(xì)胞內(nèi)染色質(zhì)呈無序絲狀聚集，難以觀察到清晰的染色體結(jié)構(gòu)(圖2)。酶解36 min時，少部分細(xì)胞染色體開始分散，并呈現(xiàn)獨立的染色體結(jié)構(gòu)。酶解38 min時，大部分根尖細(xì)胞內(nèi)能觀察到獨立分散的染色體結(jié)構(gòu)，僅有少部分細(xì)胞仍為無序絲狀聚集。酶解40 min時，制片觀察視野內(nèi)，染色體分散程度好最易于染色體觀察。

表3 N2O處理時間對北柴胡根尖細(xì)胞分裂狀態(tài)的影響

笑氣處理時間(h)分裂項效果染色體形態(tài)2 +長,絲狀,卷曲,纏繞3++較長,部分纏繞4+++長度適中,棒狀,分散較好5+極短棒狀

表4 酶解時間對北柴胡根尖細(xì)胞染色體制片的影響

酶解時間 (min) 分裂項效果染色體分散情況34+染色質(zhì)呈絲狀聚集36++部分染色體未分散開,少部分仍聚集呈絲狀38++大部分染色體已分散,可以觀察到獨立結(jié)構(gòu)40+++染色體完全分散開,易于觀察42+染色體極易被沖散

3 討論與結(jié)論

染色體制片技術(shù)是細(xì)胞遺傳學(xué)的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)，從取樣到制片的每一個環(huán)節(jié)都可能影響制片效果。此外，染色體較小的植物物種根尖組織更難觀察到清晰的染色體形態(tài)，甚至在有絲分裂中期都很難區(qū)分獨立的染色體結(jié)構(gòu)，因此制片技術(shù)的具體處理對染色體準(zhǔn)備極其重要[3]。理論上，植株根尖取樣后的任何時期都能觀察到有絲分裂中期狀態(tài)的細(xì)胞，但如處于有絲分裂中期狀態(tài)的細(xì)胞太少，進一步的核型分析很難實現(xiàn)。本研究通過剪根時間、取樣根長、笑氣處理時間及酶解時間對北柴胡的染色體制片技術(shù)進行系統(tǒng)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，北柴胡胚根長至0.5～1 cm時，在09：00—10：00時和16：00—17：00時2個時段分裂最為旺盛，最適宜于剪根取樣；在對根尖進行處理時，笑氣處理3～4 h，酶解40 min的細(xì)胞分散程度最佳，且染色體長度適中。梁乾隆等利用常規(guī)壓片技術(shù)進行了中國柴胡屬13種5變種24個居群的染色體數(shù)目及核型研究[8]。其報道北柴胡染色體數(shù)為2 n=12，這與本研究結(jié)果相一致(圖1)。常規(guī)染色體制片技術(shù)中，樣品預(yù)處理需在冰浴條件下進行，其處理時間在24 h以上[9]。此外常規(guī)制片技術(shù)所需的8-羥基喹啉、秋水仙素及α-溴萘等有機試劑均具有毒害作用[10-12]。本研究使用笑氣處理柴胡根尖組織，且處理時間僅需3～4 h，較常規(guī)制片技術(shù)更為安全高效，因此本研究對柴胡核型研究、后期細(xì)胞遺傳學(xué)研究及柴胡道地性系統(tǒng)研究都具有重要意義。因不同物種染色體大小和形態(tài)差異巨大，將本染色體制片技術(shù)應(yīng)用與其他物種時，仍需對各處理進行系統(tǒng)探索以獲得清晰的核型結(jié)構(gòu)。