吳滿良，李冬梅，朱根發(fā)，劉小飛

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所/廣東省園林花卉種質(zhì)創(chuàng)新與利用重點實驗室，廣東 廣州 510640）

紫花山奈（Kaempferia elegans）又名美山奈，屬于姜科（Zingiberaceae）山奈屬（Kaempferia）植物，原產(chǎn)于四川；其植株低矮，根莖匍匐，不呈塊狀，須根細(xì)長，不耐霜凍，冬季地上部分枯死［1-5］；葉卵形或橢圓形，葉面綠色，具深色羽狀彩紋，十分美麗，具有極高的觀賞價值；花紫色，唇瓣2深裂至基部，花期6～10月，常作為夏秋季節(jié)布置花壇的綠化植物和盆栽觀賞植物［1-7］。

姜科植物可采用種子、莖桿扦插、切分根莖、帶葉根莖扦插和組織培養(yǎng)的方法繁殖［6-8］。由于紫花山奈不結(jié)果，故不能進(jìn)行播種繁殖；因沒有莖桿，也不能用莖桿扦插繁殖［9-13］，只能采用切分根莖、帶葉根莖扦插和組織培養(yǎng)的方法繁殖［14-16］。因為母本量不足，限制了切分根莖分株和帶葉根莖扦插的繁殖速度，而且對母株也有損傷［17-20］。山奈屬植物的組織培養(yǎng)，目前僅在海南三七（Kaempferia rotunda）和山奈（Kaempferia galanga）中有成功的報道［8-11］。由于山奈屬植株的多樣性和其外植體滅菌困難，目前，紫花山奈的相關(guān)研究集中在帶葉根莖扦插繁殖和光合特性方面［6-7］，而其組織培養(yǎng)方面的報道鮮見。鑒于此，本研究選取紫花山奈無菌苗的芽基部為外植體，進(jìn)行不同激素類型及配比組合對芽基部增殖、叢生芽誘導(dǎo)以及生根的影響，建立了高效穩(wěn)定的紫花山奈無菌苗芽基部的組培快繁體系，對提高紫花山奈種苗的繁殖速度和在園藝園林上的推廣應(yīng)用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2017年5月在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境園藝研究所白云基地組培樓進(jìn)行，采集紫花山奈的根莖，用自來水清洗干凈，剪掉根莖上的須根，消毒后晾干；再放入洗凈消毒的河沙中，恒溫發(fā)芽；洗凈根莖芽，取其芽基部。將消毒好的芽基部接種到增殖培養(yǎng)基（MS+6-BA 8 mg/L+NAA 0.1 mg/L+椰汁10%+蔗糖30 g/L+卡拉膠粉9.5g/L）培養(yǎng)（圖1A，封二），直至芽基部形成球狀（圖1B，封二），然后切割增殖的芽基部，接種叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS+6-BA 3 mg/L+NAA 0.1 mg/L+椰汁10%+蔗糖30 g/L+卡拉膠粉9.5 g/L）誘導(dǎo)出叢生芽（圖1C，封二）。取無菌苗的芽基部為材料，備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 接種材料處理 在超凈工作臺上，將紫花山奈無菌苗從瓶中取出，置于消毒的碟子中，用刀片切去葉片、莖和根，只留約1 cm的芽基部。每個芽基部大小接近，接種于芽基部增殖培養(yǎng)中。

1.2.2 芽基部增殖培養(yǎng) 設(shè)置6種芽基部增殖培養(yǎng)基，分別為MS+6-BA 8 mg/L+白砂糖30 g/L+卡拉膠粉10 g/L+10%椰汁（A1）、MS+6-BA 10 mg/L+白砂糖30 g/L +卡拉膠粉10 g/L+10%椰汁（A2）、MS+6-BA 12 mg/L+白砂糖30 g/L+卡拉膠粉10 g/L+10%椰汁（A3）、MS+6-BA8mg/L+NAA0.1 mg/L+白砂糖30 g/L +卡拉膠粉10 g/L+10%椰汁（A4）、MS+6-BA10 mg/L++NAA0.1 mg/L+白砂糖30 g/L+卡拉膠粉10 g/L+10%椰汁（A5）、MS+6-BA 12 mg/L+NAA0.1 mg/L+白砂糖30 g/L+卡拉膠粉10 g/L+10%椰汁（A6），pH值均為5.8～6.0。每種增殖培養(yǎng)基接40瓶，每瓶接1個芽基部：培養(yǎng)基滅菌條件125℃，40 min，下同。20 d后觀測芽基部增大倍數(shù)、啟動率、出芽數(shù)和污染率：

1.2.3 叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng) 設(shè)置6種叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，分別為MS+6-BA 3 mg/L+NAA0.05 mg/L+白砂糖30 g/L +卡拉膠粉10 g/L+10%椰汁（B1）、MS+6-BA 4 mg/L+NAA 0.05 mg/L+白砂糖30 g/L +卡拉膠粉10 g/L+10%椰汁，pH 5.8～6.0（B2）、MS+6-BA 5 mg/L+NAA 0.05 mg/L+白砂糖30 g/L +卡拉膠粉10 g/L+10%椰汁（B3）、MS+6-BA 3 mg/L+NAA 0.1 mg/L+白砂糖30 g/L +卡拉膠粉10 g/L+10%椰汁（B4）、MS+6-BA4 mg/L+NAA 0.1 mg/L+白砂糖30 g/L +卡拉膠粉10 g/L+10%椰汁（B5）；MS+6-BA 5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+白砂糖30 g/L +卡拉膠粉10 g/L+10%椰汁（B6），pH值均為5.8～6.0。每種叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基接40瓶，每瓶接1個芽基部，50 d后觀測啟動率、出芽數(shù)以及污染率。

1.2.4 生根培養(yǎng) 繼代叢生芽苗3～5 cm時，切下接種到生根培養(yǎng)基中，每種培養(yǎng)基接種90株。設(shè)置7種培養(yǎng)基進(jìn)行紫花山奈組培苗的生根培養(yǎng)：MS+NAA 0.1 mg/L +香蕉泥10%+活性炭0.5 g/L+白砂糖30 g/L+卡拉膠粉9.5 g/L（C1）、MS+NAA 0.3 mg/L +香蕉泥10%+活性炭0.5 g/L+白砂糖30 g/L +卡拉膠粉9.5 g/L（C2）、MS+NAA 0.5 mg/L +香蕉泥10%+活性炭0.5 g/L +白砂糖30 g/L +卡拉膠粉9.5 g/L（C3）、MS+NAA 0.1 mg/L +香蕉泥15%+活性炭1.0 g/L+白砂糖30 g/L+卡拉膠粉9.5 g/L（C4）、MS+NAA 0.3 mg/L +香蕉泥15%+活性炭1.0 g/L+白砂糖30 g/L +卡拉膠粉9.5 g/L（C5）、MS+NAA 0.5 mg/L +香蕉泥15%+活性炭1.0 g/L+白砂糖30 g/L +卡拉膠粉9.5 g/L（C6）、MS+白砂糖30 g/L +卡拉膠粉9.5 g/L（C7），pH值均為5.8～6.0。20 d后統(tǒng)計生根率、單苗平均根數(shù)、根長和污染率：

1.2.5 培養(yǎng)條件 培養(yǎng)室溫度設(shè)為25～30℃，光照強(qiáng)度為2 000～2 300 lx，光照時間控制為14 h/d。

1.2.6 組培苗的移栽 取出組培苗，洗凈根部培養(yǎng)基，0.1%的百菌清溶液浸泡30 min，移栽到體積比1∶1∶1的進(jìn)口泥炭、紅壤、腐葉土基質(zhì)中。觀察長勢，統(tǒng)計成活率。

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016整理，應(yīng)用SPSS16.0軟件的One-Way ANOVA模塊進(jìn)行方差分析和LSD法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫花山奈芽基部的繼代增殖

從表1和圖2（封二）可以看出，培養(yǎng)20 d后，不同濃度6-BA和NAA的培養(yǎng)基對紫花山奈芽基部增大倍數(shù)和出芽數(shù)有明顯的影響。6種培養(yǎng)基的紫花山奈芽基部污染率均在3.13%以下，芽基部增大倍數(shù)為1.50～1.89倍，出芽數(shù)為0.81～1.74。因此，紫花山柰的有效芽基部繼代增殖，6-BA的濃度范圍為8～12 mg/L，NAA濃度范圍為0～0.1 mg/L。芽基部增大倍數(shù)最大且出芽數(shù)最低的為A4，因此，A4為紫花山奈的最佳芽基部增殖培養(yǎng)基。

表1 紫花山柰芽基部增殖培養(yǎng)結(jié)果

2.2 紫花山奈的叢生芽誘導(dǎo)

由表2可知，6種紫花山奈叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的啟動率均在83%以上，污染率在3.33%以下，出芽數(shù)a等級的為B1，出芽數(shù)為5.53；其次，bc等級的為B3、B4和B5，出芽數(shù)分別為3.50，3.30和4.00；c等級的為B2和B6，出芽數(shù)分別為3.00、3.04。從圖3（封二）還可看出，B1培養(yǎng)基可分化出4～7個叢生芽，葉綠且叢生芽長勢好；B3，B4和B5培養(yǎng)基可分化出3～6個叢生芽；B2和B6培養(yǎng)基可分化出2～5個叢生芽。因此，紫花山奈芽基部的叢生芽誘導(dǎo)，6-BA的適合濃度范圍為3～5 mg/L，NAA的適合濃度范圍為0.05～0.1 mg/L，其中以6-BA 3 mg/L和NAA 0.05 mg/L為最佳，有長勢好、數(shù)量多的叢生芽。

表2 紫花山柰叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)果

2.3 紫花山奈的生根培養(yǎng)

從表3可以看出，C1～C7培養(yǎng)基的生根率均在94%以上，污染率在8.00%以下，平均每株生根數(shù)為a等級：C1和C4培養(yǎng)基的生根數(shù)分別為4.94、4.71條根；平均根長為a和b等級，C4和C1培養(yǎng)基的根長分別為4.18、3.16 cm，其余均為c等級。由圖4（封二）也可以看出，平均每株生根數(shù)最多的為C4和C1。因此，紫花山奈生根比較合適的培養(yǎng)基為MS+NAA 0.1 mg/L+香蕉泥10～15%+活性炭0.5～1.0 g/L+白砂糖30 g/L+卡拉膠粉9.5 g/L。

表3 紫花山柰生根誘導(dǎo)培養(yǎng)結(jié)果

2.4 紫花山奈組培苗移栽

將紫花山奈的組培苗洗凈根部培養(yǎng)基，0.1%的百菌清溶液浸泡30 min，移栽到進(jìn)口泥炭、紅壤、腐葉土的基質(zhì)中，成活率達(dá)80%以上，長勢良好，如圖3D（封二）所示。

3 結(jié)論與討論

由于姜科植物的多樣性，不同姜科植物組培的步驟和培養(yǎng)基也不同。目前，紅姜花、白姜花、海南三七、山奈、土田七、姜黃、春秋姜黃和芒果姜等姜科植物采用不同的外植體［8-13］，如未成熟花絲、花藥、莖尖、葉、葉鞘、塊莖芽、幼嫩根莖和根莖芽基部，進(jìn)行外植體滅菌技術(shù)、離體培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基配方篩選方面的研究，建立了較好的組織培養(yǎng)快繁體系［14-20］。

山奈屬不同種植物在外植體相同的情況下，其組織培養(yǎng)的步驟和培養(yǎng)基也不同，如海南三七根莖芽基部為外植體時，叢生芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 3 mg/L+NAA 0.1 mg/L+3%蔗糖+卡拉膠粉10 g/L+10%椰汁［8］；海南三七組培苗的幼芽或莖尖，接種于MS+6-BA3 mg/L+2,4-D 1 mg/L培養(yǎng)基中，20 d左右有愈傷組織產(chǎn)生，30 d左右有絨毛狀根生成。但發(fā)現(xiàn)，接種到兩種培養(yǎng)基（MS+6-BA 2～3 mg/L+NAA 0.1 mg/L）上誘導(dǎo)，均只有10%誘導(dǎo)成苗［9］；海南三七無菌苗的假莖基部，在暗培養(yǎng)條件下能獲得高質(zhì)量的愈傷組織，最佳生長調(diào)節(jié)劑組合為6-BA 2 mg/L+2,4-D 1 mg/L，但從外植體誘導(dǎo)愈傷到分化成苗只需110 d，每塊愈傷分化成苗2.38～3.75個，周期長［10］；山奈塊莖剛萌發(fā)的芽為外植體時，適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 3.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，芽萌發(fā)率達(dá)100%，分化率為146.67%［11］；我們前期研究發(fā)現(xiàn)，取紫花山奈根莖上萌發(fā)的芽基部為外植體，接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+6-BA 3～5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+椰汁10%+蔗糖20 g/L+卡拉膠粉9.5 g/L上，接種60 d后，芽的誘導(dǎo)率為0；本研究通過調(diào)整培養(yǎng)基中6-BA和NAA的濃度，先增殖芽基部，切割增殖的芽基部后，再轉(zhuǎn)移至叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，這一過程可有效誘導(dǎo)叢生芽，在短期內(nèi)獲得大量性狀穩(wěn)定的紫花山奈種苗。

本研究結(jié)果表明，紫花山柰無菌苗芽基部繼代增殖比較合適的培養(yǎng)基為MS+6-BA8～12 mg/L+NAA0～0.1 mg/L+椰汁10%+白砂糖30 g/L +卡拉膠粉10 g/L，最佳的繼代增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA8 mg/L+NAA 0.1 mg/L+椰汁10%+白砂糖30 g/L+卡拉膠粉10 g/L；叢生芽誘導(dǎo)比較合適的培養(yǎng)基為MS+6-BA3～5 mg/L+NAA 0.05～0.1 mg/L+椰 汁 10%+白 砂 糖 30 g/L+卡拉膠粉10 g/L，最佳的叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA3 mg/L+NAA 0.05 mg/L+椰汁10%+白砂糖30 g/L+卡拉膠粉10 g/L；生根較佳的培養(yǎng)基為MS+NAA 0.1 mg/L+香蕉泥10～15%+活性炭0.5～1.0 g/L+白砂糖30 g/L+卡拉膠粉9.5 g/L。

圖1 紫花山奈無菌苗

圖2 紫花山柰芽基部的繼代增殖

圖3 紫花山柰的叢生芽誘導(dǎo)

圖4 紫花山柰的生根培養(yǎng)和組培苗移栽