柳婷婷 ，劉南南 ，王桂清

（1.聊城大學農學院，山東 聊城 252059；2.聊城市農業(yè)委員會，山東 聊城 252000）

木霉菌（Trichodermaspp．）是自然界廣泛分布的一種真菌，屬半知菌亞門絲孢綱叢梗孢目叢梗孢科木霉屬，廣泛存在于土壤環(huán)境中，在植物根基土壤、種子、葉圍和球莖等生態(tài)環(huán)境中也大量存在［1］，目前其對18個屬29個種以上的病原真菌有拮抗作用，具有較高的生防價值［2］，在農業(yè)和園林生產中具有廣泛的應用。康寧霉素（Trichokonins，TKS）是長枝木霉的一種次級代謝產物，能夠有效抑制革蘭氏陽性細菌和多種植物病原真菌，具有廣譜殺菌性［3］。臭椿（Ailanthus altissima Swingle）根系發(fā)達、生長迅速，易繁殖［4］，同時具有抗旱、耐鹽堿、耐貧瘠等特點，是理想的行道樹。但臭椿幼苗小葉基部腺齒不發(fā)達，對病蟲害的防御力低，易受病蟲害侵染，病害發(fā)生嚴重，甚至大面積死亡，因此解決臭椿苗期病害問題迫在眉睫。臭椿苗期病蟲害主要有銹病、白粉病、炭疽病、腐爛病等［5］，經采樣、分離、鑒定，發(fā)現(xiàn)引起臭椿苗期病害的主要致病菌有腐皮鐮刀菌（Fusarium soiani）、木賊鐮刀菌（F. equiseti）、棒狀擬盤多毛孢菌（Pestalopsis clavispora）和極細鏈格孢菌（Alernaria tenuissima）4種（另文發(fā)表）。目前關于生物防治臭椿苗期病害的研究較少，也未見用木霉及其代謝產物防治臭椿病害或誘導促生長作用的報道。因此，自2014年開始聊城大學農學院植物病理研究室對臭椿苗期病害致病菌進行分離鑒定及室內藥效試驗。本試驗以康寧霉素水溶劑為研究對象，以苯醚甲環(huán)唑、多菌靈、苦參堿和霜霉立克等藥劑為陽性對照，以臭椿苗期病害的主要致病菌為靶標，探究康寧霉素對致病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑制作用，以期明確康寧霉素對真菌的抑菌效果，為其防治臭椿苗期病害提供理論依據(jù)，并為其作為生防制劑在園林樹木生物防治中的推廣應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌種為引起起臭椿苗期病害的4種主要病原菌，分別為木賊鐮刀菌、腐皮鐮刀菌、棒狀擬盤多毛孢菌和極細鏈格孢菌，保存于聊城大學農學院病理研究室。采用PDA培養(yǎng)基于25（±1）℃的恒溫培養(yǎng)箱內12 h光照/12 h黑暗培養(yǎng)7 d，用打孔器制取直徑0.7 cm的菌餅接種備用。

供試藥劑為14.39 mg/mL康寧霉素水溶劑和60%多菌靈可濕性粉劑、20%苯醚甲環(huán)唑微乳劑、0.36%苦參堿可溶性液劑、10.3%霜霉立克乳油4種對照農藥。

菌絲生長抑制試驗藥液的配制：用無菌水將康寧霉素、多菌靈、苯醚甲環(huán)唑、苦參堿和霜霉立克分別配制成終濃度為25、50、100、200、400 mg/L，6.25、12.5、25、50、100 mg/L，25、50、100、200、400 mg/L，4、8、16、32、64 mg/L，20、40、80、160、320 mg/L，按濃度由低到高編號為1、2、3、4、5，備用。

孢子萌發(fā)抑制試驗藥液的配制：用無菌水將康寧霉素終濃度配制成17.5、35、70、140、280 mg/L，其他4種農藥配制終濃度同菌絲生長抑制試驗藥液濃度。

1.2 生物活性測定

以菌絲生長速率法［6-7］測定康寧霉素和對照藥劑對臭椿幼苗4種致病菌的抑制作用。所用培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，菌餅直徑0.7 cm，每皿1塊，3次重復，25（±1）℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待對照菌落直徑大約在3 cm以上時，十字交叉法測量菌落直徑，計算菌絲生長抑制率：

菌絲生長抑制率（%）=（對照菌落生長直徑-處理菌落生長直徑）/對照菌落生長直徑×100

以孢子萌發(fā)法［8］測定康寧霉素和4種其他藥劑對孢子萌發(fā)的抑制作用。以只加無菌水為空白對照，3次重復，12 h觀察結果，計算孢子萌發(fā)抑制率：

1.3 數(shù)據(jù)處理

各藥劑濃度進行對數(shù)轉換，與對應的防效機率值作回歸分析，試驗數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel軟件進行統(tǒng)計整理，經DPSv7.05統(tǒng)計軟件進行方差分析及顯著性檢驗，求得相關系數(shù)、線性回歸方程、各藥劑處理的EC50值及其95%置信限，建立毒力回歸曲線等。

2 結果與分析

2.1 康寧霉素對致病菌菌絲生長的抑制作用

2.1.1 康寧霉素對致病菌菌絲生長的抑制作用 康寧霉素及對照藥劑對4種致病菌菌絲生長抑制率如圖1所示?？祵幟顾貙?種致病菌菌絲生長均有抑制作用且隨著藥劑濃度的提高，抑制率增大；相同濃度下，康寧霉素對棒狀擬盤多毛孢菌抑制率最高，對木賊鐮刀菌抑制率最低，在400 mg/L時抑制率分別為86.37%、54.36%，前者是后者的1.59倍。以對腐皮鐮刀菌菌絲生長抑制作用為例，康寧霉素抑制作用在一定濃度范圍內先隨濃度升高直線上升，達到編號2濃度（50 mg/L）時出現(xiàn)轉折點，增長趨勢趨于平緩。多菌靈抑制作用較強，最高濃度（100 mg/L）時抑制率接近100%，而霜霉立克抑制作用一直較差，在供試濃度下抑制率均低于52%。

2.1.2 康寧霉素對致病菌菌絲生長的抑制效果 康寧霉素及對照藥劑對4種致病菌的菌絲生長的抑制效果見表1。康寧霉素對棒狀擬盤多毛孢菌的EC50最小、為32.97 mg/L，對極細鏈格孢菌、腐皮鐮刀菌和木賊鐮刀菌的EC50依次增大，分別為95.66、143.91、297.28 mg/L，說明康寧霉素對棒狀擬盤多毛孢菌的菌絲生長抑制效果較為顯著。

圖1 5種藥劑對致病菌菌絲生長的抑制率

以對腐皮鐮刀菌菌絲生長抑制效果為例，康寧霉素的EC50為143.91 mg/L，是苦參堿的58.26倍、多菌靈的8.94倍、苯醚甲環(huán)唑的2.02倍，即其藥效僅為苦參堿的1.72%、多菌靈的11.19%、苯醚甲環(huán)唑的49.51%，說明康寧霉素對腐皮鐮刀菌菌絲生長的抑制作用弱于多菌靈、苦參堿和苯醚甲環(huán)唑；康寧霉素的EC50是霜霉立克的0.39倍，即其藥效為霜霉立克的2.56倍，說明康寧霉素對腐皮鐮刀菌菌絲生長的抑制作用優(yōu)于霜霉立克。

2.2 康寧霉素對致病菌孢子萌發(fā)的抑制作用

2.2.1 康寧霉素對致病菌孢子萌發(fā)的抑制作用 康寧霉素及對照藥劑對4種致病菌孢子萌發(fā)抑制率如圖2所示?？祵幟顾貙?種致病菌孢子萌發(fā)均有抑制作用，對棒狀擬盤多毛孢菌孢子萌發(fā)抑制率最高，在280 mg/L時，對棒狀擬盤多毛孢菌、極細鏈格孢菌、木賊鐮刀菌、腐皮鐮刀菌的孢子萌發(fā)抑制率分別為82.85%、71.33%、67.74%、75.01%。

以對腐皮鐮刀菌孢子萌發(fā)抑制效果為例，5種制劑對腐皮鐮刀菌孢子萌發(fā)均有抑制作用，且隨著藥劑濃度的增大，相對抑制率相應增大。在試驗濃度條件下，康寧霉素對腐皮鐮刀菌孢子萌發(fā)的抑制率基本高于對應編號濃度下苦參堿和霜霉立克對其抑制率。

2.2.2 康寧霉素對致病菌孢子萌發(fā)的抑制效果 康寧霉素及對照藥劑對4種致病菌的孢子萌發(fā)的抑制效果見表2?？祵幟顾貙Π魻顢M盤多毛孢菌孢子萌發(fā)的EC50最小，為47.99 mg/L，對極細鏈格孢菌、腐皮鐮刀菌和木賊鐮刀菌的EC50依次增大，分別為62.01、76.20、111.19 mg/L，說明康寧霉素對棒狀擬盤多毛孢菌孢子萌發(fā)的抑制作用最強。

在對腐皮鐮刀菌的孢子萌發(fā)抑制效果上，康寧霉素的EC50為76.20 mg/L，是多菌靈的4.62倍、苦參堿的3.55倍、苯醚甲環(huán)唑的1.04倍、霜霉立克的0.75倍，即其藥效為多菌靈的21.64%、苦參堿的28.20%、苯醚甲環(huán)唑的95.73%、霜霉立克的1.33倍，說明康寧霉素對腐皮鐮刀菌孢子萌發(fā)的抑制作用與苯醚甲環(huán)唑相近、優(yōu)于霜霉立克，不及多菌靈和苦參堿。

表1 5種制劑對致病菌菌絲生長的抑制效果

圖2 5種藥劑對致病菌孢子萌發(fā)的抑制率

綜上，康寧霉素對4種致病菌菌絲生長和孢子萌發(fā)均有抑制作用，比較EC50，總體而言康寧霉素對致病菌孢子萌發(fā)的抑制效果優(yōu)于對菌絲生長的抑制效果。

3 結論與討論

康寧霉素對臭椿苗期病害的不同致病真菌抑制效果不同，對棒狀擬盤多毛孢菌的抑制效果最好，最高濃度時對菌絲生長和孢子萌發(fā)抑制率分別為86.37%、82.85%；對菌絲生長和孢子萌發(fā)的EC50分別為32.97、47.99 mg/L，對木賊鐮刀菌抑制效果最差，對菌絲生長和孢子萌發(fā)的EC50分別為297.28、111.19 mg/L，說明康寧霉素的抑制作用具有一定的選擇性。

對多數(shù)致病菌來說，以腐皮鐮刀菌為例，康寧霉素對其菌絲生長和孢子萌發(fā)的EC50分別為 143.91、76.20 mg/L，苦參堿為 2.47、21.49 mg/L，多菌靈為16.10、16.49 mg/L，苯醚甲環(huán)唑為71.25、72.95 mg/L，霜霉立克為368.03、101.18 mg/L，康寧霉素的EC50均高于多菌靈和苦參堿，低于霜霉立克，即其抑菌效果低于多菌靈和苦參堿，優(yōu)于霜霉立克，說明康寧霉素對引起臭椿苗期病害的4種致病菌有良好的防治效果。

康寧霉素對多數(shù)致病菌孢子萌發(fā)的EC50均小于對應致病菌菌絲生長的EC50，說明康寧霉素對致病菌孢子萌發(fā)的抑制效果優(yōu)于其對菌絲生長的抑制效果。該結論為康寧霉素用于病害流行的防治適期提供了理論基礎。

抗生作用是木霉菌發(fā)揮生物防治作用的重要機制之一，許多木霉在代謝過程中可以產生抑制病原菌的拮抗性化學物質，包括抗生素類和一些酶類，如木霉素、膠霉素、綠木霉素、抗菌肽等。木霉菌產生的次生性代謝產物廣泛應用于植物病害防治，在生物及其醫(yī)藥領域也有一定的應用價值［9］，其對很多病原菌有顯著的抑制作用［10］。康寧霉素是由康寧木霉（現(xiàn)已更名為長枝木霉［11-12］）生防菌SMF2的固體培養(yǎng)物中分離提純獲得的一類Peptaibols抗菌肽，解樹濤等［13］證明康寧霉素對細菌有抑菌活性，對革蘭氏陽性細菌的作用大于對革蘭氏陰性細菌的作用。胡明江等［14］利用長枝木霉SMF2分生孢子制劑進行了防治大白菜軟腐病的田間藥效試驗，發(fā)現(xiàn)SMF2分生孢子制劑對大白菜軟腐病具有較好的防治效果，明顯優(yōu)于大面積推廣應用的農用鏈霉素，且持效期比農用鏈霉素長。

表2 5種制劑對致病菌孢子萌發(fā)的抑制效果

解樹濤等［13］證明長枝木霉對真菌有較為廣泛的抑菌譜；常媛等［15］在八寶景天根際土壤中分離得到的一株優(yōu)勢長枝木霉對細鏈格孢菌等3種土傳病害病原真菌均有較明顯的拮抗作用；張瑾等［16］研究表明長枝木霉菌對蘋果樹腐爛病菌等12種植物病原真菌的生長均有不同程度的抑制作用，其抑菌作用機制主要是競爭作用；陳凱等［17］認為長枝木霉的代謝產物Bisorbicillinoids具特異的生物活性，可致辣椒疫霉菌的菌絲畸形，是一種潛在的抗真菌物質。

研究證明康寧霉素具有促進植物生長及誘導抗性作用，在一定濃度內可促進皂莢種子的萌發(fā)，有利于國槐幼苗根系的伸長，側根的形成與生長以及根系系統(tǒng)的穩(wěn)固程度［18］；可以誘導煙草產生系統(tǒng)抗性，降低煙草花葉病毒的侵染［19］；可通過促生作用和誘導抗性防治大白菜軟腐?。?0］。木霉菌株的胞外代謝產物對人、畜為實際無毒，因此可作為綠色生物農藥廣泛使用。本課題組將擴大康寧霉素抑菌種類的研究，明確其抑菌譜；同時在長枝木霉及其代謝產物的抑菌機理、對園林植物的促生長作用及誘導抗性等方面繼續(xù)加以深入研究。