高潔

(山西省林業(yè)科學(xué)研究院,山西 太原 030012)

槐米為豆科植物槐(SophorajaponicaL.)的花蕾，是我國傳統(tǒng)的大宗藥材之一，內(nèi)含蘆丁、槲皮素等多種黃酮類成分，蘆丁為槐米中含量最高的成分。米槐是植物槐的栽培品種。隨著專用于生產(chǎn)槐米的優(yōu)良品種選育成功，植物槐作為行道樹、四旁樹、園林綠化樹和生態(tài)樹種栽培的同時，也可作為一種經(jīng)濟(jì)樹種栽培。人們把專門用來生產(chǎn)槐米的植物槐稱為米槐。臨床上槐米常用于治療高血壓、冠心病、防治腦溢血及吐血、風(fēng)熱目赤等[1]。1904年，Schmidt分離得到蘆丁，為槐米中的主要成分。隨后，在槐米中分離得到很多黃酮類成分，如：染料木素、山柰酚、異鼠李素[2]等。除黃酮類外，其他類成分，如皂苷類[3]、甾類[4～5]、色素、氨基酸[6～8]等成分也被發(fā)現(xiàn)。同時，槐米還可食用、做染料等，槐葉資源豐富，但利用較低，目前對槐米和槐葉的研究主要集中在化學(xué)和藥理方面，對于黃酮類化合物在槐米和槐葉中的積累規(guī)律及生物合成規(guī)律尚未報道。

熒光定量PCR技術(shù)(RT-qPCR)是一種在PCR反應(yīng)體系中加入熒光材料，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR過程，然后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。通過RT-qPCR可以分析植物在不同處理條件下基因樣本的表達(dá)差異，比較不同基因型，不同發(fā)育階段或生長條件下的細(xì)胞或個體在基因表達(dá)上的差異，是研究分子調(diào)控機制的重要組成部分。Czechowski等[9]使用RT-qPCR研究了1400多個擬南芥轉(zhuǎn)錄因子在根組織和莖組織的特異表達(dá)情況，認(rèn)為熒光定量PCR是研究轉(zhuǎn)錄因子的優(yōu)勢方法。Alaei等[10]用傳統(tǒng)方法和實時PCR法檢測了杭白菊中的白銹病，認(rèn)為實時PCR能夠快速準(zhǔn)確的檢測病原。RT-qPCR也可以為轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測提供快速而靈敏的技術(shù)途徑。Wu等[11]建立了轉(zhuǎn)基因水稻TT51-1實時PCR檢測體系，為快速檢測轉(zhuǎn)基因植物成分提供便捷方法。因此，實時熒光定量PCR技術(shù)可作為分析槐米和槐葉中關(guān)鍵酶基因表達(dá)水平的有利工具。

本研究應(yīng)用RT-qPCR技術(shù)，對在前期槐米和槐葉的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中挖掘到13個有關(guān)黃酮類生物合成的關(guān)鍵酶基因[12]的mRNA的表達(dá)量進(jìn)行熒光定量分析，以期研究槐米中黃酮類化合物生物合成途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)水平，明確槐米的采收期，皆在為后續(xù)通過基因工程進(jìn)行槐米種質(zhì)遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

DYY-6B穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，ZF-258全自動凝膠成像分析系統(tǒng)，GC-02實時熒光定量PCR儀，TC-XP-D 基因擴增儀， NanoDrop2000超微量分光光度計；RNAisoPlus、Taq DNA 聚合酶、dNTPs、DNA Marker、M-MLV Reverse Transcriptase、PrimeScrip RT Master Mix、SYBR Premix Ex TaqTM II均為TaKaRa公司，瓊脂糖(BIOWEST)，DEPC(Solabio)，2×Easy Taq PCR SuperMix (TransGen)。

槐米和槐葉樣品均采自山西省運城市鹽湖區(qū)茂端雙季槐種植專業(yè)合作社基地，分別于2016年7月和9月，隨機抽取同一片試驗田中10株生長旺盛的米槐，每株隨機從不同部位各采集10包槐米(M)及槐葉(Y)(圖1)，以鋁箔紙包裹，液氮速凍后于-80 ℃保存。采集的所有樣本經(jīng)山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心的秦雪梅教授鑒定為米槐(Sophora japonica)，憑證標(biāo)本保存在該中心。

圖1 槐米和槐葉的生長狀況Fig.1 The growth status of the Sophora Japonica and its leaves

1.2 RNA提取及cDNA的合成

采用RNAiso Plus(TaKaRa)說明書，對7月和9月采集的槐米和槐葉樣本進(jìn)行總RNA提取，提取RNA時，隨機選取3包樣品進(jìn)行混合。Nano Drop 2000及1.5%瓊脂糖凝膠電泳對所提取的RNA樣品進(jìn)行濃度和質(zhì)量檢測。按照M-MLV Reverse Transcriptase(TaKaRa)說明書用 1μg總RNA合成cDNA。

1.3 熒光定量引物設(shè)計及驗證

1.3.1 引物設(shè)計

使用Primer Premier5.0軟件設(shè)計槐米和槐葉內(nèi)參18 s rRNA與13個與黃酮類化合物生物合成相關(guān)酶基因的表達(dá)引物，引物的堿基數(shù)為20 bp左右，上下游引物的退火溫度相差1 ℃左右，且都在60 ℃上下浮動，符合熒光定量引物設(shè)計原則。引物合成工作由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.3.2 引物驗證

采用PT-PCR驗證引物特異性，反應(yīng)體系：12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix；1.0 μL上游/下游引物(引物濃度10 μmol/L)；8.5 μL ddH20；2 μL cDNA。反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 60 s，72 ℃ 3min；35個循環(huán)，72 ℃ 10 min；4 ℃保存。選取7月份的槐米為模板，每個基因各做1個反應(yīng)，1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

1.4 RT-qPCR分析

反應(yīng)體系：10 μL SYBR Premix Ex Taq；1.0 μL上游/下游引物(引物濃度10 μmol/L)；6.4 μL ddH20；2 μL cDNA。反應(yīng)程序：95 ℃ 60 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，40個循環(huán)。每個樣本生物學(xué)重復(fù)3次，技術(shù)重復(fù)3次。以2-ΔCt值分析數(shù)據(jù)[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA樣品質(zhì)量分析

對所提取的RNA(S7-M、S7-Y、S9-M和S9-Y)進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析(見圖2-A)，由圖可見，有3條完整的電泳條帶，并且28 s比18 s和5s明亮，說明RNA的完整性良好，沒有降解。通過Nanodrop檢測RNA的濃度和純度，結(jié)果表明A260/280與A260/230均在1.9～2.1之間，說明RNA的純度較高，符合后續(xù)試驗要求。

圖2 槐米和槐葉總RNA提取的瓊脂糖凝膠電泳圖及RT-PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖(A-槐米和槐葉總RNA提取：1∶7月槐米；2∶7月槐葉；3∶9月槐米；4∶9月槐葉；B-RT-PCR產(chǎn)物驗證：1：柚皮素3-雙加氧酶；2：ANR；3：HCT；4：FLS；5：CHS；6：LDOX；7：FLS；8：LAR；9：F3′H；10：4CL；11：PAL；12：CCoAOMT；13：IFS)Fig.2 The electrophoresis figure of agarose gel extracted from the total RNA of Sophora japonica and its leaves and the electrophoresis figure of agarose gel of RT-PCR products.(A: The extracted total RNA of Sophora japonica and its leaves: 1: Sophora japonica in July;2:Leaves in July; 3: Sophora japonica in September; 4: Leaves in September; The product of B- RT-PCR: 1: EC 1.14.11.9; 2：ANR；3：HCT；4：FLS；5：CHS；6：LDOX；7：FLS；8：LAR；The product of C-RT-PCR: 9：F3′H；10：4CL；11：PAL；12：CCoAOMT；13：IFS)

2.2 引物擴增特異性檢驗

據(jù)RT-PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖2-B)可知，所設(shè)計13個與黃酮類化合物生物合成相關(guān)的酶基因的引物均得到特異性擴增產(chǎn)物，且無引物二聚體。擴增目的條帶符合設(shè)計引物時目的產(chǎn)物片段的大小，基本在200 bp左右，符合熒光定量反應(yīng)試驗要求。

2.3 槐米和槐葉中與黃酮類生物合成相關(guān)的酶基因的發(fā)掘

據(jù)本課題組前期轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果分析，共注釋到157個與黃酮類化合物生物合成相關(guān)的酶基因(表1)，包括花青素還原酶(c47862_g1，ANR)、黃酮醇合酶(c38192_g1，F(xiàn)LS)、查爾酮合酶(c51726_g1，CHS)、異黃酮2′-羥化酶(c41373_g1，I2'H)等。其中，注釋最多的為4-香豆酸：CoA連接酶同工酶(4CL)，為黃酮類化合物生物合成途徑中上游的一個關(guān)鍵酶。在這157個酶基因中，高表達(dá)的有13個，為本研究進(jìn)行熒光定量分析的13個酶基因。

2.4 與黃酮類化合物生物合成相關(guān)酶基因的熒光定量分析

以LAR在9-M(9月份采收的槐米)中的熒光定量擴增曲線(見圖3)為例，內(nèi)參18 srRNA和基因LAR在9-M中表達(dá)穩(wěn)定，并且擴增良好。由熔解度曲線可知，內(nèi)參18 s rRNA和基因LAR都是一個尖峰，說明設(shè)計的引物擴增良好，無引物二聚體或其它非特異性擴增。

通過不同采收期(7月和9月)槐米的mRNA表達(dá)量分析，圖4可知，除基因類黃酮-3′-羥化酶(F3'H)外，其余基因在7月采收槐米中的表達(dá)量均高于9月；在比較不同部位米槐(槐米和槐葉)中與黃酮類物質(zhì)生物合成相關(guān)的酶基因表達(dá)水平時發(fā)現(xiàn)，除基因黃酮醇合酶(FLS)、苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)、4-香豆酸：CoA連接酶同工酶(4CL)和2-羥基異黃酮合成酶(IFS)外，其余9個與黃酮類化合物生物合成相關(guān)的酶基因在槐米的表達(dá)量均高于槐葉。由此可推測，黃酮類化合物的積累在7月槐米中較高，9月采收的槐米中黃酮類成分減少；且黃酮類成分的積累多在槐米中，槐葉中的黃酮類成分較少。

表1 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中注釋到的與黃酮類化合物生物合成相關(guān)的基因Table 1 The Genes Related to the Biosynthesis of Flavonoids in the Transcriptome Data

圖3 內(nèi)參(18 s RNA)與LAR基因在9-M中的熒光定量擴增曲線與熔解度曲線Fig.3 Fluorescent Quantitative Amplification Curves and Melting Curves of Internal References (18 s RNA) and LAR Gene in 9-M

圖4 不同采收期槐米和槐葉中黃酮類物質(zhì)生物合成相關(guān)基因的mRNA表達(dá)量Fig.4 The amount of mRNA expression of related genes of the biosynthesis of flavonoids of sophora japonica and its leaves in different harvest time

2.5 槐米和槐葉中與黃酮類化合物生物合成相關(guān)關(guān)鍵酶基因的序列比對

通過使用國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫https://www.ncbi.nlm.nih.gov/對米槐轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中挖掘到的13個與黃酮類化合物生物合成關(guān)鍵酶基因進(jìn)行同源序列比對由表2可知，13個酶基因的功能均在其他同源物種中被注釋，且基因同源性均大于70%。此外，除c85175_g1(HCT)和c56136_g1(IFS)未匹配到蛋白編碼區(qū)外，其余基因均有編碼區(qū)。最長的基因序列是c56049_g1(LAR)，2 474 bp，其主要功能是無色花青素還原酶，最短的序列是編碼LDOX的c46064_g1(1 197 bp)。

3 討論與結(jié)論

本研究通過前期槐米不同采收期(7月和9月)及不同組織部位的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，從中找到13個黃酮類化合物生物合成相關(guān)的關(guān)鍵酶基因，并利用RT-qPCR技術(shù)對這13個酶基因mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行分析，明確了槐米的最佳采收期為7月。為后續(xù)黃酮類成分生物合成相關(guān)酶基因克隆及功能分析提供數(shù)據(jù)支持，為通過基因工程進(jìn)行米槐種質(zhì)遺傳改良奠定基礎(chǔ)。

通過前期米槐轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的深度挖掘，找出157個與黃酮類生物合成相關(guān)的基因，并在其中找出13個表達(dá)上調(diào)的關(guān)鍵酶基因，隨后對這13個酶

表2槐米和槐葉中與黃酮類化合物生物合成相關(guān)關(guān)鍵酶基因的序列比對

Table2 The sequence alignment of key enzyme genes related to biosynthesis of flavonoids in the Sophora Japonica and its leaves

Gene IDFunctionlength(bp)Homologous species functionHomology rateHomologous gene length(bp)Gene bank IDc49346_g1Naringenin, 2-oxoglutar-ate 3-dioxygenase1676Glycine max flavanone 3-hydroxylase (F3H) mRNA, complete cds85%1677DQ513328.1c47862_g1Anthocyanidn reductase1803Lotus uliginosus anthocyanidin reductase (ANR) mR-NA, complete cds88%1161/c85175_g1HCT;shikimate O-hydroxycinnamoyltrans-ferase1862PREDICTED: Glycine max spermidine hydroxycin-namoyl transferase-like (LOC100777007), mRNA79%1646/c43880_g1Flavonol synthase1490Onobrychis viciifolia flavonol synthase mRNA, complete cds84%1005HM204484.1c51726_g1Chalcone and stilbene synthase family protein2018Acacia confusa chalcone synthase mRNA, complete cds85%1577JN812063.1c46064_g1Leucoanthocyanidin diox-ygenase LDOX1197Glycine max anthocyanidin synthase 3 (ANS3) mRNA, complete cds88%1308AY382830.1c31170_g1Flavonol synthase1572Eustoma russellianum flavonol synthase (fls) mRNA, complete cds73%1268AF240764.1c56049_g1Leucoanthocyanidin re-ductase LAR2474Glycine max cultivar Clark leucoanthocyanidin reductase 1 (LAR1) mRNA, complete cds85%1314JF433916.1c40901_g1Flavonoid-3'-hydroxylase1944Glycine max flavonoid 3'-hydroxylase (F3'H) mRNA, complete cds83%1589 FJ770476.1c53277_g14-Coumarate: CoA ligase isoenzyme 32130Glycine max 4-coumarate:CoA ligase (4CL) mRNA, complete cds84%1697FJ770469.1c53596_g1Phenylalanine ammonia-lyase class 1-like2176Vitis vinifera phenylalanine ammonia-lyase 1 (PAL1) mRNA, complete cds78%2154KU162973.1c50834_g1Cinnamoyl-CoA O-meth-yltransferase1258Caragana korshinskii cinnamoyl-CoA O-methyltrans-ferase (CCOAOMT) mRNA, complete cds91%744HQ829864.1c56136_g12-Hydroxyisoflavanone synthase2009PREDICTED: Lupinus angustifolius 2-hydroxyisofla-vanone synthase-like (LOC109328965), mRNA80%1703/

基因進(jìn)行同源性比對，比對結(jié)果顯示除c85175_g1(HCT)和c56136_g1(IFS)未匹配到蛋白編碼區(qū)外，其余基因均有編碼區(qū)。此結(jié)果表明，所找到的黃酮類化合物生物合成途徑中表達(dá)上調(diào)的基因多數(shù)為全長基因，并不是以小片段形式存在的，所以關(guān)于酶基因的功能注釋結(jié)果是可信的，并且基因注釋結(jié)果與同源全長基因的結(jié)果相匹配。通過RT-qPCR技術(shù)對這13個酶基因的mRNA表達(dá)量進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中9個基因mRNA的表達(dá)量在槐米中均高于槐葉，且在比較不同采收期槐米中與黃酮類物質(zhì)生物合成相關(guān)的酶基因表達(dá)水平時發(fā)現(xiàn)，除F3'H外，其余基因在7月采收槐米中的表達(dá)量均高于9月，這為確定槐米的采收期提供了理論支持。

目前，人們致力于槐米中藥用成分的研究，主要是化學(xué)和藥理方面?；瘜W(xué)研究主要集中在槐米中蘆丁與槲皮素的含量測定、提取及純化工藝研究；藥理作用的研究主要為黃酮類化合物(蘆丁、槲皮素)的抗炎、止血、抗病毒及心血管疾病等?；比~資源豐富，但利用率較低，為了提高槐葉的附加價值，李彩霞等[13]采用ABTS清除體系、DPPH清除體系、H2O2/ Fe2 +/水楊酸檢測體系、亞硝基清除體系、普魯士藍(lán)法、鄰苯三酚自氧化法研究了國槐葉黃酮的抗氧化活性，并同蘆丁、Vc進(jìn)行了比較，說明國槐葉提取物可以作為天然抗氧化劑，并且可以應(yīng)用在醫(yī)藥食品領(lǐng)域。李小勇等[14]研究超聲波輔助雙水相、回流、半仿生、水提、超聲波輔助雙水相(堿)性5種提取方法提取國槐葉黃酮以及抗氧化活性。結(jié)果表明，回流提取黃酮含量大于其它幾種提取方法。抗氧化結(jié)果顯示，超聲輔助雙水相提取物具有很好的抗氧化性。以上研究表明目前對槐米和槐葉中的主要活性物質(zhì)黃酮類化合物研究較多，但黃酮類化合物的積累規(guī)律及生物合成規(guī)律在米槐中的研究尚未報道，但在其他植物中的研究較廣泛。PAL(苯丙氨酸解氨酶)是類黃酮生物合成途徑中的一個關(guān)鍵酶，其能催化L-苯丙氨酸非氧化性脫氨生成反式肉桂酸。Liu等[15]克隆得到蒙古黃芪PAL1基因，并將該基因CaMV35S啟動子轉(zhuǎn)入到煙草中，研究發(fā)現(xiàn)煙草中PAL酶活和槲皮素的含量升高，證明了PAL是蒙古黃芪黃酮化合物合成途徑中的關(guān)鍵酶。CHI(查耳酮異構(gòu)酶)也是黃酮類化合物代謝途徑中的一個關(guān)鍵酶，第1個CHI基因是Mehdy等[16]于1987年從法國豌豆中得到的，CHI能使查爾酮發(fā)生分子內(nèi)環(huán)化。Liu等[15]克隆得到花生的CHI基因并通過RT-qPCR分析，結(jié)果顯示CHI基因主要在根系中表達(dá)。不同種類的黃酮類化合物在植物各組織中的分布情況不同。Graham[17]研究發(fā)現(xiàn)，在大豆萌芽后5天時，幼苗的根部組織、胚軸以及子葉中異黃酮類化合物含量高，而初生的葉片組織中主要是黃酮醇類成分，這可能與合成不同黃酮類化合物的酶的含量及活性有組織差異性有關(guān)。黃酮醇類物質(zhì)大部分分布于葉和花中，而異黃酮類化合物多在豆科植物的根中分布。本項目研究通過將在米槐轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選到的13個與黃酮類生物合成相關(guān)的基因注釋到黃酮類化合物生物合成途徑中，揭示了米槐中黃酮類成分的積累及生物合成規(guī)律。研究結(jié)果F3'H和FLS主要參與黃酮醇類化合物的生物合成，槐米中含量最高的蘆丁屬于此類化合物，由基因表達(dá)量分析可知，與槐葉相比，黃酮醇類化合物的積累在槐米中較高，且7月份采收的槐米比9月份含量高。槐米為未開放的花蕾，槐米與槐花中的蘆丁含量相似，且槐米中含有更多的黃酮類物質(zhì)，本研究結(jié)果與諸姮[18]總結(jié)結(jié)果一致，而本研究發(fā)現(xiàn)異黃酮類物質(zhì)的合成主要在葉中，與異黃酮類化合物多在豆科植物的根中分布結(jié)論不一致，這可能是因為，本研究僅在2個組織中分析與黃酮類化合物生物合成相關(guān)的酶基因表達(dá)水平，未就槐枝、槐根等其他組織進(jìn)行研究。結(jié)合黃酮類化合物的生物合成路徑與熒光定量結(jié)果可以推測，異黃酮類物質(zhì)可以通過采收槐葉獲得，而通過采收槐米可能獲得更高的黃酮醇及花色素類物質(zhì)。從而為通過提取分離獲得目標(biāo)化合物提供依據(jù)，也可為后續(xù)黃酮類成分生物合成相關(guān)酶基因克隆及功能分析提供數(shù)據(jù)支持。