陳 高，代祥德，邵景杰，任三國(guó)，陳禪友

（江漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院；湖北省豆類(lèi)（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430056）

菜豆（Phaseolus vulgarisL.）屬于豆科菜豆屬草本植物，又稱(chēng)四季豆、蕓豆，菜豆可以食用籽?；蚴秤枚骨v，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富，富含大量的蛋白質(zhì)、氨基酸及多種礦質(zhì)元素，是世界上許多地區(qū)的主要植物蛋白來(lái)源之一。采用傳統(tǒng)的方法栽培菜豆時(shí)其產(chǎn)量會(huì)受到光周期、氣候、病蟲(chóng)害等外部因素的影響［1］，而植物組織培養(yǎng)技術(shù)可以不受外界環(huán)境的限制，并在較短的時(shí)間內(nèi)繁殖出較大數(shù)量的再生植株［2-3］。另一方面，通過(guò)基因工程技術(shù)可將外源基因?qū)氩硕辜?xì)胞，培養(yǎng)出抗病、抗蟲(chóng)的優(yōu)良菜豆種質(zhì)資源，而建立完善的菜豆離體再生體系則是進(jìn)行菜豆轉(zhuǎn)基因的必要環(huán)節(jié)之一［4］。

在豆科植物組織培養(yǎng)中，最早是用豌豆的莖段誘導(dǎo)出愈傷組織并得到了再生植株［5］，隨后豇豆、大豆、蠶豆及菜豆等豆科植物也被作為離體再生培養(yǎng)材料進(jìn)行了研究［6-9］。雖然組織培養(yǎng)的快速繁殖技術(shù)已經(jīng)在農(nóng)業(yè)上廣泛應(yīng)用，但豆科植物在組織培養(yǎng)中能再生植株的種類(lèi)仍然不多，存在再生困難、存活率低等問(wèn)題，而且種子越大的豆科植物越難再生，同一種類(lèi)而不同基因型的豆科植物的培養(yǎng)條件也相差較大［10］。因而國(guó)內(nèi)外關(guān)于菜豆組織培養(yǎng)技術(shù)的研究一直進(jìn)展緩慢，且大多處于試驗(yàn)階段，目前未建立系統(tǒng)的離體再生體系，實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化［4，11］。不同激素配比與外植體的選擇均是影響菜豆組培效果的重要因素，目前常用的激素配比多為生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的不同組合。而菜豆子葉節(jié)具有腋芽的特殊結(jié)構(gòu)，且生長(zhǎng)迅速、出芽快，是菜豆離體再生的良好材料來(lái)源。因而本文以菜豆子葉節(jié)為外植體，研究了不同生長(zhǎng)素即吲哚丁酸（IBA）和萘乙酸（NAA）以及細(xì)胞分裂素6-芐基腺嘌呤（6-BA）和激動(dòng)素（KT）對(duì)菜豆子葉節(jié)誘導(dǎo)不定芽和根的影響，并對(duì)菜豆組培生根苗進(jìn)行煉苗和移植，獲得完整植株，為進(jìn)一步建立菜豆離體再生體系，進(jìn)行菜豆組織快繁及菜豆轉(zhuǎn)基因技術(shù)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)與數(shù)據(jù)支持。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

菜豆“Bean white rice”種子由江漢大學(xué)湖北省豆類(lèi)（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心收集并提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無(wú)菌苗的獲取 選取顆粒飽滿(mǎn)、大小一致的菜豆種子200粒，清水沖洗30 min后0.1%升汞消毒8 min，無(wú)菌水震蕩清洗5～8次，去除殘留在種子上的升汞。最后用無(wú)菌水浸泡種子4 h，使其充分吸脹，倒掉浸泡液，用無(wú)菌濾紙吸干種子表面水分，接種于MS培養(yǎng)基，每個(gè)培養(yǎng)皿3粒種子。消毒和接種過(guò)程均在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行。在培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25℃，光照時(shí)間12 h/d。

1.2.2 菜豆子葉節(jié)不定芽誘導(dǎo) 培養(yǎng)5 d后，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的無(wú)菌苗，在超凈工作臺(tái)上切除其子葉節(jié)上下兩端及兩片子葉，使節(jié)點(diǎn)上端保留約2～5 mm，下端保留約5～10 mm。將子葉節(jié)接種于不同激素濃度配比的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，接種時(shí)子葉節(jié)下端插入培養(yǎng)基，使用培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，每瓶接種3個(gè)子葉節(jié)，每組激素配比接種3瓶作為平行，在培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25℃，光照時(shí)間12 h/d。培養(yǎng)3周，培養(yǎng)過(guò)程中注意觀察污染情況，并切除長(zhǎng)度2 cm以上的不定芽。每隔7 d轉(zhuǎn)一次培養(yǎng)基，記錄一次數(shù)據(jù)，繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基與初代培養(yǎng)相同，記錄芽長(zhǎng)為0～2.0 cm和≥2.0 cm的不定芽個(gè)數(shù)并計(jì)算不定芽分化系數(shù)。培養(yǎng)基以MS為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同濃度的生長(zhǎng)素IBA和NAA以及細(xì)胞分裂素6-BA和KT，激素配比如表1所示。

1.2.3 不定芽生根誘導(dǎo) 誘導(dǎo)出不定芽后，切取長(zhǎng)勢(shì)較好、長(zhǎng)度在2 cm以上的不定芽接種于不同激素濃度配比的生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25℃，光照時(shí)間12 h/d。每7 d觀察記錄不定芽生根情況，生根培養(yǎng)基激素配比如表2所示。

1.2.4 煉苗和移栽 培養(yǎng)數(shù)周后，選取生長(zhǎng)狀態(tài)較好、生根較多較粗壯的再生苗，移栽到裝有滅過(guò)菌的培養(yǎng)土（腐殖土與砂3∶1）的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)1周后將培養(yǎng)瓶的封口膜揭開(kāi)，每天定時(shí)加水，在培養(yǎng)室中培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25℃，光照時(shí)間12 h/d，觀察移栽苗的生長(zhǎng)狀況。

1.3 數(shù)據(jù)分析

分化系數(shù)=外植體上分化的不定芽數(shù)/外植體數(shù)；

生根率（%）=生根的外植體數(shù)/外植體總數(shù)×100%；

數(shù)據(jù)分析軟件采用Microsoft Excel 2013和DPS v7.05處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜豆子葉節(jié)不定芽誘導(dǎo)結(jié)果

如表3所示，在培養(yǎng)1周后，除A號(hào)培養(yǎng)基中的子葉節(jié)長(zhǎng)出根外，其他子葉節(jié)的傷口膨大形成愈傷組織，B～H號(hào)培養(yǎng)基的子葉節(jié)芽點(diǎn)生長(zhǎng)狀態(tài)不佳。I～P號(hào)培養(yǎng)基中的子葉節(jié)生長(zhǎng)狀況良好。培養(yǎng)2周后，A～H號(hào)培養(yǎng)基中的子葉節(jié)腋芽生長(zhǎng)緩慢，I～P號(hào)培養(yǎng)基則誘導(dǎo)出大量的不定芽。培養(yǎng)3周后，I～P號(hào)培養(yǎng)基中的子葉節(jié)仍保持較強(qiáng)活力，芽點(diǎn)繼續(xù)增多，而A～H號(hào)培養(yǎng)基中除了A號(hào)和E號(hào)培養(yǎng)基中的子葉節(jié)保持生長(zhǎng)外，其他培養(yǎng)基中的子葉節(jié)開(kāi)始停止生長(zhǎng)，不定芽分化系數(shù)低。切取長(zhǎng)度超過(guò)2 cm的不定芽后，其他不定芽的生長(zhǎng)加快。比較A～D號(hào)和E～H號(hào)培養(yǎng)基不定芽分化系數(shù)，可以發(fā)現(xiàn)過(guò)高濃度6-BA對(duì)不定芽的分化有一定的抑制作用。I～P號(hào)培養(yǎng)基加入0.1 mg/L KT或者0.2 mg/L NAA后不定芽誘導(dǎo)數(shù)增加，且讓子葉節(jié)長(zhǎng)時(shí)間保持活力，出芽質(zhì)量較好，可見(jiàn)0.1 mg/L KT和0.2 mg/L NAA均有利于不定芽的生長(zhǎng)。I～P號(hào)培養(yǎng)基雖然均能誘導(dǎo)出大量不定芽，但是I～L號(hào)培養(yǎng)基的不定芽多于M～P號(hào)培養(yǎng)基，可見(jiàn)0.1 mg/L KT比0.2 mg/L NAA能更好地促進(jìn)不定芽的生長(zhǎng)。整體來(lái)看，J號(hào)培養(yǎng)基誘導(dǎo)出芽最多，且生長(zhǎng)狀態(tài)較好，因而本試驗(yàn)中不定芽誘導(dǎo)效果最好的培養(yǎng)基激素配比為1.0 mg/L IBA+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT。

2.2 不定芽生根誘導(dǎo)結(jié)果

如表4所示，培養(yǎng)1周后，Ⅰ和Ⅱ號(hào)培養(yǎng)基中的不定芽開(kāi)始長(zhǎng)出根，Ⅲ和Ⅳ號(hào)培養(yǎng)基中不定芽葉片正常生長(zhǎng)，但并未生根，Ⅴ～Ⅷ號(hào)培養(yǎng)基不定芽下端全部形成愈傷組織，且不定芽葉片開(kāi)始發(fā)黃。培養(yǎng)2周后Ⅰ和Ⅱ號(hào)培養(yǎng)基中的不定芽生根濃密，粗大，Ⅲ和Ⅳ號(hào)培養(yǎng)基中也開(kāi)始長(zhǎng)根。培養(yǎng)3周后，生根情況穩(wěn)定，Ⅳ號(hào)培養(yǎng)基中的不定芽生根情況較差，而Ⅴ～Ⅷ號(hào)培養(yǎng)基中的子葉節(jié)則完全沒(méi)生根。Ⅰ、Ⅱ號(hào)培養(yǎng)基中接種的不定芽生根迅速，根較粗壯。Ⅲ、Ⅳ號(hào)培養(yǎng)基中的不定芽生根較為緩慢，且根較為纖細(xì)（圖1）?？梢?jiàn)IBA的濃度過(guò)高會(huì)抑制不定芽根的形成。而Ⅴ～Ⅷ號(hào)培養(yǎng)基中不定芽接種后下端形成愈傷組織，培養(yǎng)兩周后愈傷組織生長(zhǎng)良好，但不定芽葉片開(kāi)始發(fā)黃脫落，且未生成根，可能是由于NAA加入含量過(guò)高引起。本實(shí)驗(yàn)中，Ⅰ號(hào)培養(yǎng)基中不定芽生根情況最佳，所以此次試驗(yàn)中根誘導(dǎo)效果最好的培養(yǎng)基為MS+0.1 mg/L IBA。

表1 不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基的激素配比Tab.1 Hormone proportioning of adventitious bud induction medium/（mg·L-1）

表2 生根培養(yǎng)基的激素配比Tab.2 Hormone proportioning of rooting medium /（mg·L-1）

表3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)不定芽分化系數(shù)的影響Tab.3 Impact of culture time on differentiation coefficient of adventitious bud

表4 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)生根率的影響Tab.4 Impact of culture time on rooting rate /%

圖1 不定芽生根情況Fig.1 Rooting results of adventitious bud

2.3 再生苗的煉苗與移栽

生根培養(yǎng)3周后獲得了一定的再生苗（圖2），將其移入裝有培養(yǎng)土的培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)1周后，打開(kāi)培養(yǎng)瓶封口膜，繼續(xù)培養(yǎng)數(shù)周后，移栽苗仍可正常生長(zhǎng)（圖3）。豆科植物再生困難，成功的例子并不多，煉苗移栽存活率低也是原因之一。此次雖然誘導(dǎo)出再生苗，但是煉苗與移植存活數(shù)目較少，暫時(shí)難以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；€需進(jìn)一步研究提高其存活率。部分再生苗煉苗未成功主要是幼苗太小，根與葉相距q太近，移栽時(shí)易導(dǎo)致葉損傷或根未完全埋入土中，且部分根系不夠長(zhǎng)，未能有效吸收土壤中的營(yíng)養(yǎng)與水分。后期研究中還需延長(zhǎng)再生苗的煉苗時(shí)間，增加其存活率。

圖2 組培再生苗Fig.2 Regeneration seedlings

圖3 移栽苗生長(zhǎng)狀態(tài)Fig.3 Transplanting seedlings

3 討論與結(jié)論

在不定芽誘導(dǎo)過(guò)程中先長(zhǎng)出的不定芽會(huì)對(duì)后長(zhǎng)出的不定芽產(chǎn)生抑制作用，因而需在適當(dāng)?shù)臅r(shí)候切除先長(zhǎng)出的不定芽。王萍等［12］和李曉梅［10］在豇豆研究中，分別在接種時(shí)和培養(yǎng)7 d時(shí)切除腋芽，結(jié)果表明外植體在進(jìn)行芽誘導(dǎo)7 d后切除主腋芽，可以減少愈傷組織的形成概率，增加不定芽的生長(zhǎng)數(shù)量。而本研究也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似結(jié)果，子葉節(jié)誘導(dǎo)出不定芽后，切除長(zhǎng)度超過(guò)2 cm的不定芽后，其他芽的生長(zhǎng)加快。另一方面，子葉節(jié)切取的時(shí)間和切取時(shí)是否攜帶子葉也會(huì)影響不定芽誘導(dǎo)率［13］，本實(shí)驗(yàn)采用菜豆不帶子葉的子葉節(jié)做為外植體，選擇種子培養(yǎng)5 d后切取，此時(shí)子葉節(jié)活性較強(qiáng)，有利于不定芽的分化。

在組織培養(yǎng)過(guò)程中，不同激素濃度的配比是影響組織培養(yǎng)效果的重要因素。細(xì)胞分裂素可以促進(jìn)細(xì)胞分裂，對(duì)外植體分化有很大影響，而生長(zhǎng)素可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)［14］。曹榮等［15］和聶王星等［16］以6-BA和TDZ組合的培養(yǎng)基誘導(dǎo)大豆子葉節(jié)，提高了不定芽誘導(dǎo)率，而本實(shí)驗(yàn)在菜豆子葉節(jié)的誘導(dǎo)過(guò)程中使用6-BA、IBA和KT的組合，對(duì)子葉節(jié)不定芽誘導(dǎo)也有明顯的促進(jìn)效果。同時(shí)，一些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也對(duì)植物不定芽增殖有促進(jìn)作用，商宏俐［17］發(fā)現(xiàn)將豇豆種子浸提液加入培養(yǎng)基也能提高增殖率；FRANKLIN等［18］發(fā)現(xiàn)用L-谷氨酰胺取代培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)氮源也能有效提高出芽率。在后期再進(jìn)一步研究中可嘗試添加部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以增加菜豆子葉節(jié)的芽增殖率。

部分研究表明芽誘導(dǎo)生根時(shí)加入IBA或NAA可以增加生根率［19］，而商宏利［17］以豇豆不定芽在不加任何激素的1/2MS培養(yǎng)基上也誘導(dǎo)出了生根苗；單麗輝［20］和劉曉東等［21］在多葉棘豆的生根培養(yǎng)基中加入0.1 mg/L NAA，生根效果非常明顯；而本次試驗(yàn)中僅加入0.1 mg/L IBA即可成功誘導(dǎo)出根，而再加入0.2 mg/L NAA的培養(yǎng)基反而使不定芽形成愈傷組織，無(wú)法生根，可見(jiàn)選擇恰當(dāng)?shù)募に貪舛扰浔仁呛苤匾摹?/p>

終上所述，添加不同濃度的IBA、NAA、6-BA和KT均對(duì)菜豆子葉節(jié)不定芽誘導(dǎo)有一定的促進(jìn)作用，其中0.1 mg/L KT比0.2 mg/L NAA誘導(dǎo)效果要好，而過(guò)高濃度的6-BA會(huì)抑制不定芽的生長(zhǎng)，綜合比較發(fā)現(xiàn)最佳芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.0 mg/L IBA+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L KT。添加低濃度的IBA即可成功誘導(dǎo)出根，過(guò)高濃度的IBA反而會(huì)導(dǎo)致生根誘導(dǎo)率下降，同時(shí)添加較高濃度的NAA會(huì)導(dǎo)致愈傷組織的形成，無(wú)法生根。綜合比較發(fā)現(xiàn)，最佳生根培養(yǎng)基為MS+0.1 mg/L IBA。本研究通過(guò)菜豆子葉節(jié)誘導(dǎo)獲得了完整的再生植株，成功地建立了菜豆離體再生體系。