覃 玲, 董亞蕾, 王鋼力, 曹 進(jìn), 丁 宏

(中國(guó)食品藥品檢定研究院, 北京 100050)

獸藥在防病治病、促進(jìn)生長(zhǎng)方面應(yīng)用廣泛,但在畜牧養(yǎng)殖過(guò)程中存在一定的濫用、誤用現(xiàn)象,常造成藥物在動(dòng)物體內(nèi)的蓄積,進(jìn)而引起相應(yīng)食材的污染,可能使人體產(chǎn)生耐藥性或過(guò)敏反應(yīng)等副作用,威脅人民飲食健康。目前國(guó)際上通常用最大殘留限量(MRLs)值作為判斷動(dòng)物源性食品質(zhì)量安全的標(biāo)準(zhǔn),比較成熟的MRLs標(biāo)準(zhǔn)體系主要有國(guó)際食品法典委員會(huì)(CAC)、歐盟、美國(guó)、日本以及中國(guó)等[1-3]。建立快速、靈敏、簡(jiǎn)便、可靠的獸藥殘留檢測(cè)方法勢(shì)在必行,對(duì)于保障人民飲食安全具有重要意義。

目前,國(guó)內(nèi)外的獸藥殘留檢測(cè)方法主要有液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜[4-7]、液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜[8,9]和液相色譜-四極桿離子阱質(zhì)譜[10-12]。針對(duì)磺胺類[13]、喹諾酮類[14]、糖皮質(zhì)激素類[15]、β-受體激動(dòng)劑類[16]等單類獸藥的檢測(cè)已有諸多研究,而這些分析方法所能同時(shí)分析的藥物種類較少,無(wú)法滿足目前獸藥種類不斷增加的檢測(cè)需求,不利于潛在風(fēng)險(xiǎn)的發(fā)現(xiàn)。動(dòng)物源性食品中多類獸藥殘留同時(shí)分析方法的開(kāi)發(fā)具有廣闊的應(yīng)用前景,可縮短檢測(cè)周期,降低檢測(cè)成本,提高檢測(cè)效率[17,18]。

在前處理技術(shù)方面,動(dòng)物源性食品中獸藥殘留分析常采用液-液萃取[17]、固相萃取[19-22]、分散固相萃取[23-25]等方法,以去除基質(zhì)干擾,凈化目標(biāo)化合物,提高多獸藥殘留檢測(cè)的靈敏度。本文選擇豬肉、牛肉鮮肉樣品及豬肉脯、牛肉干干肉制品4種代表性基質(zhì),應(yīng)用分散固相萃取方法結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜,建立了同時(shí)測(cè)定磺胺類(9種)、β-受體激動(dòng)劑類(8種)、喹諾酮類(7種)、糖皮質(zhì)激素類(6種)、孕激素類(2種)、氯霉素類(2種)、鎮(zhèn)靜劑類(2種)以及雄激素類、硝基咪唑類、苯并咪唑類、抗病毒類、林可胺類、大環(huán)內(nèi)酯類(各1種)共13類42種獸藥殘留的分析方法,為動(dòng)物源性食品中多獸藥殘留的多成分快速篩查與確認(rèn)提供檢測(cè)依據(jù)。本文在傳統(tǒng)獸藥殘留檢測(cè)選取的鮮肉基質(zhì)基礎(chǔ)上,考察了更為復(fù)雜的肉制品基質(zhì),具有一定的創(chuàng)新性。分散固相萃取前處理方法較傳統(tǒng)固相萃取前處理方法更為快速、便捷,具有更廣闊的應(yīng)用前景。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

LC-MS 8060三重四極桿液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(日本島津公司); arium pro-DI-B純水機(jī)(德國(guó)Sartorius公司); CF 16RXⅡ離心機(jī)(日本HITACHI公司); XP205分析天平(十萬(wàn)分之一)和AL204分析天平(萬(wàn)分之一)(瑞士Mettler公司)。

甲醇、乙腈(均為質(zhì)譜純,ThermoFisher公司);甲酸(質(zhì)譜純,Fluka公司);甲酸(分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);實(shí)驗(yàn)室用水為超純水;WondaPak QuEChERS多獸殘專用提取包與凈化包(日本島津技邇公司); 42種獸藥標(biāo)準(zhǔn)品分別購(gòu)自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer公司和中國(guó)食品藥品檢定研究院,純度90.3%～99.9%。

實(shí)際樣品購(gòu)自當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別以甲醇配制質(zhì)量濃度為1 g/L的各獸藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,其中吡哌酸用10%(v/v)醋酸甲醇溶液配制。取適量?jī)?chǔ)備液,以甲醇配制42種獸藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,其中妥洛特羅、班布特羅、氟哌啶醇的質(zhì)量濃度為10 mg/L,其余為50 mg/L,置于-18 ℃下避光保存。

分別吸取適量標(biāo)準(zhǔn)工作溶液用空白基質(zhì)提取液稀釋定容,配制成不同濃度的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3 樣品前處理方法

鮮肉樣品:準(zhǔn)確稱取均質(zhì)后的樣品2.50 g于50 mL塑料離心管中,加入3 mL水渦旋混合1 min,再加入5 mL 5%(v/v)甲酸乙腈渦旋混合1 min,超聲提取10 min。加入WondaPak QuEChERS多獸殘專用提取包4 g,劇烈振搖1 min,于10 ℃以8 000 r/min下離心10 min。取1 mL上清液轉(zhuǎn)移至WondaPak QuEChERS多獸殘專用凈化包中,渦旋混合1 min, 12 000 r/min下離心5 min。取上清液,過(guò)0.22 μm微孔濾膜,取濾液進(jìn)行LC-MS/MS分析。

干肉制品:準(zhǔn)確稱取絞碎后樣品2.50 g于50 mL塑料離心管中,直接加入5 mL 5%(v/v)甲酸乙腈,同法進(jìn)行提取與凈化。

1.4 儀器條件

1.4.1色譜條件

色譜柱:Shim-pack GIST C18柱(100 mm×2.1 mm, 2 μm);柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:5 μL;流動(dòng)相:A相為0.1%(v/v)甲酸水溶液,B相為甲醇。梯度洗脫程序:0～4 min, 5%B～30%B; 4～10 min, 30%B～60%B; 10～12 min, 60%B～95%B; 12～17 min, 95%B; 17～18 min, 95%B～5%B; 18～23 min, 5%B。

1.4.2質(zhì)譜條件

離子源:電噴霧離子源(ESI);掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)掃描;霧化氣流速:3 L/min;干燥氣流速:5 L/min;加熱氣流速:15 L/min;加熱模塊溫度:300 ℃;脫溶劑管溫度:250 ℃;離子源溫度:250 ℃。42種獸藥的其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表 1 42種獸藥的質(zhì)譜參數(shù)

tR: retention time; CE: collision energy. *Quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

本研究對(duì)比了Shim-pack GIST C18柱和Waters CORTECS UPLC C18柱的分離效果,發(fā)現(xiàn)后者喹諾酮類化合物峰形差、響應(yīng)低,磺胺噻唑、地西泮、炔諾酮峰分叉;而前者的分離效果和峰形都更優(yōu),因此最終選用Shim-pack GIST C18柱。

本研究采用甲醇作為有機(jī)相,考察了在水相中添加0.1%(v/v)甲酸、10 mmol/L乙酸銨、10 mmol/L甲酸銨對(duì)色譜分離和質(zhì)譜響應(yīng)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),添加甲酸銨和乙酸銨時(shí)喹諾酮類化合物峰形差、響應(yīng)低;添加甲酸時(shí)提高了在正離子模式下檢測(cè)的目標(biāo)物的響應(yīng)值,在負(fù)離子模式下檢測(cè)的3種目標(biāo)物也能獲得合適的響應(yīng)值,且峰形良好、分離效果佳。因此,本研究最終采用甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液作為流動(dòng)相。42種獸藥化合物的總離子流圖見(jiàn)圖1。

圖 1 42種獸藥的總離子流圖Fig. 1 Total ion chromatograms of the 42 veterinary drugsFor peak Nos., see Table 1.

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在電噴霧離子源下,分別對(duì)各獸藥化合物的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行正離子和負(fù)離子全掃描,確定各化合物的準(zhǔn)分子離子;將其作為母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描,選取豐度較強(qiáng)、干擾較小的兩對(duì)子離子為特征離子,其中豐度相對(duì)最強(qiáng)的為定量離子,其次為定性離子;進(jìn)一步優(yōu)化碰撞能量和Q1、Q3四極桿電壓。優(yōu)化得到的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

在多殘留檢測(cè)中,離子駐留時(shí)間(dwell time)對(duì)靈敏度和定量準(zhǔn)確性有重要影響。采集通道的增加會(huì)使分配給每個(gè)采集通道的離子駐留時(shí)間減少,而維持長(zhǎng)的離子駐留時(shí)間又會(huì)影響每個(gè)MRM通道的采集點(diǎn)數(shù),進(jìn)而影響圖譜質(zhì)量與定量準(zhǔn)確性。為了保證同時(shí)檢測(cè)42種獸藥的靈敏度與準(zhǔn)確性,需要權(quán)衡離子駐留時(shí)間和采集點(diǎn)數(shù)兩個(gè)因素。本研究采用分段掃描模式進(jìn)行不同化合物數(shù)據(jù)的采集,根據(jù)出峰時(shí)間分為4段:3～7 min, 6～8 min, 7～12 min, 11～15 min;從而減少了采集通道的冗余,保證了離子的駐留時(shí)間。

2.3 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1提取溶劑的選擇

本研究涉及的42種獸藥極性較強(qiáng),而畜肉中主要基質(zhì)干擾是蛋白質(zhì)、脂肪及少量色素。選取極性溶劑進(jìn)行提取,可保證提取效率,又盡可能地去除了基質(zhì)中的干擾物。乙腈、甲醇具有良好的沉淀蛋白質(zhì)及提取目標(biāo)化合物的能力,然而用甲醇提取時(shí)會(huì)帶入更多的極性基質(zhì)干擾物,影響提取效率,因此選擇乙腈作為提取溶劑。以豬肉基質(zhì)為例,當(dāng)在乙腈中加入適量甲酸或乙酸時(shí),由于大部分目標(biāo)化合物呈弱堿性,離子化效率得到提高,平均提取回收率明顯增加;而甲酸酸性強(qiáng)于乙酸,平均提取回收率稍大于乙酸。實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步對(duì)乙腈中甲酸的添加比例進(jìn)行了探索,發(fā)現(xiàn)5%(v/v)甲酸乙腈的平均提取回收率高于1%(v/v)甲酸乙腈與10%(v/v)甲酸乙腈;其中磺胺類化合物在酸度偏低時(shí),在溶液中的解離度降低,影響了提取回收率;而在酸度偏高時(shí),可能發(fā)生一定程度的降解,也影響提取回收率[26]。本研究還進(jìn)行了80%(v/v)乙腈水溶液的提取回收率實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)不如5%(v/v)甲酸乙腈的提取回收率高。因此,最終選擇5%(v/v)甲酸乙腈作為提取溶劑。不同提取溶劑對(duì)42種獸藥平均回收率的影響見(jiàn)圖2。

圖 2 不同提取溶劑對(duì)42種獸藥平均回收率的影響Fig. 2 Effect of different extraction solvents on the average recoveries of the 42 veterinary drugsMeOH: methanol; HAc: acetic acid; ACN: acetonitrile.

由于畜肉樣品比較黏稠,絞碎后不容易分散。勻漿機(jī)廣泛用于分散畜肉樣品,然而部分樣品會(huì)附著在勻漿機(jī)的搗桿上造成目標(biāo)化合物的損失。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),水具有良好的組織滲透性,當(dāng)在樣品中預(yù)先加入水時(shí),能夠良好地分散樣品,增加有機(jī)溶劑與樣品的接觸面積;而且水的極性強(qiáng),對(duì)于強(qiáng)極性化合物的提取能力也強(qiáng)。因此,在提取樣品時(shí)應(yīng)預(yù)先加入少量水分散樣品。干肉制品黏稠度小,直接采用提取溶劑就可均勻分散,不需加入水。

2.3.2凈化條件的選擇

本研究涉及13類獸藥的檢測(cè),參考國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn),不同類別獸藥分別用HLB、C18、MCX固相萃取小柱進(jìn)行凈化,或直接采取液-液萃取方式凈化。以豬肉基質(zhì)為例,考察了HLB、C18以及MCX固相萃取小柱的凈化效果,發(fā)現(xiàn)HLB固相萃取小柱僅對(duì)部分磺胺類、喹諾酮類、糖皮質(zhì)激素類、β-受體激動(dòng)劑類獸藥以及羅紅霉素、氯霉素回收率高;C18固相萃取小柱平均回收率為67.86%,其中磺胺噻唑、恩諾沙星、雙氟沙星、氟哌啶醇、沙美特羅的回收率極低;MCX固相萃取小柱僅對(duì)部分β-受體激動(dòng)劑類獸藥回收率高。

根據(jù)文獻(xiàn)[27],本工作考慮采用基質(zhì)分散固相萃取的方法進(jìn)行凈化。WondaPak QuEChERS多獸殘專用提取包與凈化包及Agilent Bond Elut EMR-Lipid萃取包與反萃管是基于基質(zhì)分散固相萃取法開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品,實(shí)驗(yàn)比較了這兩種方法的凈化效果,發(fā)現(xiàn)兩者對(duì)42種獸藥化合物均有較好的凈化效果,而使用前者回收率稍高于后者,且操作更為方便快捷,因此本實(shí)驗(yàn)選取前者作為提取液的凈化方法。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

基質(zhì)效應(yīng)是由基質(zhì)中的共提干擾物與目標(biāo)化合物競(jìng)爭(zhēng)電離所致,對(duì)目標(biāo)化合物的靈敏度、準(zhǔn)確度和分析方法的重現(xiàn)性等產(chǎn)生影響?；|(zhì)效應(yīng)=基質(zhì)匹配校準(zhǔn)曲線的斜率/溶劑標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線的斜率[28],比值越接近1,則基質(zhì)效應(yīng)越小,反之亦然;若比值在0.8～1.2范圍內(nèi),則表明基質(zhì)效應(yīng)不明顯。4種樣品的基質(zhì)效應(yīng)見(jiàn)表2。結(jié)果表明,干肉制品的基質(zhì)效應(yīng)大于鮮肉樣品,這可能與干肉制品的低含水量有關(guān),且干肉制品的加工工藝復(fù)雜,添加的調(diào)料可能增大基質(zhì)干擾,使基質(zhì)效應(yīng)明顯。4種樣品基質(zhì)中,42種獸藥化合物中的38%以上化合物基質(zhì)效應(yīng)明顯,其中甲睪酮、福莫特羅最為明顯,因此采用空白基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線以降低基質(zhì)效應(yīng)的影響。

表 2 42種獸藥在4種樣品基質(zhì)中的基質(zhì)效應(yīng)

2.5 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限與定量限

配制基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,在優(yōu)化的分析條件下進(jìn)行檢測(cè)。以目標(biāo)化合物定量離子的峰面積對(duì)含量做標(biāo)準(zhǔn)曲線,4種動(dòng)物源性食品樣品中的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.995。以定量離子的信噪比(S/N)=3和S/N=10分別計(jì)算,各獸藥化合物在4種動(dòng)物源性食品樣品基質(zhì)中的檢出限(LOD)和定量限(LOQ)分別為0.01～1.68 μg/kg和0.01～5.62 μg/kg。各目標(biāo)化合物在牛肉基質(zhì)中的線性關(guān)系、LOD和LOQ見(jiàn)表3。

表 3 (續(xù))

Y: peak area;X: content, μg/kg.

2.5.2回收率與精密度

在鮮豬肉、鮮牛肉、豬肉脯、牛肉干4種空白樣品中進(jìn)行3個(gè)水平的加標(biāo)回收試驗(yàn),每個(gè)水平進(jìn)行6次平行試驗(yàn),加標(biāo)水平從小到大標(biāo)記為L(zhǎng)evel 1、2、3。在鮮肉樣品中,妥洛特羅、班布特羅的添加水平為2、8、40 μg/kg,氟哌啶醇的添加水平為8、20、40 μg/kg,萊克多巴胺、恩諾沙星、馬布特羅的添加水平為10、40、100 μg/kg,甲砜氯霉素的添加水平為40、100、200 μg/kg,其余獸藥化合物的添加水平均為10、40、200 μg/kg。在干肉制品中,妥洛特羅、班布特羅、氟哌啶醇的添加水平為8、20、40 μg/kg,萊克多巴胺、恩諾沙星、馬布特羅的添加水平為10、40、100 μg/kg,其余獸藥化合物的添加水平為40、100、200 μg/kg。

結(jié)果(見(jiàn)表4)表明,4種基質(zhì)中所有化合物回收率的RSD均小于15%,滿足精密度要求。大多數(shù)化合物在4種樣品基質(zhì)的3個(gè)添加水平下的平均回收率為65.8%～135.5%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.5%～14.2% (n=6),結(jié)果較為理想。對(duì)于回收率低于一般定量要求的個(gè)別化合物,在實(shí)際測(cè)定中,可以考慮采用折算的方式對(duì)含量進(jìn)行估算,繼而開(kāi)發(fā)單獨(dú)的方法進(jìn)行準(zhǔn)確定量測(cè)定。

表 4 42種獸藥在4種樣品基質(zhì)中的加標(biāo)回收率(n=6)

表 4 (續(xù))

* Nos. are the same as in Table 3.

2.6 實(shí)際樣品測(cè)定

采用本研究建立的分析方法對(duì)購(gòu)自超市的豬肉、牛肉及豬肉脯、牛肉干、手撕牛肉、火腿腸、香腸類肉制品進(jìn)行檢測(cè)。其中,豬肉制品的定量測(cè)定以豬肉脯基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算,牛肉制品的定量測(cè)定以牛肉干基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)計(jì)算。在一例牛肉樣品中檢出環(huán)丙沙星,其保留時(shí)間差異低于0.5 min,豐度比偏差低于20%,檢出含量為53.4 μg/kg,其他樣品中均無(wú)藥物殘留檢出。雖然代表性基質(zhì)可能無(wú)法完全匹配新類型樣品的基質(zhì)性質(zhì),但對(duì)于樣品中獸藥殘留的含量測(cè)定也具有一定的參考意義。若通過(guò)此法篩查出了目標(biāo)化合物,要增加相應(yīng)基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行準(zhǔn)確定量計(jì)算。由于本方法的靈敏度高、檢出限低,使用代表性基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量計(jì)算對(duì)于樣品中的風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)監(jiān)測(cè)不會(huì)造成假陰性結(jié)果。

3 結(jié)論

本文利用基質(zhì)分散固相萃取方法結(jié)合高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法,建立了4種代表性的動(dòng)物源性食品樣品基質(zhì)中13類42種獸藥殘留的測(cè)定方法。該方法快速、簡(jiǎn)便、靈敏,能夠?qū)悠分械哪繕?biāo)化合物進(jìn)行準(zhǔn)確的定性和定量分析,適用于動(dòng)物源性食品樣品中多獸藥殘留的快速檢測(cè)。