楊 直, 彭 彥, 金朦娜, 林麗琴

(杭州市食品藥品檢驗(yàn)研究院, 浙江 杭州 310022)

近年來,隨著過敏性疾病發(fā)病率的顯著提升,過敏性問題已經(jīng)成為大眾關(guān)注的問題[1]。目前市場上存在一些宣稱有抗過敏作用的中成藥和保健食品非法添加抗過敏的化學(xué)藥物,特別是療效好且起效快的產(chǎn)品[2]。過敏反應(yīng)分4種類型,其中Ⅰ型過敏反應(yīng)是最常見的類型,組胺在Ⅰ型過敏反應(yīng)中占有重要作用,因此臨床上應(yīng)用最多的抗過敏藥物就是抗組胺藥[3],抗組胺藥分為H1和H2受體拮抗藥,與過敏反應(yīng)相關(guān)的是H1受體,作為抗過敏的H1受體拮抗劑根據(jù)分子結(jié)構(gòu)主要分為氨基醚類等6大類。

國內(nèi)外對于抗過敏藥物的檢測方法主要有:高效液相色譜-紫外檢測(HPLC-UV)法[2,4]、毛細(xì)管電泳(CE)法[5,6]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS/MS)法[7-9]、氣相色譜(GC)法[10]、原子吸收光譜(AAS)法[11]等。這些檢測方法均只涉及部分H1受體拮抗劑品種的檢測,并沒有對目前國內(nèi)常用的抗過敏化學(xué)藥物在中成藥和保健食品非法添加領(lǐng)域進(jìn)行系統(tǒng)性檢測。

超臨界流體色譜(SFC)分離原理與氣相色譜和液相色譜一致,主要利用超臨界流體兼具液體的溶解能力和氣體的低黏度高擴(kuò)散能力而進(jìn)行物質(zhì)的分離分析[12,13]。SFC適合分析熱不穩(wěn)定化合物、難揮發(fā)化合物、液相色譜難以分離的極性化合物[14,15]和手性化合物[16-18]。同時(shí)由于超臨界流體色譜主要采用CO2作為流動相,因此還有經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的優(yōu)勢。

超臨界流體色譜作為一種成熟的分析技術(shù)還應(yīng)用于中成藥和保健食品的非法添加檢測領(lǐng)域。本研究選擇了12種臨床上常用的H1受體拮抗劑類抗過敏化學(xué)藥物進(jìn)行研究,它們分別為氨基醚類(苯海拉明、茶苯海明、氯馬斯汀)、乙二胺類(安他唑啉、曲吡那敏)、三環(huán)類(異丙嗪、賽庚啶、氯雷他定)、丙胺類(氯苯那敏)、哌嗪類和哌啶類(阿司咪唑、地氯雷他定、去氯羥嗪)。利用超臨界流體-色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)建立了12種抗過敏化學(xué)藥物的分析方法,同時(shí)考慮到中成藥和保健食品基質(zhì)復(fù)雜,存在基質(zhì)效應(yīng),利用固相萃取的前處理技術(shù)對樣品的基質(zhì)干擾進(jìn)行了排除,實(shí)現(xiàn)了復(fù)雜基質(zhì)中多組分抗過敏化學(xué)藥物定性、定量分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Waters ACQUITY超高效合相色譜儀(UPC2)配Xevo TQD三重四極桿質(zhì)譜檢測器,ACQUITY UPC2Trefoil CEL1色譜柱(150 mm×3.0 mm, 2.5 μm), Oasis MCX固相萃取柱(規(guī)格:3 mL/60 mg, 30 μm), Oasis PRiME HLB萃取柱(規(guī)格:3 mL/60 mg, 30 μm)(美國Waters公司); Milli-Q超純水器(美國Millipore公司); KQ600DV超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司); METTLER XS205DU電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)。

二氧化碳(純度≥99.99%,上海振信公司);甲醇和乙腈(均為色譜純,純度≥99.9%,美國Merck公司);甲酸(色譜純,純度99%,美國ACS恩科化學(xué)公司);氨水(分析純,上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)。鹽酸苯海拉明(100066-200807,純度99.9%)、富馬酸氯馬斯汀(100229-200803,純度99.9%)、鹽酸安他唑啉(100216-200702,純度100.0%)、鹽酸異丙嗪(100422-201603,純度99.5%)、鹽酸賽庚啶(100502-200401,純度100.0%)、氯雷他定(100615-201404,純度100.0%)、馬來酸氯苯那敏(100047-200606,純度99.7%)、阿司咪唑(100301-199901,純度100.0%)、地氯雷他定(100919-200902,純度99.7%)、鹽酸去氯羥嗪(100262-201302,純度99.1%)、茶苯海明(100120-201504,純度99.7%)均購自中國食品藥品檢定研究院;鹽酸曲吡那敏(批號:108377,純度99.5%)購自德國Dr. Ehrenstorfer公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液:分別稱取12種對照品各25 mg置于50 mL量瓶中,用甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為標(biāo)準(zhǔn)儲備液。分別精密量取上述溶液各1 mL置于同一50 mL量瓶中,加甲醇稀釋至刻度,搖勻,配制成質(zhì)量濃度均為10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

混合標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液:用5%(體積分?jǐn)?shù),下同)氨化甲醇(含5%氨水)將混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制成質(zhì)量濃度為5、10、20、25、50、100、200和250 μg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

1.3 樣品前處理

樣品溶液的提取:精密稱取0.2～0.3 g固體樣品(片劑研細(xì)混勻,膠囊劑取內(nèi)容物混勻),或精密量取2.0～3.0 mL溶液(溶液劑取樣前需搖勻),置于10 mL量瓶中,加入適量甲醇,超聲提取處理(40 KHz, 20 min),放置冷卻至室溫,用甲醇定容至刻度,搖勻,使用0.45 μm混合型濾膜過濾。精密量取續(xù)濾液1.0 mL,與9.0 mL 2%甲酸水溶液混勻,待凈化。

樣品溶液的凈化:上述提取溶液轉(zhuǎn)移至Oasis MCX萃取柱中,待提取液完全通過后,用3 mL水淋洗,抽至近干,用5 mL 5%氨化甲醇(含5%氨水)洗脫,并抽干。整個(gè)萃取過程控制流速約為1 mL/min。收集洗脫液,用0.22 μm混合型濾膜過濾,取續(xù)濾液待測。

1.4 分析條件

色譜柱:ACQUITY UPC2Trefoil CEL1色譜柱;柱溫:45 ℃;流動相:A為CO2, B為0.1%氨水甲醇溶液。梯度洗脫條件:0～0.2 min, 95%A; 0.2～10.0 min, 95%A～45%A; 10.0～12.0 min, 45%A; 12.0～14.0 min, 45%A～95%A。背壓:12.4×106Pa;流速:1.2 mL/min;進(jìn)樣量:0.5 μL。

離子源:電噴霧離子源,除茶苯海明(以8-氯茶堿為檢測物質(zhì))采用負(fù)離子模式(ESI-)外,其余均采用正離子模式(ESI+);掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);離子源溫度(TEM): 150 ℃;毛細(xì)管電壓:3 000 V;脫溶劑溫度:500 ℃;脫溶劑氣流速:1 000 L/h;錐孔反吹氣流速:50 L/h。12種抗過敏化學(xué)藥物的母離子、子離子、錐孔電壓和碰撞能量參數(shù)詳見表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

本研究中的12種化學(xué)藥物在甲醇中的溶解性均較好,考慮到甲醇是極性較大的有機(jī)溶劑,樣品浸潤能力較好,選擇甲醇為樣品提取溶劑。超聲提取時(shí)間考察了10、20和30 min,綜合考慮樣品的浸潤時(shí)間和提取效率,最終選擇超聲時(shí)間為20 min。

表 1 12種抗過敏化學(xué)藥物的母離子、子離子、錐孔電壓和

* Quantitative ion.

12種化學(xué)藥物均屬于有機(jī)堿類化合物,分子結(jié)構(gòu)上基本都含有O、N、S等電負(fù)性的雜原子,容易獲得質(zhì)子,pKa值基本在7.5～9.5之間,具有弱堿性。結(jié)合化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),考察了具有較強(qiáng)反相吸附作用力的強(qiáng)親水性O(shè)asis PRiME HLB萃取柱和具有離子吸附和反相吸附混合作用力的Oasis MCX固相萃取柱對樣品的萃取凈化能力。采用Oasis PRiME HLB萃取柱時(shí),12種化學(xué)藥物的平均回收率為65%～118%,特別是氯雷他定,回收率僅為65%;采用Oasis MCX萃取柱時(shí),12種化學(xué)藥物的平均回收率為85%～96%,符合分析要求,這與Oasis MCX萃取柱具備兩種結(jié)合能力有關(guān)。

同時(shí)還考察了樣品待凈化溶液的組成、淋洗液和洗脫液的種類3個(gè)影響提取效率的因素。比較了甲醇提取液與水、2%甲酸溶液、4%甲酸溶液和8%甲酸溶液以1∶10(v/v)混合制備的4種樣品待凈化溶液。比較了水、10%甲醇、20%甲醇和30%甲醇4種淋洗液。比較了3、5和10 mL甲醇及3、5和10 mL 5%氨化甲醇6種洗脫液。通過優(yōu)化條件,最終選擇用2%甲酸溶液進(jìn)行甲醇提取液的酸化,3 mL水淋洗,5 mL 5%氨化甲醇洗脫為最優(yōu)前處理?xiàng)l件。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

SFC的原理融合了氣相色譜和液相色譜的特點(diǎn),配合SFC專用色譜柱能達(dá)到最佳的分析效果。本研究考察了UPC2配套使用3根色譜柱(Trefoil CEL1、Trefoil AMY1和Trefoil CEL2)時(shí)待分析成分的保留時(shí)間、相鄰峰的分離度以及峰拖尾情況,Trefoil CEL1各方面表現(xiàn)最佳。

二氧化碳為非極性流動相,要進(jìn)行有機(jī)堿類化合物的分離,需要在流動相中添加極性溶劑進(jìn)行改性,本研究考察了甲醇、乙醇、乙腈3種添加劑。同時(shí)為了減少峰拖尾現(xiàn)象,添加了0.1%氨水增加流動相的pH值,可抑制待分析化合物的電離,減少與色譜柱中硅醇基的相互作用。在考察的添加劑中,甲醇極性最大,流動相極性可調(diào)范圍最大,并且與樣品溶液的溶劑一致,兼容性較好,峰形對稱,并且化合物的保留時(shí)間相對較短,因此選擇0.1%氨水甲醇溶液為添加劑。

色譜系統(tǒng)的背壓與流速相關(guān)聯(lián),在1.2 mL/min的流速下考察了11.0×106、12.4×106和14.5×106Pa 3個(gè)背壓條件。隨著背壓的升高,色譜峰的保留時(shí)間提前,主要是由于背壓升高導(dǎo)致超臨界二氧化碳的密度升高,增加了流動相的洗脫能力。綜合考慮各化合物的保留時(shí)間和分離度,選擇背壓為12.4×106Pa。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

取適量混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液,分別在正離子模式和負(fù)離子模式下進(jìn)行測試。茶苯海明由8-氯茶堿和苯海拉明組成,鑒于苯海拉明屬于待測化合物之一,因此以8-氯茶堿作為檢測對象,間接測定茶苯海明的含量。12種化學(xué)藥物中除8-氯茶堿采用ESI-模式以外,其他11種化合物均采用ESI+模式。同時(shí)在確定各化合物的MRM參數(shù)時(shí),采用軟件IntelliStart自動進(jìn)行質(zhì)譜方法的開發(fā)和優(yōu)化,確定子離子碎片、最佳錐孔電壓和碰撞電壓。以曲吡那敏為例,其母離子、子離子、錐孔電壓和碰撞電壓的優(yōu)化見圖1。

圖 1 曲吡那敏的母離子、子離子、錐孔電壓和碰撞電壓優(yōu)化Fig. 1 Optimization of parent ion, daughter ion, zone voltage, and collision voltage of tripelennamine

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1線性關(guān)系

將混合標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液按照優(yōu)化后分析條件進(jìn)行測定,12種抗過敏化學(xué)藥物的總離子流圖見圖2。以質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)中化合物定量子離子的峰面積(Y)為縱坐標(biāo),化合物的質(zhì)量濃度(X, μg/L)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸,結(jié)果見表2。數(shù)據(jù)表明,12種化學(xué)藥物在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.998。

表 2 12種抗過敏化學(xué)藥物的校準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限和回收率(n=6)

* Values from left to right represented the results of low, medium and high spiked levels;Y: peak area;X: mass concentration, μg/L.

2.4.2檢出限和定量限

取空白片劑基質(zhì)樣品,研細(xì)混勻,精密稱取相當(dāng)于一片的量,置于10 mL量瓶中,加入一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液,然后按照1.3節(jié)方法處理,進(jìn)行檢測,以各化合物二級質(zhì)譜中的定量離子為參考指標(biāo),12種化學(xué)藥物的檢出限及定量限檢測結(jié)果見表2。

2.4.3準(zhǔn)確度和精密度

取空白片劑基質(zhì)樣品,研細(xì)混勻,精密稱取約相當(dāng)于一片的量,置于10 mL容量瓶中,分別加入0.5、1和5 mL混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液,每個(gè)水平制備6份樣品,進(jìn)行加標(biāo)回收率的評價(jià)。準(zhǔn)確度(回收率)和精密度(RSD)結(jié)果見表2。

圖 2 12種抗過敏化學(xué)藥物的總離子流色譜圖Fig. 2 Total ion chromatograms of the 12 anti- allergic chemical drugs Peak Nos.: 1. diphenhydramine; 2. chlorphenamine; 3. tripelennamine; 4. promethazine; 5. clemastine; 6. decloxizine; 7. cyproheptadine; 8. loratadine; 9. dimenhydrinate; 10. desloratadine; 11. antazoline; 12. astemizole.

2.4.4穩(wěn)定性

取混合標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液(質(zhì)量濃度為100 μg/L),分別于放置0、1、3、5、8 h時(shí)后進(jìn)樣測定,比較各化合物的峰面積。結(jié)果表明,12種化學(xué)藥物峰面積的RSD為2.9%～8.3%,表明溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5 實(shí)際樣品分析

應(yīng)用本方法對市售的10批中成藥和11批保健食品進(jìn)行定量分析,樣品的劑型包括片劑、膠囊劑、溶液劑和顆粒劑,基本涵蓋了常見劑型。結(jié)果在6批次樣品中檢出2種抗過敏的化學(xué)藥物,氯苯那敏的添加量為0.41～14.6 mg/g,苯海拉明的添加量為1.69 mg/g。本研究組在建立超臨界流體色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的分析方法同時(shí)還建立了高效液相色譜分析方法,通過對樣品檢測結(jié)果的比較發(fā)現(xiàn),兩種測定方法的結(jié)果基本一致(見表3)。

表 3 21批次樣品測定結(jié)果

3 結(jié)論

本研究建立了經(jīng)固相萃取凈化處理,利用超臨界流體色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)快速測定中成藥和保健食品中12種抗過敏化學(xué)藥物的分析方法,該方法穩(wěn)定性較好,準(zhǔn)確、快速,可作為篩選抗過敏化學(xué)藥物非法添加的補(bǔ)充檢驗(yàn)手段。但是本研究未對該12種抗過敏化學(xué)藥物的衍生物進(jìn)行研究,因此不能用于可能具有相同功效的衍生物的篩查工作,對于該類衍生物的分析研究有待下一步工作的開展。