王振棟，宿玲恰，吳敬*

1(江南大學(xué)，食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 3(江南大學(xué)，教育部食品安全國際合作聯(lián)合實驗室，江蘇 無錫，214122)

麥芽寡糖基海藻糖水解酶[1](maltooligosyltrehalose trehalohydrolase, MTHase)是一種水解α-1,4-糖苷鍵的新型水解酶，被歸類在水解酶家族(GH13)中。MTHase能夠特異性結(jié)合麥芽寡糖基海藻糖，通過識別底物的非還原端海藻糖部分水解鄰近的α-1,4-糖苷鍵生成海藻糖[2]。海藻糖在真菌和霉菌的孢子萌發(fā)階段和昆蟲體內(nèi)作為一種能量來源，還是許多生物體抵御不良環(huán)境的重要物質(zhì)。海藻糖對生物大分子如蛋白質(zhì)有良好的抗逆保護功能，因此作為一種添加劑廣泛地用于食品、醫(yī)藥和化妝品領(lǐng)域[3]。

工業(yè)上合成海藻糖的生物酶法主要是利用MTSase 和MTHase雙酶體系法。該雙酶法是利用淀粉或麥芽糊精作為底物，底物進入MTSase的底物結(jié)合部位且還原端的葡萄糖進入+1位點，隨后MTSase會將底物還原端的α-1,4-糖苷鍵進行水解生成麥芽寡糖和葡萄糖，再將葡萄糖與麥芽寡糖通過α-1,1-糖苷鍵結(jié)合生成產(chǎn)物麥芽寡糖基海藻糖。MTHase識別麥芽寡糖基海藻糖的海藻糖部分并水解鄰近α-1,1-鍵的α-1,4-糖苷鍵生成海藻糖和減少2個葡萄糖的麥芽寡糖。與海藻糖合成酶和另一種雙酶法體系(6-磷酸海藻糖合成酶[4]和6-磷酸海藻糖磷酸酯酶[5])相比，該雙酶法的優(yōu)點在于能夠利用低成本的淀粉或麥芽糊精為底物，對底物的利用率較高，反應(yīng)過程產(chǎn)生的葡萄糖和麥芽糖等副產(chǎn)物較少，且該反應(yīng)不需要能量的消耗，海藻糖的轉(zhuǎn)化率較高，利于海藻糖下游生產(chǎn)工藝的分離與純化。

SulfolobusacidocaldariusATCC 33909 MTHase (SaMTHase) 的相對分子質(zhì)量約為64 kDa，主要有556個氨基酸組成。該酶由NAKADA等人[6]最先研究和報道，他們于1995年成功地在大腸桿菌中進行重組表達SaMTHase[7]，并對異源蛋白SaMTHase進行了蛋白純化和酶學(xué)性質(zhì)方面的研究。實驗結(jié)果表明，該酶的最適溫度為75 ℃，最適pH值為5.5～6.0，pH穩(wěn)定性的范圍在5.5～9.5之間，溫度穩(wěn)定性最高達到85 ℃，以麥芽四糖基海藻糖為底物的Km值為3.7 mmol/L。隨后NAKADA等人以淀粉為底物，在pH值為5.5，最適溫度為55～57 ℃的條件下通過添加脫支酶(異淀粉酶或普魯蘭酶)和環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)復(fù)配SaMTSase和SaMTHase實現(xiàn)海藻糖的高轉(zhuǎn)化率[8]。研究結(jié)果表明，異淀粉酶的效果比普魯蘭酶的效果好。2015年王珊瑛等人[9]將SaMTHase在枯草芽孢桿菌中進行重組表達，同時以淀粉為底物通過雙酶法生產(chǎn)海藻糖。實驗結(jié)果表明，在60 ℃條件下反應(yīng)12 h，在沒有加脫支酶的情況下最終的海藻糖轉(zhuǎn)化率達到33.57%。SaMTHase異源表達無論在大腸桿菌還是在枯草芽孢桿菌中，其可溶性蛋白表達量非常低，因此有必要對SaMTHase的基因工程改造以提高其可溶性表達[10]，同時不改變其酶學(xué)性質(zhì)和海藻糖的轉(zhuǎn)化率。

本實驗基于前期工作中獲得的1株蛋白表達量提高約2倍的突變株L202P/L218D/Y323G，對其SaMTHase進行酶學(xué)性質(zhì)研究。以麥芽糊精為底物，在普魯蘭酶的作用下，對SaMTSase和突變株L202P/L218D/Y323G SaMTHase分別以不同的比例作用生產(chǎn)海藻糖，測定海藻糖的轉(zhuǎn)化率。

1 材料與方法

1.1 材料

S.acidocaldariusATCC 33909 來源的TreZ基因及pET-24a(+)-TreZ的質(zhì)粒由實驗室前期保藏，PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。大腸桿菌(Escherichiacoli) JM 109作為克隆宿主、E.coliBL 21(DE3)作為表達宿主和pET-24a(+)作為表達載體，都為本實驗室前期保藏。突變株L202P/L218D/Y323G為前期實驗室已構(gòu)建。

發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)過改進后，更適合工業(yè)化生產(chǎn)。主要成分(g/L)：工業(yè)蛋白胨12、工業(yè)酵母粉24、甘油5、K2HPO416.43和KH2PO42.31，調(diào)整pH值到7.0。

3 L罐種子發(fā)酵培養(yǎng)基成分(g/L)：NaCl 10，工業(yè)酵母粉 5，工業(yè)蛋白胨 10。

3 L 罐發(fā)酵培養(yǎng)基成分(g/L)：微量元素液10 mL，甘油 8，(NH4)2HPO4，工業(yè)酵母粉2，工業(yè)蛋白胨1，檸檬酸 1.7，MgSO4·7H2O 1.4，KH2PO413.5，pH 7.0。

1.2 試劑

克隆載體pMD19-T simple vector、T4 DNA Ligase 連接酶、DNA 聚合酶 Primer STAR?HS、限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和Hind Ⅲ購自大連寶生物工程有限公司?？敲顾?Kanamycin, Kana)和氯霉素購自上海生工生物工程有限公司。麥芽四糖、麥芽六糖和麥芽糊精(DE值5～7)購自Sigma公司。其他試劑購自上海國藥集團有限公司。

1.3 儀器

超聲波細(xì)胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；BioFlo/CelliGen 115 發(fā)酵罐，Eppendorf NBS公司；AKTA avant 蛋白純化系統(tǒng)，GE healthcare公司；Agilent 1200高效液相色譜系統(tǒng)，美國Agilent公司。

1.4 野生菌和突變株SaMTHase酶活力的測定

底物的配制：SaMTHase測酶活所采用的底物為麥芽四糖基海藻糖，處理方式是用磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液(20 mmol/L pH 6.0)配制質(zhì)量濃度為10 g/L的麥芽六糖溶液[2]。向溶液中加入濃縮的SaMTSase酶液(50 μL/mL)，在60 ℃反應(yīng)2～2.5 h。隨后在沸水浴中處理10 min使SaMTSase變性并終止酶反應(yīng)[7]。將反應(yīng)液在12 000 r/min, 4 ℃下離心5 min，取上清即為底物麥芽四糖基海藻糖溶液。

SaMTHase測酶活方法使用的是DNS顯色法，方法如下：取190 μL的麥芽四糖基海藻糖溶液，在60 ℃恒溫槽中預(yù)熱 5 min，加入10 μL SaMTHase酶液，反應(yīng)時間為10 min，加入NaOH溶液(濃度為3 mol/L)100 μL以終止酶反應(yīng)，取150 μL反應(yīng)液到15 mL的具塞試管，加850 μL無菌水和1 mL DNS溶液混合，沸水浴反應(yīng)7 min。冰水浴3 min，加無菌水至15 mL，在光波波長為540 nm處測吸光值。通過麥芽四糖標(biāo)準(zhǔn)曲線來計算SaMTHase的酶活。SaMTHase的酶活單位定義為每分鐘水解麥芽四糖基海藻糖生成 1 μmol麥芽四糖所需的酶量[6]。

1.5 野生菌和突變體SaMTHase的分離純化及蛋白質(zhì)含量的測定

野生菌和突變體SaMTHase粗酶液獲得后，75 ℃熱處理2 h，40%硫酸銨沉淀，透析，最后得到酶液，使用Mono Q陰離子交換柱進行純化SaMTHase蛋白，洗脫方式采用線性洗脫，洗脫流速為3 mL/min，用1.5 mL的收集管進行收集純化后的樣品。本實驗使用Bradford法[11]測定蛋白含量。

1.6 SaMTHase酶學(xué)性質(zhì)的研究

純化后的SaMTHase用于最適溫度(溫度范圍40～90 ℃)、溫度穩(wěn)定性(在60 ℃下的半衰期)、最適pH(pH 4.0～8.0，間隔0.5，緩沖液為磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液)、pH穩(wěn)定性(pH 4.0～11.0，間隔0.5，pH 4.0～8.0為磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液，pH 8.0～9.0為Tri-HCl緩沖液，pH 9.0～11.0為碳酸鹽緩沖液)、Km值和kcat值的測定和研究，其中Km值的測定采用雙倒數(shù)作圖法獲得。

1.7 雙酶法生成海藻糖轉(zhuǎn)化率的測定

高效液相色譜分析采用氨基柱，檢測條件如下：流動相為80%乙腈；柱溫為35 ℃；流速為0.8 mL/min；示差折光檢測器(RID)[8]。

1.8 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物海藻糖得率的計算

1.9 突變株L202P/L218D/Y323G 3 L罐發(fā)酵

從低溫保存的甘油管內(nèi)用接種環(huán)沾取菌液，在含有卡那霉素的固體培養(yǎng)基上劃線，37 ℃培養(yǎng)9～11 h，挑取單菌落與LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)9～11 h。將培養(yǎng)的菌液吸取50 μL，接種在50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)8 h。將種子發(fā)酵液接入NBS115 3 L發(fā)酵罐中，接種量為10%。發(fā)酵罐的初始發(fā)酵液為0.9 L，卡那霉素添加量為0.1%，設(shè)置發(fā)酵罐罐內(nèi)溶氧為100%，初始轉(zhuǎn)速為200 r/min，pH為7.0。在接種后，發(fā)酵罐內(nèi)的溶氧與轉(zhuǎn)速偶聯(lián)，維持溶氧約30%，接種5～7 h內(nèi)發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源逐漸消耗，出現(xiàn)溶氧反彈，以比生長速率為0.2 h-1指數(shù)流加進行補料，前期隔3 h取樣，后期隔2 h取樣。在OD600為50時用乳糖進行誘導(dǎo)產(chǎn)酶，培養(yǎng)溫度從37 ℃改為30 ℃，乳糖流速為0.2 g/(L·h)發(fā)酵過程通過25%氨水維持pH為7.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生菌和突變株SaMTHase的蛋白純化

粗酶液經(jīng)過熱處理后，8 000 r/min離心15 min，獲得上清液。向上清液中添加40%的硫酸銨使目的蛋白沉淀，8 000 r/min離心15 min，獲取蛋白沉淀。用Tris-HCl緩沖液(20 mmol/L，pH 8.0)進行蛋白沉淀的復(fù)溶和透析，獲得蛋白樣品。使用Mono Q陰離子交換柱對SaMTHase進行純化，最后獲得純化樣品。對樣品進行SDS-PAGE蛋白電泳，電泳圖如圖所示，達到電泳純。對每一步獲得的樣品進行蛋白含量和酶活的測定，結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明野生重組MTHase的比活力為272.3 U/mg，突變SaMTHase的比活力為256.1 U/mg，突變后的酶比活力降低5.9%，可認(rèn)為氨基酸的突變對該酶的比活力影響輕微。

M-Marker；1-純化的野生菌SaMTHase;2-純化的突變體SaMTHase，目的條帶大小約為64 kDa圖1 野生菌和突變株SaMTHase的SDS-PAGE蛋白電泳圖Fig.1 SDS-PAGE analysis of wild-type and the mutant strain(L202P/L218D/Y323G) SaMTHase produced in E.coli

表1 野生菌和突變株SaMTHase的純化結(jié)果Table 1 The protein purified results of wild-type and the mutant strain(L202P/L218D/Y323G) SaMTHase produced in E.coli

2.2 野生菌和突變株酶最適溫度及酶的半衰期

野生菌和突變株SaMTHase的最適反應(yīng)溫度見圖2，60 ℃下的半衰期見圖3。從圖3可見，野生菌SaMTHase的最適反應(yīng)溫度和突變株SaMTHase的最適溫度均為 75 ℃，突變株SaMTHase的最適反應(yīng)溫度沒有發(fā)生變化。野生菌SaMTHase在60 ℃下的半衰期為15 d左右，突變株SaMTHase在60 ℃下的半衰期為17 d左右，突變株SaMTHase在60 ℃下的半衰期比野生菌SaMTHase較長。

圖2 野生菌和突變株SaMTHase的最適反應(yīng)溫度Fig.2 The The optimum temperature of wild-type and the mutant strain(L202P/L218D/Y323G) SaMTHase produced in E.coli

圖3 野生菌和突變株SaMTHase在60 ℃下的半衰期Fig.3 The half-time of wild-type and the mutant strain(L202P/L218D/Y323G) SaMTHase at 60 ℃

2.3 野生菌和突變株酶的最適pH值及pH值穩(wěn)定性

野生菌和突變株SaMTHase的最適pH值和pH值穩(wěn)定性測定結(jié)果如圖4和圖5。從圖中可以得知，野生菌和突變株SaMTHase的最適pH值均為5.5～6.0，最適pH值沒有發(fā)生較大改變。野生菌SaMTHase的穩(wěn)定性表明，在pH 5.0～9.0之間酶活可以達到90%以上。而突變株SaMTHase的穩(wěn)定性在pH 5.5～8.5之間酶活可以達到90%以上。從總體趨勢方面認(rèn)為突變株SaMTHase的穩(wěn)定性比野生菌稍差。

圖4 野生菌和突變株SaMTHase的最適pH值Fig.4 The optimum pH of wild-type and the mutant strain(L202P/L218D/Y323G) SaMTHase produced in E.coli

圖5 野生菌和突變株SaMTHase的pH值穩(wěn)定性Fig.5 The pH stability of wild-type and the mutant strain(L202P/L218D/Y323G) SaMTHase produced in E.coli

2.4 野生菌和突變株酶的酶動力學(xué)分析

野生菌和突變株SaMTHase的酶學(xué)動力學(xué)參數(shù)結(jié)果如表2所示。結(jié)果顯示，野生菌和突變株SaMTHase的Km值分別為3.89 mmol/L和3.94 mmol/L，突變SaMTHase對底物的親和力降低。野生菌SaMTHase的kcat值為2.1×104min-1，突變SaMTHase的kcat值為2.0×104min-1，突變SaMTHase的催化效率沒有發(fā)生較大改變。

表2 野生菌和突變株SaMTHase的酶學(xué)動力學(xué)參數(shù)Table 2 The kinetic parameters of wild-type and the mutant strain(L202P/L218D/Y323G) SaMTHase produced in E.coli

2.5 雙酶法轉(zhuǎn)化生產(chǎn)海藻糖

以麥芽糊精(DE值 5～7)為底物，添加普魯蘭酶、SaMTSase[8]和SaMTHase共同反應(yīng)生產(chǎn)海藻糖。MTHase和 MTSase在雙酶法生產(chǎn)海藻糖[12]的過程中只能作用于麥芽糊精的α-1,4-糖苷鍵，而普魯蘭酶能夠水解麥芽糊精中的α-1,6-糖苷鍵[13]，切除麥芽糊精的支鏈結(jié)構(gòu)，使得MTHase 和 MTSase更充分地利用底物，提高底物利用率和海藻糖轉(zhuǎn)化率。

海藻糖生產(chǎn)時的反應(yīng)pH值需控制在5.5，溫度控制在60 ℃，反應(yīng)時間為40 h。反應(yīng)結(jié)束后在沸水浴中加熱10 min 終止反應(yīng)，調(diào)整pH值4～5，在37 ℃下添加糖化酶(10 U/mL)對反應(yīng)液進行糖化24 h，糖化后的產(chǎn)物用乙腈(以1∶1比例)共沉淀，12 000 r/min離心10 min，取上清，用高效液相色譜儀進行分析。在15%的麥芽糊精(DE值 5～7)中，普魯蘭酶的添加量為5 U/g。在SaMTHase的添加量為20 U/g的條件下，SaMTSase和SaMTHase的加量分別以1∶1、2∶1、3∶1、4∶1和5∶1的不同比例進行添加，海藻糖的轉(zhuǎn)化率分別為64.6%、69.2%、73.9%、76.0%和74.7%。從結(jié)果可以看出，在SaMTSase的加量為80 U/g，SaMTHase的加量為20 U/g，即以SaMTSase和SaMTHase的加量以4∶1的比例進行添加時海藻糖的轉(zhuǎn)化率達到最高，最高為76.0%。和野生型SaMTHase相比較，突變株SaMTHase轉(zhuǎn)化海藻糖沒有發(fā)生較大變化。從上述結(jié)果可知：SaMTSase過多導(dǎo)致底物過多的轉(zhuǎn)化為麥芽寡糖基海藻糖，而SaMTHase不能快速的將麥芽寡糖基海藻糖水解產(chǎn)生海藻糖和低分子量的麥芽寡糖[14]。SaMTHase會對產(chǎn)物麥芽寡糖進行水解其中的α-1,4-糖苷鍵生成葡萄糖和低分子量的麥芽寡糖，降低海藻糖的轉(zhuǎn)化率。相反，SaMTHase過多同樣會導(dǎo)致麥芽糊精與該酶作用產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物葡萄糖和麥芽糖，降低底物的利用率，同時提高分離海藻糖的生產(chǎn)成本。

2.6 突變株3 L罐發(fā)酵培養(yǎng)

突變株在搖瓶培養(yǎng)的基礎(chǔ)上進行3 L罐的發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵條件為：在OD600為50時進行誘導(dǎo)，乳糖流加速率為0.2 g/(L·h)，菌體前期培養(yǎng)溫度為37 ℃，誘導(dǎo)溫度為30 ℃。從圖6可以看出OD600和酶活在34 h達到最高，分別為192和338.1 U/mL。前期研究表明突變株搖瓶發(fā)酵的酶活達到59.4 U/mL，3 L罐發(fā)酵所產(chǎn)的酶活比搖瓶發(fā)酵提高5.7倍。

圖6 突變株3 L罐發(fā)酵培養(yǎng)Fig.6 Mutant strain fermentated in 3 L fermentation tank

3 結(jié)論

本實驗主要對1株蛋白表達量提高約2倍的SaMTHase突變株L202P/L218D/Y323G進行酶學(xué)性質(zhì)和海藻糖轉(zhuǎn)化率的相關(guān)研究。實驗結(jié)果表明，該突變株SaMTHase的最適溫度、最適pH、pH穩(wěn)定性和在60 ℃下的半衰期均無較大變化。酶動力學(xué)分析表明，突變后的SaMTHase的動力學(xué)參數(shù)無明顯變化。SaMTSase和SaMTHase以不同添加比例作用于底物麥芽糊精(DE值 5～7)影響海藻糖的轉(zhuǎn)化率。在添加普魯蘭酶的情況下，SaMTSase和SaMTHase以4∶1的比例(SaMTSase為80 U/g，SaMTHase為20 U/g)下海藻糖的轉(zhuǎn)化率達到76.0%，后續(xù)實驗可以從不同來源的淀粉作為底物和提高SaMTSase或從SaMTHase的底物專一性等方面優(yōu)化雙酶法海藻糖生產(chǎn)工藝。