余龍，陳寅，周麗，周哲敏

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫，214122)

L-天冬氨酸(L-aspartic acid)是構(gòu)成蛋白質(zhì)的20種基礎(chǔ)氨基酸之一，其在食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域都有著廣泛的應(yīng)用。在食品領(lǐng)域，L-天冬氨酸是多種食品和飲料的營(yíng)養(yǎng)增補(bǔ)劑和酸味調(diào)節(jié)劑，還用于合成新型甜味劑阿斯巴甜[1]。在醫(yī)藥領(lǐng)域，L-天冬氨酸可用作氨解毒劑、肝功能促進(jìn)劑和疲勞恢復(fù)劑等[2]，且其還是L-丙氨酸的主要合成原料[3]和多種醫(yī)藥中間體?；ゎI(lǐng)域，L-天冬氨酸是合成高分子材料聚天冬氨酸的前體[4]。

L-天冬氨酸的生產(chǎn)始于20世紀(jì)60年代的日本田邊制藥公司[5]，我國(guó)于80年代開(kāi)始研制和生產(chǎn)。目前，工業(yè)生產(chǎn)L-天冬氨酸的工藝是以馬來(lái)酸酐為原料，在無(wú)機(jī)催化劑、強(qiáng)酸性(pH=1左右)條件下轉(zhuǎn)化成富馬酸[6]；分離純化獲得的富馬酸與過(guò)量的氨在L-天冬氨酸裂解酶(L-aspartic acid amino lyase, AspA)催化下轉(zhuǎn)化生成L-天冬氨酸銨[7]，反應(yīng)液用硫酸中和過(guò)量的氨后，分離純化得到產(chǎn)品L-天冬氨酸[8]。此工藝雖然流程簡(jiǎn)單，但是其缺點(diǎn)明顯：需要在高溫、高壓、過(guò)渡金屬催化劑及強(qiáng)酸性條件下進(jìn)行，對(duì)設(shè)備的要求嚴(yán)格，造成的環(huán)境污染嚴(yán)重，同時(shí)需要分離純化中間產(chǎn)物富馬酸，會(huì)造成產(chǎn)率的下降等。相比較而言，生物酶催化轉(zhuǎn)化法具有專一性強(qiáng)，轉(zhuǎn)化率高、工藝簡(jiǎn)潔、設(shè)備投資少及環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn)，因此生物酶催化轉(zhuǎn)化法具有更好的應(yīng)用前景。

近年來(lái)，有關(guān)生物酶催化轉(zhuǎn)化的研究也越來(lái)越多，但大多都是以富馬酸為底物酶法催化合成L-天冬氨酸[9-11]，以馬來(lái)酸為底物的研究較少。而馬來(lái)酸相對(duì)于富馬酸，價(jià)格更便宜，資源更豐富，也更容易獲得，因此，以馬來(lái)酸為底物生產(chǎn)L-天冬氨酸的研究勢(shì)在必行。ABDULLAH等在2004年提出了兩步生物法催化馬來(lái)酸生產(chǎn)L-天冬氨酸[12]，首先用馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶(maleatecis-transisomerase, MaiA)催化馬來(lái)酸生成富馬酸，然后用天冬氨酸裂解酶催化富馬酸加氨生成L-天冬氨酸銨，再用濃硫酸中和過(guò)量的氨，獲得L-天冬氨酸，該方法在一定程度上實(shí)現(xiàn)了節(jié)能減排，但是，需要對(duì)兩種菌同時(shí)進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，然后混合催化，操作較繁瑣，生產(chǎn)成本較高；劉祥濤等在2017年提出了“一鍋雙酶”法制備L-天冬氨酸[13]，首先在1株菌里共表達(dá)馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶和L-天冬氨酸裂解酶，然后全細(xì)胞催化馬來(lái)酸加氨合成L-天冬氨酸銨，再用濃硫酸中和過(guò)量的氨，獲得L-天冬氨酸，該方法極大簡(jiǎn)化了L-天冬氨酸生產(chǎn)工藝，但是，雙酶共表達(dá)的極不平衡和目前報(bào)道的馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶[14-17]要么穩(wěn)定性差，要么酶活低，要么表達(dá)量低等缺點(diǎn)，極大地限制了該方法在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。

本研究建立1株馬來(lái)酸順?lè)串悩?gòu)酶(maleatecis-transisomerase, MaiA)和L-天冬氨酸裂解酶(L-aspartic acid amino lyase, AspA)雙酶偶聯(lián)表達(dá)的重組大腸桿菌。此大腸桿菌已敲除染色體上的fumA和fumC兩個(gè)基因[18]，以減少副產(chǎn)物蘋果酸的生成，提高L-天冬氨酸的得率。然后以全細(xì)胞去催化馬來(lái)酸加氨生成L-天冬氨酸，此方法不用酶的分離純化和中間產(chǎn)物富馬酸的分離提純，極大簡(jiǎn)化了L-天冬氨酸的生產(chǎn)工藝，而且酶在細(xì)胞內(nèi)更加穩(wěn)定。最后利用固定化細(xì)胞催化馬來(lái)酸合成L-天冬氨酸，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的回收重復(fù)利用，極大地降低了成本。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒與引物

菌株E.coliBL21 (DE3) ΔfumAC[18]、E.coliJM109、重組質(zhì)粒pET-24a (+) -maiA[19]和pET-28a (+)-aspA[20]由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保藏。質(zhì)粒pRSFDuet-1、pETDuet-1、pET-28a(+)由本實(shí)驗(yàn)室保藏。本研究用到的引物見(jiàn)表1，引物都由上海睿迪生物合成。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

注：表中帶下劃線的為酶切位點(diǎn)。

1.2 主要試劑與培養(yǎng)基

Prime Star DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、QuickCutBamHI、QuickCutHindIII、QuickCutNdeI、QuickCutXhoI、DNA Marker、Protein Marker (Broad)：寶生物工程(大連)公司；質(zhì)粒提取試劑盒、純化試劑盒、抗生素、IPTG、馬來(lái)酸、富馬酸、L-天冬氨酸：生工生物工程(上海)股份有限公司；衍生試劑苯異硫氰酸酯(PITC)：西格瑪公司。其他的分析試劑為國(guó)藥試劑。

LB培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10。

2YT培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨16，酵母粉10，NaCl 5。

1.3 主要儀器

PCR儀、凝膠成像儀、蛋白電泳儀，BIO-RAD公司；UV-1800PC型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)有限公司；pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；高效液相色譜儀，日立(HITACHI)公司；Prevail Organic Acid 色譜柱 (250×4.6 mm, 5 μm)、C18色譜柱La Chrom C18(250×4.6 mm, 5 μm)。

1.4 MaiA與AspA雙酶偶聯(lián)表達(dá)體系構(gòu)建

采用單質(zhì)粒單啟動(dòng)子、單質(zhì)粒雙啟動(dòng)子和雙質(zhì)粒3種方式實(shí)現(xiàn)MaiA與AspA的共表達(dá)，每種方法又分為MaiA-AspA和AspA-MaiA兩種串聯(lián)順序，如圖1所示。共產(chǎn)生pET-28a (+)-maiA-aspA、pET-28a (+)-aspA-maiA、pRSFDuet-1-maiA-aspA、pRSFDuet-1-aspA-maiA、pRSFDuet-1-maiA-pETDuet-1-aspA、pRSFDuet-1-aspA-pETDuet-1-maiA六種形式，依次記為pMA 1、pAM 1、pMA 2、pAM 2、pMA 3、pAM 3。

圖1 MaiA與AspA共表達(dá)策略Fig.1 The strategy of co-expression of MaiA and AspA

1.5 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以pET-24a (+)-maiA為模板，分別以表1中的引物P1+P2、P3+P4和P5+P4為引物PCR，以pET-28a (+)-aspA為模板，分別以表1中的引物P6+P7、P8+P9和P10+P9為引物PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)對(duì)應(yīng)的酶雙酶切并切膠回收，獲得帶不同黏性末端的maiA和aspA基因片段，分別記為M1、M2、M3和A1、A2、A3。

將質(zhì)粒pRSFDuet-1、pETDuet-1、pET-28a(+)經(jīng)BamHI-HindIII雙酶切并切膠回收，獲得帶BamHI-HindIII黏性末端的不同質(zhì)粒載體片段，分別記為p1、p2、p3。用核酸定量?jī)x測(cè)定回收的片段的濃度，然后以基因片段(M1、A1)比載體片段(p1、p2、p3)為3∶1的濃度比例混合，T4連接酶16℃過(guò)夜連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coliJM109感受態(tài)細(xì)胞里，挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證、酶切驗(yàn)證和DNA測(cè)序驗(yàn)證，獲得正確的重組質(zhì)粒pRSFDuet-1-maiA、pRSFDuet-1-aspA、pETDuet-1-maiA、pETDuet-1-aspA、pET-28a(+)-maiA和pET-28a(+)-aspA。

然后再將重組質(zhì)粒pRSFDuet-1-maiA和pRSFDuet-1-aspA經(jīng)NdeI-XhoI雙酶切并切膠回收，分別獲得帶NdeI-XhoI黏性末端的不同質(zhì)粒載體片段，記為pM1和pA1；pET-28a(+)-maiA和pET-28a(+)-aspA經(jīng)HindIII-XhoI雙酶切并切膠回收，分別獲得帶HindIII-XhoI粘性末端的不同質(zhì)粒載體片段，記為pM2和pA2；然后按上面的連接、轉(zhuǎn)化和驗(yàn)證方法，獲得正確的重組質(zhì)粒pRSFDuet-1-aspA-maiA、pRSFDuet-1-maiA-aspA、pET-28a (+) -aspA-maiA和pET-28a (+)-maiA-aspA。

然后將正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到E.coliBL21 (DE3) ΔfumAC感受態(tài)細(xì)胞中，得到重組工程菌pMA 1、pAM 1、pMA 2、pAM 2、pMA 3、pAM 3。

1.6 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)及最優(yōu)菌株篩選

-80 ℃冰箱保存的重組菌株在LB固體平板上劃線活化，挑取單菌落接種至5 mL的LB 培養(yǎng)基中，pMA 1、pAM 1、pMA 2、pAM 2的LB培養(yǎng)基中含50 μg/mL卡那霉素，pMA 3、pAM 3的LB培養(yǎng)基中含50 μg/mL卡那霉素和50 μg/mL氨芐霉素，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)8 h，然后以1%的接種量轉(zhuǎn)接入50 mL的2YT搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，抗性同上，于37 ℃、200 r/min培養(yǎng)至OD600約為0.8時(shí)，加入終濃度為0.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，同時(shí)溫度調(diào)到20 ℃誘導(dǎo)培養(yǎng)20 h。

各取相同量的誘導(dǎo)表達(dá)細(xì)胞，離心收集菌體，再用pH 8.0的50 mmol/L的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液重懸細(xì)胞，超聲破碎得到粗酶液。SDS-PAGE電泳分析目的蛋白的表達(dá)情況；然后各取100 μL粗酶液，加入到50 μL 2 mol/L的pH 8.0的馬來(lái)酸銨溶液中，用緩沖液補(bǔ)充體系到500 μL，在40 ℃反應(yīng)10 min，然后再于100 ℃煮沸10 min，離心取上清，檢測(cè)上清中馬來(lái)酸、富馬酸和L-天冬氨酸的含量。

1.7 馬來(lái)酸、富馬酸和L-天冬氨酸的檢測(cè)

馬來(lái)酸、富馬酸和L-天冬氨酸的濃度都用高效液相色譜(HPLC)法檢測(cè)。

馬來(lái)酸、富馬酸的HPLC 檢測(cè)條件[19]：色譜柱 Prevail Organic Acid(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，流動(dòng)相為pH 2.5、濃度25 mmol/L的KH2PO4溶液，流速1 mL/min，柱溫40 ℃，紫外檢測(cè)器波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量10 μL。

L-天冬氨酸的檢測(cè)要先經(jīng)過(guò)苯基異硫酸酯(PITC)進(jìn)行衍生，在其氨基端連接1個(gè)苯環(huán)，便于分離。衍生方法為[21]：取500 μL反應(yīng)液，加入250 μL 1 mol/L的三乙胺-乙腈溶液和250 μL 0.1 mol/L的PITC-乙腈溶液，振蕩混勻，避光反應(yīng)1 h。待衍生結(jié)束后，700 μL正己烷，振蕩30 s萃取出殘余的衍生試劑，靜置，待反應(yīng)液有明顯分層后吸取下層溶液，用0.22 μm針頭式有機(jī)濾膜過(guò)濾。HPLC 檢測(cè)條件[21]：色譜柱La Chrom C18(4.6mm×250 mm, 5 μm)，用梯度洗脫的方法進(jìn)行檢測(cè)。A流動(dòng)相為80%的乙腈溶液，B流動(dòng)相為97:3的0.1 mol/L乙酸鈉-乙腈溶液；梯度洗脫條件為：0～35 min，B流動(dòng)相由95%降至65%；35～40 min，B流動(dòng)相由65%升至95%；40～45 min，B流動(dòng)相濃度不變。檢測(cè)溫度為40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。

1.8 全細(xì)胞催化及細(xì)胞的重復(fù)利用

收集誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞，用pH 8.0的50 mmol/L的Na2HPO4-KH2PO4緩沖液重懸細(xì)胞，稀釋到OD600值到40，然后按20%的靜息細(xì)胞懸浮液和80%的底物馬來(lái)酸溶液混合，反應(yīng)體系為30 mL，在200 r/min、37 ℃的搖床中催化反應(yīng)，每隔20 min取樣檢測(cè)反應(yīng)液中馬來(lái)酸、富馬酸和天冬氨酸的量。待底物完全轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物后，離心收集細(xì)胞，然后加6 mL的緩沖液重懸，再加入24 mL底物繼續(xù)按之前的條件全細(xì)胞催化。

1.9 細(xì)胞固定化

細(xì)胞固定化方法[22]：離心收集菌體，將1 g的濕細(xì)胞重懸于5 mL的生理鹽水，然后加入0.1 g的活性炭粉末[m(活性炭)∶m(濕細(xì)胞)=1∶10]于4 ℃吸附4 h；將上面的菌體懸浮液加入到15 mL的海藻酸鈉和聚乙烯醇的混合溶液中充分混勻，使得海藻酸鈉的終濃度是2%，聚乙烯醇的終濃度為6%；將上面的混合溶液滴到固定化劑(飽和硼酸與3%的氯化鈣混合溶液)中，室溫放置6 h使其硬化；用生理鹽水清洗3次固定好的細(xì)胞顆粒，然后用固定好的細(xì)胞顆粒催化4 mol/L的底物馬來(lái)酸并回收重復(fù)利用，催化等量底物相同時(shí)間，檢測(cè)反應(yīng)液中馬來(lái)酸、富馬酸和L-天冬氨酸銨的量，計(jì)算酶活(酶活定義：在37 ℃、pH 8.0條件下，單位時(shí)間催化轉(zhuǎn)化生成1μmol的L-天冬氨酸所需的酶量定義為1個(gè)酶活單位U)和酶活回收率(酶活回收率=固定化細(xì)胞酶活/游離細(xì)胞第1次反應(yīng)酶活)。

2 結(jié)果與分析

2.1 MaiA與AspA雙酶偶聯(lián)表達(dá)體系構(gòu)建

將重組質(zhì)粒pRSFDuet-1-maiA、pRSFDuet-1-aspA、pETDuet-1-maiA、pETDuet-1-aspA、pET-28a(+)-maiA和pET-28a(+)-aspA經(jīng)BamHI-HindIII雙酶切，然后經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，目的條帶的大小都與理論值大小相符，電泳結(jié)果如圖2-a。

M-DNA marker; 1-double digestion of pRSFDuet-1-maiA; 2-double digestion of pRSFDuet-1-aspA; 3-double digestion of pETDuet-1-maiA; 4-double digestion of pETDuet-1-aspA; 5-double digestion of pET-28a(+)-maiA; 6-double digestion of pET-28a(+)-aspA; 7-double digestion of pRSFDuet-1-aspA-maiA; 8-double digestion of pRSFDuet-1-maiA-aspA; 9-double digestion of pET-28a(+)-maiA-aspA; 10-double di-gestion of pET-28a(+)-aspA-maiA圖2 PCR擴(kuò)增maiA和aspA基因及重組質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證Fig.2 PCR amplification of maiA and aspA gene and restriction of recombinant plasmid

將重組質(zhì)粒pRSFDuet-1-aspA-maiA、pRSFDuet-1-maiA-aspA經(jīng)NdeI-XhoI雙酶切；pET-28a (+)-aspA-maiA和pET-28a (+) -maiA-aspA經(jīng)HindIII-XhoI雙酶切，然后經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，目的條帶的大小都與理論值大小相符，電泳結(jié)果如圖2-b。

2.2 MaiA與AspA雙酶共表達(dá)效果及酶活比較

用SDS-PAGE電泳比較6種重組菌雙酶共表達(dá)的效果，其表達(dá)上清結(jié)果如圖 3。當(dāng)MaiA和AspA分別單獨(dú)表達(dá)時(shí)，其表達(dá)量都比較高，而當(dāng)其串聯(lián)表達(dá)時(shí)，其表達(dá)量都有相應(yīng)的降低，而且不同的串聯(lián)方式，2個(gè)酶的表達(dá)水平相差也較大。期中pMA1和pAM1的串聯(lián)體系的2個(gè)酶的表達(dá)量都較低；pMA2的串聯(lián)體系的MaiA表達(dá)較高，而AspA的表達(dá)較低；pAM 2的串聯(lián)體系的2個(gè)酶幾乎都沒(méi)有表達(dá)；pMA3和pAM3的串聯(lián)體系的AspA的表達(dá)較好，而MaiA的表達(dá)較低。這些不同的串聯(lián)體系的表達(dá)差異，可能與2個(gè)基因轉(zhuǎn)錄的mRNA的穩(wěn)定性有關(guān)[23-24]。

M-protein marker; 1-MaiA expression; 2-AspA expression; 3-pMA 1; 4-pAM 1; 5-pMA 2; 6-pAM 2; 7-pMA 3; 8-pAM 3圖3 MaiA與AspA雙酶共表達(dá)Fig.3 SDS-PAGE of MaiA and AspA co-expression

粗酶液催化反應(yīng)比較6種重組菌的催化效率，結(jié)果如表2。pMA2的串聯(lián)體系的催化生成L-天冬氨酸的效果最佳，這是因?yàn)锳spA的酶活[25]顯著高于MaiA的酶活[19]，故此催化體系的限速因素是MaiA的總酶活，因此當(dāng)MaiA的表達(dá)量越高時(shí)，MaiA的總酶活就越高，催化效果就越好。

綜合6種重組菌的雙酶共表達(dá)效果及其粗酶液的催化效率，重組工程菌pMA2催化生產(chǎn)L-天冬氨酸的效果最好，更適合以后以馬來(lái)酸為底物工業(yè)化生產(chǎn)L-天冬氨酸。因此下面就以重組工程菌pMA2為基礎(chǔ)進(jìn)行全細(xì)胞催化工藝的研究。

表2 重組菌粗酶催化200 mmol/L的馬來(lái)酸比較Table 2 Comparison of crude enzyme catalysis of 200 mmol/L maleic acid

2.3 全細(xì)胞催化及細(xì)胞的回收利用

以pMA2全細(xì)胞催化1.6 mol/L的馬來(lái)酸，結(jié)果如圖4-a。1.6 mol/L的馬來(lái)酸在120 min就完全轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-天冬氨酸銨，濃度達(dá)到1.57 mol/L，中間產(chǎn)物富馬酸幾乎沒(méi)有積累，轉(zhuǎn)化率達(dá)到98%以上。而在實(shí)際的工業(yè)生產(chǎn)中，如果產(chǎn)物濃度越高，下游的分離純化就越容易，因此又對(duì)底物的濃度進(jìn)行了優(yōu)化。分別用2.4 mol/L和3.2 mol/L的底物馬來(lái)酸進(jìn)行全細(xì)胞催化，催化結(jié)果如圖4-b和圖4-c，底物分別在250 min和390 min轉(zhuǎn)化完全，且中間產(chǎn)物幾乎都沒(méi)有積累，轉(zhuǎn)化率都在98%以上。隨著底物濃度的增加，反應(yīng)速率有一定的下降，說(shuō)明高濃度的底物或產(chǎn)物對(duì)反應(yīng)有一定的抑制作用，但是抑制作用并不明顯，轉(zhuǎn)化率也沒(méi)有下降，因此并不影響工業(yè)的應(yīng)用。

a-1.6 mol/L馬來(lái)酸; b-2.4 mol/L馬來(lái)酸; c-3.2 mol/L馬來(lái)酸圖4 不同馬來(lái)酸濃度下全細(xì)胞催化轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L-天冬氨酸Fig.4 The production of L-aspartic acid whole-cell biocatalysis in different concentration of maleic acid

當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到3.2 mol/L時(shí)，反應(yīng)液黏度大大增加，在離心回收細(xì)胞時(shí)，有些細(xì)胞沉淀不下來(lái)，給細(xì)胞的回收利用帶來(lái)一定的困難。回收利用1次，催化相同底物反應(yīng)相同時(shí)間，L-天冬氨酸生成量降低為2.1 mol/L，酶活回收率僅為65.6%，如表3。這在實(shí)際應(yīng)用中造成較大的浪費(fèi)，接下來(lái)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定化研究，以解決細(xì)胞回收利用問(wèn)題。

表3 游離細(xì)胞回收利用Table 3 Recycling of the free cells

2.4 細(xì)胞固定化

對(duì)重組工程菌pMA2進(jìn)行細(xì)胞固定化，固定化細(xì)胞第1次催化反應(yīng)的酶活回收率為90.4%，然后回收重復(fù)利用固定化細(xì)胞，以固定化細(xì)胞第1次催化反應(yīng)的酶活記為100%，計(jì)算每次回收重復(fù)利用的相對(duì)酶活，結(jié)果如圖5。前4次回收利用，其酶活回收率逐漸增加，可能的原因是隨著回收利用次數(shù)的增加，固定化細(xì)胞顆粒的通透性增大，細(xì)胞與底物的接觸更充分，故其酶活回收率逐漸增加；回收利用4次之后，其酶活回收率又逐漸下降，可能原因是隨著回收利用次數(shù)的進(jìn)一步增加，固定化細(xì)胞顆粒逐漸相互黏成一團(tuán)，降低了固定化細(xì)胞顆粒與底物的接觸面積，而且也可能有部分細(xì)胞從固定化載體上脫落，或者是酶有部分失活，故其酶活回收率又逐漸下降。最終重復(fù)利用8次之后，其相對(duì)酶活還剩下81%，顯著提高了細(xì)胞的利用率，降低了生產(chǎn)成本，為今后工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

圖5 固定化細(xì)胞回收利用Fig.5 Recycling of the immobilized cells

3 結(jié)論

本研究構(gòu)建了6種不同的MaiA與AspA雙酶偶聯(lián)表達(dá)體系，通過(guò)比較6株重組菌的共表達(dá)效果和催化效率，獲得最佳的偶聯(lián)體系pRSFDuet-1-maiA-aspA。然后以最佳的重組工程菌pMA2全細(xì)胞催化馬來(lái)酸銨，并做底物的優(yōu)化，最終L-天冬氨酸的濃度達(dá)到3.14 mol/L，中間產(chǎn)物富馬酸幾乎沒(méi)有積累，轉(zhuǎn)化率達(dá)到98%以上。與化學(xué)合成法相比，不僅極大簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝，而且轉(zhuǎn)化率也有一定提高(化學(xué)合成法轉(zhuǎn)化率最高的是FUJII等的86%)；與劉祥濤等的“一鍋雙酶”法[13]相比(其1 L的高密度發(fā)酵液所含重組菌按投料比1∶4，即1 L發(fā)酵液與4 L馬來(lái)酸混合，催化轉(zhuǎn)化1.5 mol/L的底物馬來(lái)酸需要24 h，轉(zhuǎn)化率為98.8%)，本研究的最佳重組菌pMA 2的酶活更高，催化更高效，生成的產(chǎn)物濃度更高，更有利于下游產(chǎn)物的分離純化。最后對(duì)重組工程菌pMA 2進(jìn)行細(xì)胞固定化，回收利用8次之后，其相對(duì)酶活還剩下81%，顯著提高了細(xì)胞的利用率，降低了生產(chǎn)成本，為今后的生物酶催化轉(zhuǎn)化法工業(yè)化生產(chǎn)L-天冬氨酸奠定了基礎(chǔ)。