劉穎，楊華，宋昭，陳雄，黃亞男，王志*

1(湖北工業(yè)大學(xué)，發(fā)酵工程教育部重點實驗室，湖北省工業(yè)發(fā)酵協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北省工業(yè)微生物重點實驗室，武漢，430068) 2(河南省南街村(集團(tuán))有限公司，河南 臨潁，462600)

丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)是低G-C含量的革蘭氏陽性嚴(yán)格厭氧菌，芽孢偏心或次端生、中部膨大呈梭狀、周生鞭毛、具有運動性[1]，廣泛存在于腸道、土壤、白酒釀造窖泥和奶酪中。丁酸梭菌因具有調(diào)節(jié)腸道平衡、增強(qiáng)免疫的功能[2]而受到關(guān)注，如：戚薇采用單因素和正交優(yōu)化，培養(yǎng)32 h的活菌數(shù)達(dá)到 4.1×108CFU/mL[3]；袁華偉等在最適條件下清液培養(yǎng)源于酒窖泥的丁酸梭菌48 h，細(xì)胞數(shù)達(dá)到1.64×108CFU/mL[4]；趙建新等在優(yōu)化條件下培養(yǎng)ClostridiumbutyricumZ-10，發(fā)酵12 h生物量達(dá)到3.6×108CFU/mL[5]，夏會麗等在10 L罐水平(基料體積5 L)批培養(yǎng)丁酸梭菌HBUT-01，細(xì)胞數(shù)達(dá)到9.39 ×108CFU/mL[6]。

丁酸梭菌液體發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生大量丁酸、乙酸等分子使培養(yǎng)基pH迅速降低，并伴隨著支鏈淀粉粒[7]積累，而且淀粉粒隨著芽孢生成程序啟動[8]又被消耗。這使?fàn)I養(yǎng)體細(xì)胞生長周期變短、限制了生物量的進(jìn)一步增加。枯草桿菌的芽孢程序啟動需要Spo0A蛋白的磷酸化[9]，涉及到全局調(diào)控子CodY(幫助細(xì)胞適應(yīng)營養(yǎng)貧乏狀態(tài)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白)。當(dāng)效應(yīng)分子(GTP和/或支鏈氨基酸BCAAs)與其結(jié)合后，會引起CodY構(gòu)型轉(zhuǎn)變，CodY-GTP或CodY-BCAA才能結(jié)合于靶基因的啟動子區(qū)域，起到調(diào)控蛋白的作用[10]，并通過阻遏KinB蛋白的表達(dá)來抑制芽孢的形成[11]。雖然梭狀芽孢桿菌基因組中無spo0F和spo0B基因，不存在磷酸傳遞系統(tǒng)[12]，但有文獻(xiàn)報道：激活狀態(tài)的CodY可能通過調(diào)控芽孢形成相關(guān)基因sinR和opp來抑制Clostridiumdifficile芽孢的形成[13]，使細(xì)胞處于營養(yǎng)生長狀態(tài)。

微生物對營養(yǎng)分子的利用存在一般性規(guī)律，如：枯草芽孢桿菌從對數(shù)生長到營養(yǎng)物質(zhì)匱乏的發(fā)酵后期，其胞內(nèi)GTP和BCAAs水平大幅度下降，分別從2 mmol/L和15 mmol/L下降至0.3 mmol/L和2 mmol/L，過程中CodY的調(diào)控活性逐步下降，從而使阻遏的靶基因脫阻遏而表達(dá)[14]。盡管丁酸梭菌Spo0A的磷酸化過程還沒有闡明、CodY對芽孢調(diào)控的細(xì)節(jié)特征也沒有明確的報道，但是，由于在Clostridiumbutyricum[15]、Clostridiumacetobutylicum[16-17]和Clostridiumbotulinum[18]中確實存在CodY，因此，有必要在丁酸梭菌發(fā)酵葡萄糖生長過程中，通過補(bǔ)加營養(yǎng)分子(如：嘌呤類分子、支鏈氨基酸)來觀察其對細(xì)胞生長和芽孢啟動的影響。

為了延緩丁酸梭菌芽孢的形成，進(jìn)一步提高丁酸梭菌的生物量及生長效率，本文在厭氧瓶水平確定了鳥嘌呤和支鏈氨基酸對丁酸梭菌生長的影響，并在20 L發(fā)酵罐水平研究了其對丁酸梭菌生長、酸代謝和芽孢生成的影響，確定了鳥嘌呤和Ile的促生長功能和對丁酸合成調(diào)控的基本特征，進(jìn)一步提高了丁酸梭菌的生物量，為丁酸梭菌的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

丁酸梭菌HBUT-01(ClostridiumbutyricumHBUT-01)，為本實驗室菌株，保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC M 2016628)。

DELTA 320 pH計，梅特勒托利多儀器(上海)有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；TG18M臺式高速離心機(jī)，長沙平凡儀器儀表有限公司；Nikon ECLIPSE E100生物顯微鏡，上海光學(xué)儀器五廠；Aglient 7890B氣相色譜儀， HNY-211B全溫振蕩培養(yǎng)箱，天津歐諾儀器儀表有限公司；紫外可見分光光度計，島津。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖 10；胰蛋白胨10；牛肉浸膏 10；酵母浸粉3；瓊脂20。

發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖16.1，蛋白胨25，酵母浸粉 7；CaCO34.3；MgSO4·7H2O；0.8；K2HPO40.5; MnSO4·H2O 0.02。

所有培養(yǎng)基均分裝至100 mL厭氧瓶中，裝液量30 mL，加0.6 g/L半胱氨酸，0.5 g/L刃天青(無氧條件(Eh值在-40 mV)下呈無色狀態(tài);有氧條件下為紅色)，pH 7.2，通氮氣除氧5 min，115 ℃滅菌20 min。

1.3 培養(yǎng)方法

種子懸液制備：將-20 ℃保存的丁酸梭菌甘油管接種至厭氧管斜面，37 ℃活化12 h。加3 mL無菌水至種子斜面，制備種子菌懸液。

一級種子液制備：將種子菌懸液以體積分?jǐn)?shù)為2.5%的接種量接至厭氧瓶(種子培養(yǎng)基，裝液量30 mL)中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)12 h。

厭氧瓶發(fā)酵方法：將一級種子液以體積分?jǐn)?shù)為2.5%的接種量接至厭氧瓶(發(fā)酵培養(yǎng)基,裝液量30 mL)中，37 ℃，200 r/min培養(yǎng)12 h，周期取樣。

1.4 實驗設(shè)計

1.4.1 單因素優(yōu)化

配置15 g/L鳥嘌呤溶液，0.22 μm的濾膜過濾除菌。用1 mL無菌注射器向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入不同體積的鳥嘌呤溶液，使鳥嘌呤終質(zhì)量濃度梯度為0～0.4 g/L。發(fā)酵10 h取樣并滾管計數(shù)。

分別配置15 g/L的Ile、Leu和Val溶液，0.22 μm的濾膜過濾除菌。分別向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入1 mL所配溶液(終濃度是0.5 g/L)，發(fā)酵10 h取樣并滾管計數(shù)。

配置15 g/L的Ile溶液，0.22 μm的濾膜過濾除菌。用1 mL無菌注射器向發(fā)酵培養(yǎng)基中加入不同體積的Ile溶液，使其終濃度梯度為0～1.0 g/L。發(fā)酵10 h取樣并滾管計數(shù)。

1.4.2 20 L發(fā)酵罐分批發(fā)酵

一級種子液接種體積分?jǐn)?shù)為2.5%，發(fā)酵基料體積14 L。滅菌結(jié)束后通入氮氣至接種(1 h左右)，轉(zhuǎn)速200 r/min，37 ℃培養(yǎng)12 h左右。

1.5 檢測方法

1.5.1 細(xì)胞數(shù)測定

使用Hungate滾管計數(shù)法進(jìn)行計數(shù)[19]。

1.5.2 葡萄糖測定

采用3,5二硝基水楊酸法測定[20]。

1.5.3 有機(jī)酸測定

揮發(fā)性有機(jī)酸丁酸和乙酸采用氣相色譜測定。采用氣相色譜法測定：安捷倫7890B GC，F(xiàn)ID檢測器，HP-INNOWax毛細(xì)管柱柱長30 m，內(nèi)徑0.53 mm，膜厚1 μm；程序升溫條件：40 ℃保留5 min，后以20 ℃/min升到120 ℃，再以10 ℃/min 升到220 ℃，220 ℃ 保留3 min。流速 5 mL/min，進(jìn)樣口溫度250 ℃，檢測器280 ℃[21]。

1.5.4 細(xì)胞染色

采用孔雀綠芽孢染色法，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.6%的孔雀綠加熱條件下染5 min，沖洗干燥后番紅染液復(fù)染2 min，芽孢染成綠色，細(xì)胞其他部分染成粉紅色。

2 結(jié)果與分析

2.1 厭氧瓶水平發(fā)酵基料添加鳥嘌呤對丁酸梭菌生長的影響

GMP在胞內(nèi)可以通過兩種途徑生成:從頭合成和補(bǔ)救合成。補(bǔ)救合成為磷酸核糖焦磷酸直接與嘌呤堿生成嘌呤核苷酸。因此，添加嘌呤可促進(jìn)胞內(nèi)GTP以及嘌呤核苷酸的代謝。

由圖1可知，添加鳥嘌呤可顯著提高丁酸梭菌的生物量。10 h對照生物量達(dá)到3.77×108CFU/mL。添加0.1～0.4 g/L鳥嘌呤組細(xì)胞數(shù)較對照提高了22.02%～50.92%。其中添加0.2 g/L組的生物量(5.59×108CFU/mL)僅低于0.3g/L和0.4 g/L組1.71%和1.06%。因此選擇0.2 g/L為最適添加質(zhì)量濃度。此外，鳥嘌呤還顯著影響了菌體的形態(tài)，如圖2所示：對照90%左右的菌體已經(jīng)開始形成芽孢，而添加鳥嘌呤明顯減少了芽孢形成的比例，0.2～0.4 g/L的添加量都可以使菌體依然為營養(yǎng)細(xì)胞狀態(tài)，延緩了芽孢形成。

圖1 鳥嘌呤對丁酸梭菌生長的影響Fig.1 The effect of guanine on the growth of Clostridium butyricum

圖2 鳥嘌呤對丁酸梭菌(10 h)細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.2 The effect of gunanine on the cell morphology of Clostridium butyricum at 10 h

2.2 厭氧瓶水平發(fā)酵基料添加0.2 g/L鳥嘌呤對丁酸梭菌生長的影響

厭氧瓶水平添加鳥嘌呤對丁酸梭菌代謝的影響如圖3所示。添加組的生物量水平整體較高，6 h迅速生長至5.05×108CFU/mL，并與8 h開始二次生長，10 h達(dá)到峰值(5.71×108CFU/mL)，比對照8 h的峰值生物量(4.34×108CFU/mL)提高了31.57%。添加組胞外丁酸和乙酸濃度除了在10 h高于對照組外，均分別低于對照3.15%～7.23%和0.92%～24.32%，而且丁酸和乙酸的單位菌體的得率系數(shù)(Yp/x)分別為0.37 mg/108CFU和0.42 mg/108CFU，低于對照120.03%和16.67%。說明在厭氧瓶水平，鳥嘌呤可以提高丁酸梭菌生物量，減少丁酸、乙酸的合成。

圖3 添加0.2g/L鳥嘌呤對丁酸梭菌代謝的影響(空心標(biāo)識為對照組，實心標(biāo)識為添加組)Fig.3 The effect of 0.2 g/L gunanine on metabolism of Clostridium butyricum

2.3 支鏈氨基酸對丁酸梭菌生長的影響

芽孢程序啟動過程Spo0A蛋白的磷酸化[9]涉及到了全局調(diào)控子CodY。GTP和/或BCAAs與之結(jié)合形成CodY-GTP或CodY-BCAA后，使得CodY構(gòu)型轉(zhuǎn)變而激活，才能結(jié)合于靶基因的啟動子區(qū)域[10]，通過阻遏KinB蛋白的表達(dá)來抑制芽孢的形成[11]。Clostridiumdifficile中激活狀態(tài)的CodY可能通過調(diào)控芽孢形成相關(guān)基因sinR和opp的表達(dá)來抑制芽孢的形成[13]，使細(xì)胞處于營養(yǎng)生長狀態(tài)。

由于丁酸梭菌中關(guān)于BCAAs結(jié)合于CodY結(jié)構(gòu)域、進(jìn)而調(diào)控芽孢形成基因表達(dá)的特征沒有明確的報道，因此，需要確認(rèn)支鏈氨基酸的作用。BCAAs對丁酸梭菌生長代謝的影響如圖4所示。

圖4 支鏈氨基酸對丁酸梭菌生長(10 h)的影響Fig.4 The effect of BCAAs on the growth of Clostridium butyricum

發(fā)酵培養(yǎng)10 h，添加0.5 g/L的Leu和Ile組的生物量分別達(dá)到3.6×108CFU/mL和4.32×108CFU/mL，較對照3.5×108CFU/mL分別提高2.8%和20%。同時，支鏈氨基酸對菌體的形態(tài)和芽孢生成產(chǎn)生了顯著的影響，如圖5所示，Val組和對照組一樣在10 h已大量形成芽孢，結(jié)合其生物量僅為對照的75%的數(shù)據(jù)，說明：Val對細(xì)胞的影響與枯草芽孢桿菌完全不同，或者0.5 g/L的Val已經(jīng)對細(xì)胞產(chǎn)生了毒性。另外，Leu組芽孢生成也較為明顯，只有Ile組菌體形態(tài)基本上都維持在梭狀形態(tài)，而且無芽孢生成，因此選擇Ile進(jìn)行下一步研究。

圖5 支鏈氨基酸對丁酸梭菌細(xì)胞形態(tài)(10 h)的影響Fig.5 The effect of BCAAs on the cell morphology of Clostridium butyricum at 10 h

2.4 不同質(zhì)量濃度Ile對丁酸梭菌生長的影響

如圖6 所示，0.25～0.75 g/L的Ile添加量促進(jìn)了細(xì)胞的生長，發(fā)酵10 h的細(xì)胞數(shù)在(3.92～4.25)×108CFU/mL，較對照(3.53×108CFU/mL)增加了10.73%～20.05%，并以0.5 g/L組為峰值。

圖6 不同質(zhì)量濃度異亮氨酸對丁酸梭菌生長(10 h)的影響Fig.6 The effect of different concentrations of Ile on the growth of Clostridium butyricum

2.5 20 L發(fā)酵罐水平鳥嘌呤和Ile對丁酸梭菌生長代謝的影響

20 L發(fā)酵罐水平基料添加鳥嘌呤對丁酸梭菌生長代謝的影響如圖7所示: 對照組(圖7-A)和添加組(圖7-B)的葡萄糖從2 h開始被快速利用，8 h分別剩余3.03 g/L和0.71 g/L。添加組糖耗速率較對照提高了26.23%。對照組胞外丁酸從2 h開始積累，6 h達(dá)到2.14 g/L，并持續(xù)積累至9 h的3.33 g/L。乙酸0～6 h積累至0.69 g/L。添加組的丁酸和乙酸在6 h的質(zhì)量濃度分別為1.28 g/L和0.47 g/L，9 h的乙酸質(zhì)量濃度積累至0.7 g/L，丁酸質(zhì)量濃度在10 h達(dá)到3.2 g/L。

A-對照；B-添加組圖7 20 L發(fā)酵罐基料添加0.2 g/L的鳥嘌呤對丁酸梭菌生長代謝Fig.7 The effect of 0.2 g/L guanine on the growth and metabolism of Clostridium butyricum in 20 L bioreactor

對照組細(xì)胞數(shù)對數(shù)生長至6 h達(dá)到峰值(4.32×108CFU/mL)，后自溶至9 h(3.19×108CFU/mL，減少26.16%)。9 h后開始二次生長至10 h達(dá)到4.21×108CFU/mL。添加組從2 h對數(shù)生長至6 h，達(dá)到峰值生物量5.31×108CFU/mL，較對照6 h提高了22.91%。6 h后細(xì)胞自溶至9 h，減少了66%，9 h后二次生長至10 h的4.23×108CFU/mL。

基料添加0.5 g/L的Ile對丁酸梭菌生長代謝的影響如圖8所示，丁酸梭菌從2 h開始對數(shù)生長至7 h達(dá)到峰值生物量4.65×108CFU/mL，較對照(圖7-A)對數(shù)生長期延長1 h，峰值生物量提高7.64%。7 h后細(xì)胞自溶，10 h生物量僅有2.56×108CFU/mL，比其峰值生物量減少了44.94%。添加Ile使糖耗減慢，7 h葡萄糖質(zhì)量濃度為6.71 g/L。胞外丁酸和乙酸從4 h開始積累，均在9 h基本達(dá)到峰值，分別為2.42 g/L和0.62 g/L，其中，乙酸含量與對照(圖7-A)接近，丁酸較對照組降低了25.38%。

圖8 20 L發(fā)酵罐基料添加0.5 g/L的Ile對丁酸梭菌生長代謝的影響Fig.8 The effect of 0.5 g/L Ile on the growth and metabolism of Clostridium butyricum in 20 L bioreactor

6 h細(xì)胞數(shù)達(dá)到峰值時，得率系數(shù)如表1所示，就細(xì)胞對糖的得率而言，鳥嘌呤和Ile效果接近，均提高了17%以上。而且糖酸轉(zhuǎn)化得率(Yp/s)降低了30%以上，與之相對應(yīng)的，單位菌體的丁酸得率(Yp/x)也下降了40%以上。說明鳥嘌呤和Ile還調(diào)控了丁酸合成途徑的碳通量，酸得率下降可以降低酸脅迫效應(yīng)，降低質(zhì)子外泵的額外能量消耗[22]，從而促進(jìn)了細(xì)胞的生長效率。

表1 峰值生物量(6 h)得率系數(shù)Table 1 The yield coefficient at peak biomass

注：其中Yx/s表示單位葡萄糖細(xì)胞得率；Yp/s為單位葡萄糖丁酸得率；Yp/x為單位菌體丁酸得率，干重(Y)與*108CFU/mL (X)的關(guān)系為Y=1.13X+0.87，R2=0.993 1。

枯草芽孢桿菌中，GTP和Ile作為效應(yīng)分子協(xié)同或單獨與CodY結(jié)合，激活CodY的調(diào)控蛋白作用，而且Ile和GTP的作用效果可以累積[14]。為了確定鳥嘌呤和Ile是否對丁酸梭菌生長代謝具有協(xié)同積累調(diào)控作用，研究了基料同時添加0.2 g/L鳥嘌呤和0.5 g/L的Ile對其生長的影響，如圖9所示。

丁酸梭菌從2 h開始對數(shù)生長至6 h達(dá)到峰值生物量5.4×108CFU/mL，較對照(圖7-A)提高了25%、較單獨添加Ile提高16.13%。說明兩者對丁酸梭菌的生長確實存在類似于枯草芽孢桿菌的協(xié)同促進(jìn)作用。但是，CodY與效應(yīng)分子結(jié)合的結(jié)構(gòu)域與GTP的結(jié)合效率可能更高，因此，當(dāng)鳥嘌呤與Ile同時添加時，生物量較單獨添加鳥嘌呤組無顯著性差異。

圖9 20 L發(fā)酵罐基料添加0.2 g/L鳥嘌呤與0.5 g/L的Ile對丁酸梭菌生長代謝的影響Fig.9 The effect of 0.2 g/L guanine and 0.5 g/L Ile on the growth and metabolism of Clostridium butyricum in 20 L bioreactor

6～9 h細(xì)胞自溶(9 h，2.98×108CFU/mL)，后出現(xiàn)二次生長現(xiàn)象，至10 h增加到3.25×108CFU/mL，但較6 h仍然減少了39.81%。細(xì)胞峰值時乙酸和丁酸的濃度分別為0.44 g/L和1.29 g/L，較對照(圖7-A)降低了36.23%和39.72%。

對比已有文獻(xiàn)[3-6]，本研究中使用的菌種在優(yōu)化條件下發(fā)酵培養(yǎng)具有周期短、效率高、細(xì)胞生長迅速的明顯優(yōu)勢，而有關(guān)培養(yǎng)周期、最大細(xì)胞生物量的差異則與不同的菌株、培養(yǎng)基組成、發(fā)酵工藝參數(shù)的控制、啟動以及發(fā)酵過程厭氧條件的維持差異有關(guān)。

發(fā)酵批培養(yǎng)(圖7～圖9)過程存在細(xì)胞對數(shù)生長至峰值后大幅自溶的現(xiàn)象，這估計也與培養(yǎng)條件(如：厭氧啟動基料體積為14 L)和細(xì)胞氧化脅迫[23]有關(guān)。接種前氮氣置換空氣1 h難以將溶氧完全去除，培養(yǎng)基中的痕量溶氧可能對丁酸梭菌細(xì)胞生長(特別是啟動階段的細(xì)胞)產(chǎn)生了氧化脅迫效應(yīng)，如：丁酸梭菌的碳代謝關(guān)鍵酶-丙酮酸:鐵氧還蛋白氧化還原酶對溶氧很敏感，與氧接觸1 h，其酶活性降低50%[24]。本文對照批培養(yǎng)在10 L罐水平(基料體積5 L)條件下的發(fā)酵效率[6]就高于本文對照(圖7-A)，這估計也與前者基料體積小、厭氧發(fā)酵啟動條件較好有關(guān)。

另外，若在培養(yǎng)過程中(如：對數(shù)生長期)外源補(bǔ)加鳥嘌呤和Ile，也涉及到了補(bǔ)料液的厭氧狀態(tài)以及補(bǔ)料過程對發(fā)酵體系厭氧狀態(tài)的擾動問題。特別是在丁酸梭菌工業(yè)發(fā)酵的放大過程中，厭氧條件的維持問題會格外突出，因此，下一步將針對氧化脅迫效應(yīng)、以延長細(xì)胞對數(shù)生長周期為目標(biāo)展開系統(tǒng)的研究，包括：補(bǔ)料因子(碳源、氮源、調(diào)控因子如鳥嘌呤和Ile)最適補(bǔ)加時間、發(fā)酵過程氧化還原電位的優(yōu)化等，為工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

3 結(jié)論

厭氧瓶水平基料添加鳥嘌呤(0.2 g/L)和Ile(0.5 g/L)能分別提高丁酸梭菌的生物量31.57%和20%，而基料添加Val(0.5 g/L)則促進(jìn)了芽孢生成、抑制細(xì)胞生長。20 L發(fā)酵罐水平基料添加鳥嘌呤(0.2 g/L)和Ile(0.5 g/L)使丁酸梭菌峰值生物量分別達(dá)到5.31×108CFU/mL和4.65×108CFU/mL，較對照分別提高了22.91%和7.64%，同時丁酸的菌體得率系數(shù)(Yp/x)較對照分別降低了48.64%和40.54%；當(dāng)基料同時添加鳥嘌呤和Ile時，丁酸梭菌峰值生物量達(dá)到了5.4×108CFU/mL，較對照、單獨添加Ile分別提高了25%和16.13%，確定了鳥嘌呤和Ile的促生長功能，為丁酸梭菌的工業(yè)化生產(chǎn)提供了參考。