劉玥昕，吳 驍，關(guān) 蓉，杭太俊，宋 敏

(中國藥科大學(xué)藥物分析系，南京 210009)

牛黃解毒片作為清熱解毒的傳統(tǒng)復(fù)方，歷經(jīng)800多年的發(fā)展，形成目前《中華人民共和國藥典》收載的由人工牛黃、雄黃、石膏、大黃、黃芩、桔梗、冰片、甘草等八味中藥以一定工藝炮制而成的中藥復(fù)方制劑[1-3]。臨床上主要用于治療火熱內(nèi)盛、咽喉腫痛、牙齦腫痛、口舌生瘡及目赤腫痛[1]。大黃作為其處方的主要成分之一，具有顯著的瀉下作用。近年來，隨著研究的不斷深入，其保肝利膽[4]、抗凝抗炎[4-5]的作用也逐漸得到證實(shí)。大黃的主要活性成分包括大黃酸、大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素及大黃素甲醚5種蒽醌類成分[6-7]。

目前，對(duì)于大黃活性成分的體內(nèi)過程研究主要針對(duì)單味藥材大黃[8-9]，但對(duì)牛黃解毒片中大黃的藥代動(dòng)力學(xué)未見報(bào)道。本研究采用LC-MS/MS測定牛黃解毒片中大黃主要成分在大鼠血漿中的經(jīng)時(shí)過程，分析藥代動(dòng)力學(xué)特征，并與給藥單味大黃進(jìn)行比較，從藥代動(dòng)力學(xué)角度揭示方劑配伍的特性。

1 材 料

1.1 儀 器

TSQ Quantum UltraAM型MS/MS聯(lián)用儀(美國Thermo Finnigan公司)；XW-80C型旋渦混合器(上海青浦滬西儀器廠)；Explorer超純水機(jī)(上海沉黃科學(xué)儀器有限公司)；BS110S型萬分之一天平(德國Sartorius公司)；TGL-16臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀儀器有限公司)；高速多功能粉碎機(jī)(永康市天祺盛世工貿(mào)有限公司)。

1.2 藥品與試劑

牛黃解毒片(北京同仁堂科技發(fā)展股份有限公司制藥廠)；大黃(安徽井泉中藥股份有限公司)；大黃酸對(duì)照品、大黃素對(duì)照品(含量98.8%)、大黃酚對(duì)照品(含量99.7%)、蘆薈大黃素對(duì)照品(含量98.3%)、大黃素甲醚對(duì)照品(含量99.8%)、1,8-二羥蒽醌對(duì)照品(含量99.4%)(成都德斯特生物技術(shù)有限公司)；L-抗壞血酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，含量99.7%)；甲醇(美國Tedia公司，色譜純)；其余試劑均為市售分析純。超純水(自制，18.25 MΩ·cm)。

1.3 動(dòng) 物

SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半，體重(200±20)g，上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2013-0006。動(dòng)物飼養(yǎng)于中國藥科大學(xué)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，飼養(yǎng)溫度為(23±3)℃，濕度為40%～70%，12 h照明。實(shí)驗(yàn)前禁食過夜12 h，自由飲水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物飼料和使用指導(dǎo)原則，并通過中國藥科大學(xué)倫理委員會(huì)的同意。

2 方 法

2.1 牛黃解毒片與大黃灌胃溶液的制備

取生藥大黃及牛黃解毒片適量，粉碎成細(xì)粉，精密稱定，用0.5% CMC-Na分別配制成質(zhì)量濃度為20 mg/mL(含總蒽醌19.03 g/kg，相當(dāng)于大黃酸2.88 g/kg、大黃素3.15 g/kg、大黃酚8.48 g/kg、蘆薈大黃素2.41 g/kg及大黃素甲醚2.11 g/kg)及54 mg/mL(含總蒽醌7.27 g/kg，相當(dāng)于大黃酸1.31 g/kg、大黃素1.50 g/kg、大黃酚2.82 g/kg、蘆薈大黃素0.96 g/kg及大黃素甲醚0.68 g/kg)的混懸液，于給藥前充分混勻。

2.2 對(duì)照品溶液及內(nèi)標(biāo)溶液的配制

精密稱定大黃酸、大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素及大黃素甲醚對(duì)照品適量，加入適量二甲亞砜溶解后，用甲醇稀釋并配制成大黃酸2～600 ng/mL，大黃素0.5～20 ng/mL，大黃酚10～400 ng/mL，蘆薈大黃素10～400 ng/mL及大黃素甲醚10～400 ng/mL范圍的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

精密稱定1,8-二羥蒽醌適量，加入適量二甲亞砜溶解后，用甲醇稀釋并配制成1 μg/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。

2.3 色譜及質(zhì)譜條件

采用Inertsil ODS-3 C8(4.6 mm×150 mm，5 μm)色譜柱，以0.1%甲酸銨水溶液(A)-0.1%甲酸銨甲醇溶液(B)為流動(dòng)相，線性梯度洗脫[0 min，A-B(50∶50)→1.0 min，A-B(50∶50)→1.5 min，A-B(10∶90)→9 min，A-B(10∶90)→9.1 min，A-B(50∶50)→10 min，A-B(50∶50)]，流速1.0 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣器溫度15 ℃，進(jìn)樣量30 μL。

電噴霧負(fù)離子化，噴霧電壓-3 000 V，毛細(xì)管溫度350 ℃，鞘氣(N2)壓力40 kPa，輔助氣(N2)壓力10 kPa，碰撞氣(Ar)1.20 Pa，多反應(yīng)監(jiān)測：大黃酸m/z283.0→m/z239.0，碰撞能-17 eV；大黃素m/z269.0→m/z225.0，碰撞能-25 eV；大黃酚m/z253.1→m/z225.0，碰撞能-27 eV；蘆薈大黃素m/z269.2→m/z240.0，碰撞能-22 eV；大黃素甲醚m/z283.2→m/z240.0，碰撞能-26 eV；內(nèi)標(biāo)1,8-二羥蒽醌m/z239.0→m/z211.0，碰撞能-26 eV。

2.4 血漿樣品前處理

精密量取血漿樣品0.2 mL于2 mL聚塑離心管中，精密加入20% L-抗壞血酸溶液40 μL，甲醇(標(biāo)準(zhǔn)曲線和質(zhì)控樣品中加入對(duì)應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液)50 μL及內(nèi)標(biāo)溶液50 μL，渦旋混勻30 s，加入甲醇0.6 mL，渦旋混勻3 min后，12 000 r/min離心10 min，取上清液37 ℃下氮?dú)獯蹈桑瑲堅(jiān)尤氤跏急壤鲃?dòng)相120 μL，渦旋混勻3 min后，12 000 r/min離心10 min，取上清液30 μL進(jìn)行LC-MS/MS分析。

2.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

SPF級(jí)SD大鼠40只，隨機(jī)分為4組，每組10只，大鼠分別灌胃給予大黃96 mg/kg(含總蒽醌1.83 mg/kg，相當(dāng)于大黃酸0.28 mg/kg、大黃素0.30 mg/kg、大黃酚0.81 mg/kg、蘆薈大黃素0.23 mg/kg及大黃素甲醚0.20 mg/kg)或牛黃解毒片250 mg/kg(按人用臨床等效日劑量換算，含總蒽醌與大黃生藥材等量，相當(dāng)于大黃酸0.33 mg/kg、大黃素0.38 mg/kg、大黃酚0.71 mg/kg、蘆薈大黃素0.24 mg/kg及大黃素甲醚0.17 mg/kg)，第1組及第2組灌胃大黃，另兩組灌胃牛黃解毒片，于給藥前0 h及給藥后3，5，10，20，30，40，50 min，1，2，3，4，8，12 h采集血漿樣本。由于大鼠血容量有限，第1組及第3組于0，5，20，40 min，1，3，8 h；第2組及第4組于3，10，30，50 min，2，4，12 h大鼠眼內(nèi)眥靜脈叢取血0.4 mL至肝素化離心管中，4 000 r/min離心，分取血漿置-20 ℃冰箱中保存待測。

3 結(jié) 果

3.1 專屬性

大鼠空白血漿、空白血漿添加一定濃度的大黃酸、大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚及內(nèi)標(biāo)1,8-二羥蒽醌溶液及大鼠給藥1 h后血漿樣品的典型色譜圖如圖1所示。大黃酸、大黃酚異構(gòu)體、蘆薈大黃素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚及內(nèi)標(biāo)1,8-二羥蒽醌的保留時(shí)間分別約為3.9，4.0，4.3，5.1，5.8，6.6及5.2 min，血漿內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)測定無干擾。

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限

精密量取空白血漿0.2 mL，加入20% L-抗壞血酸溶液40 μL，分別精密加入系列大黃混合對(duì)照品溶液50 μL，配制成大黃酸2～600 ng/mL，大黃素0.5～20 ng/mL，大黃酚10～400 ng/mL，蘆薈大黃素10～400 ng/mL及大黃素甲醚10～400 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)血漿樣本，自“精密加入內(nèi)標(biāo)溶液50 μL”起，照“2.4”項(xiàng)下同法操作，記錄色譜圖。以大黃各成分峰面積(As)和內(nèi)標(biāo)峰面積(Ar)的比值Y對(duì)質(zhì)量濃度c(ng/mL)進(jìn)行權(quán)重回歸(1/c2)。得大黃酸、大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素及大黃素甲醚的回歸方程分別為Y=-0.017 0+0.047 2c、Y=0.018 2+0.464c、Y=-0.000 836+0.000 095 1c、Y=0.028 1+0.002 58c及Y=0.000 285+0.000 061 6c，各成分線性良好，相關(guān)系數(shù)r≥0.99。該方法大黃酸、大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素及大黃素甲醚的定量下限分別為2、0.5、10、10及10 ng/mL，準(zhǔn)確度在98.09%～114.20%，精密度(RSD)小于15.61%，滿足定量下限分析測定的要求。

3.3 準(zhǔn)確度及精密度

分別配制低、中、高不同質(zhì)量濃度大黃酸(5，100，480 ng/mL)、大黃素(1，4，16 ng/mL)、大黃酚(20，80，320 ng/mL)、蘆薈大黃素(20，80，320 ng/mL)及大黃素甲醚(20，80，320 ng/mL)血漿樣本各6份，照“2.4”項(xiàng)下同法操作，一個(gè)分析批內(nèi)測定6次，計(jì)算批內(nèi)變異。不同分析批測定3次，計(jì)算批間變異。結(jié)果如表1所示，各成分準(zhǔn)確度在89.51%～109.36%，精密度(RSD)小于20.19%。

Figure1 Chromatograms of blank plasma (A),blank plasma spiked with standard solution (B) and plasma sample obtained 1 h after oral administration ofNiuhuangJieduTablets (C)

1:1,8-Dihydroxyanthraquinone (tR5.2 min);2:Chrysophanol (tR5.8 min) and chrysophanol isomer (tR4.0 min);3:Emodin (tR5.1 min);4:Aloe-emodin (tR4.3 min);5:Rhein (tR3.9 min);6:Physcion (tR6.6 min)

Analytec/(ng/mL)Inter-batchMeasured concentration/(ng/mL)Accuracy/%RSD/%Intra-batchMeasured concentration/(ng/mL)Accuracy/%RSD/%Rhein55.13±0.34102.536.735.47±0.74109.3613.49100108.04±9.93108.049.19106.01±4.33106.014.08480494.04±32.01102.926.48468.42±64.1997.5913.70Emodin10.99±0.0699.405.621.02±0.10101.599.8343.94±0.1798.384.244.10±0.59102.5614.391614.47±0.8790.476.0415.22±2.1395.1513.99Chrysophanol2019.03±1.4295.177.4518.63±1.6693.138.898079.19±2.9998.993.7879.09±3.8798.874.89320329.81±28.28103.078.58326.98±14.00102.184.28Aloe-emodin2020.29±2.49101.4312.3019.00±2.2495.0211.788083.51±6.08104.387.2883.53±6.46104.417.74320330.86±17.21103.395.20334.04±9.63104.392.88Physcion2021.61±3.22108.0714.9120.23±4.08101.1620.198073.21±3.9691.515.4071.61±5.5689.517.77320307.59±33.7296.1210.96321.06±28.62100.338.91

3.4 基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率

取低、中、高混合對(duì)照品溶液50 μL，加入20% L-抗壞血酸溶液40 μL，照“2.4”項(xiàng)下同法操作，作為基質(zhì)效應(yīng)對(duì)照組，記錄樣品峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為A。取空白血漿，甲醇沉淀后分取上清液，加入對(duì)應(yīng)濃度的混合對(duì)照品溶液，照“2.4”項(xiàng)下同法操作，作為基質(zhì)效應(yīng)樣品組。記錄樣品峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為B。按基質(zhì)效應(yīng)因子(MF)=B/A×100%計(jì)算MF。

照“3.3”項(xiàng)下分別配制低、中、高質(zhì)量濃度的QC樣品，作為提取回收率樣品組，根據(jù)與基質(zhì)效應(yīng)樣品組的峰面積比值計(jì)算提取回收率?；|(zhì)效應(yīng)和提取回收率結(jié)果見表2，在低、中、高不同質(zhì)量濃度下，QC樣品的基質(zhì)效應(yīng)和提取回收率穩(wěn)定，符合生物樣本定量分析的要求。

Analytec/(ng/mL)Matrix effect/%RSD/%Recovery/%RSD/%Rhein5158.61±14.299.0171.13±1.482.08100157.90±4.903.1164.29±3.866.01480179.55±17.079.5166.21±3.935.94Emodin118.29±1.719.3380.44±4.095.09415.18±0.845.5585.46±2.843.321618.55±1.065.7390.78±2.612.87Chrysophanol20110.72±14.6113.2072.28±14.4019.9280100.12±12.4212.4077.30±10.6613.79320110.69±7.036.3588.71±5.996.76Aloe-emodin2061.29±14.3123.3486.08±11.6613.548053.23±3.676.8972.89±4.836.6232080.65±8.2210.1979.41±2.763.47Physcion2092.82±18.1119.5158.68±8.0313.698096.52±7.417.6887.77±17.0119.3832083.57±6.818.1490.34±10.5411.67

3.5 穩(wěn)定性

考察了血漿樣品于室溫(25 ℃)放置8 h，3次凍融，處理后的血漿樣品進(jìn)樣盤(15 ℃)放置24 h的穩(wěn)定性，結(jié)果見表3。大黃酸、大黃素、大黃酚、蘆薈大黃素及大黃素甲醚濃度均無明顯變化，穩(wěn)定性良好。

Analytec/(ng/mL)Autosampler (15 °C)Measured concentration/(ng/mL)RSD/%Freeze-thaw cyclesMeasured concentration/(ng/mL)RSD/%Room-temperature (25 °C)Measured concentration/(ng/mL)RSD/%Rhein55.51±0.468.296.11±0.8413.805.04±0.367.24480499.33±60.0712.03506.28±23.984.74433.70±26.966.22Emodin10.99±0.109.611.10±0.1211.110.85±0.1518.021613.29±2.0315.3114.91±0.946.3215.96±1.549.63Chry-sophanol2016.15±2.0512.7116.35±2.3414.3418.22±3.0016.43320283.49±31.2311.02318.30±21.616.79349.31±29.028.31Aloe-emodin2023.18±5.8225.1123.08±4.8020.7720.00±2.6113.03320281.03±17.8317.83337.83±37.7511.17329.26±24.397.41Physcion2017.87±3.0016.7916.40±2.9417.9519.05±1.316.90320351.71±37.7110.72315.14±23.367.41302.53±33.1510.96

3.6 藥代動(dòng)力學(xué)研究

大鼠灌胃大黃及牛黃解毒片后不同時(shí)間點(diǎn)大黃3種活性成分的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見圖2，所得數(shù)據(jù)經(jīng)WinNonlin7.0軟件計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，結(jié)果見表4。

ParameterRheinRhei Radix et RhizomaNHJDTChrysophanol isomerRhei Radix et RhizomaNHJDTcmax/(μg/L)121±103*474±251*8 757±5 22613 467±8 153tmax/h0.14±0.080.11±0.080.47±0.22*0.25±0.16*t1/2/h5.2±1.9*6.9±3.5*3.4±0.864.0±2.0AUC0-t/(μg·h /L)275±176*406±194*30 879±9 98433 342±15 105AUC0-∞/(μg·h /L)329±198*590±353*32 937±10 24837 727±16 442Vd/(L/kg)3 406±2 6075 204±3 34015.4±5.7*43.3±24.6*CL/(L·kg/h)427±260566±2923.1±0.72*7.8±3.0*

*P<0.05

4 討 論

對(duì)大鼠血漿樣本前處理方法及色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化。比較了甲醇沉淀、6 mol/L HCl酸化后甲醇沉淀、乙酸乙酯提取、6 mol/L HCl酸化后乙酸乙酯提取4種前處理方法，結(jié)果顯示血漿樣本經(jīng)甲醇沉淀提取效率高，重復(fù)性好。處理過程中加入20%L-抗壞血酸溶液，防止蒽醌類成分在前處理操作中被氧化。另外，對(duì)色譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，考察了使用甲醇或乙腈作為有機(jī)相、流動(dòng)相中加入甲酸或甲酸銨及色譜柱種類對(duì)大黃5種成分保留時(shí)間、峰形及響應(yīng)的影響，以達(dá)到增強(qiáng)分離效果、縮短分析時(shí)間及提高靈敏度的目的。最終確定了以0.1%甲酸銨水溶液-0.1%甲酸銨甲醇溶液為流動(dòng)相，Inertsil ODS-3 C8色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm )為最佳色譜條件。

大鼠給藥后血漿中檢測到保留時(shí)間約為4.1 min 的色譜峰，其[M-H]-峰及二級(jí)質(zhì)譜均與保留時(shí)間約為5.8 min的大黃酚完全一致，推測為大黃酚異構(gòu)體，這與大鼠給藥大黃附子湯后血漿中檢測到大黃酚異構(gòu)體的文獻(xiàn)[10]相似。大黃酚異構(gòu)體保留時(shí)間較短，因此其與大黃酚相比極性更大，推測其可能結(jié)構(gòu)如圖3所示。研究中因大黃酚異構(gòu)體對(duì)照品無法獲得，故以大黃酚對(duì)照品替代計(jì)算相對(duì)濃度。

Figure3 Chemical structure of chrysophanol isomer

大鼠給藥后，血漿大黃素暴露量整體較低(圖2-C)，這可能在很大程度上歸因于大黃素在體內(nèi)代謝成葡萄糖醛酸苷[11]，但其在血藥濃度-時(shí)間時(shí)曲線中仍呈現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，說明中藥同系物成分多樣，在體內(nèi)的代謝與轉(zhuǎn)化，還會(huì)相互影響特征成分的藥代動(dòng)力學(xué)行為。文獻(xiàn)報(bào)道[12]，大鼠給予大黃附子湯后，蘆薈大黃素的血藥濃度-時(shí)間曲線呈現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，與本研究中大黃素的雙峰現(xiàn)象，均由大黃酸在體內(nèi)與大黃素及蘆薈大黃素發(fā)生相互轉(zhuǎn)化所致[13]。

研究結(jié)果表明，大鼠灌胃單味大黃后，血漿中僅檢測出大黃酸及大黃酚異構(gòu)體2種成分；而牛黃解毒片全方給藥后，血漿中檢測出大黃酚異構(gòu)體、大黃酸和較低濃度水平的大黃素3種成分。SPSS獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)表明，牛黃解毒片給藥后大鼠血漿中大黃酸的cmax、AUC及t1/2，大黃酚異構(gòu)體的Vd及CL與單味大黃相比，顯著增加，大黃酚異構(gòu)體的tmax顯著下降。所以，復(fù)方配伍促進(jìn)了大黃有效成分的吸收利用[14-15]，改變了大黃有效成分的藥代動(dòng)力學(xué)行為。