王安妮，肖慧琳，張超杰，鄭秋玲，王 婷，唐美玲*

（山東省煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東 煙臺(tái) 265500）

馬瑟蘭是法國(guó)利用赤霞珠和歌海娜雜交育成的品種，近年來(lái)在煙臺(tái)產(chǎn)區(qū)表現(xiàn)良好，長(zhǎng)勢(shì)中庸，果穗松散，顏色較好，抗病性強(qiáng)，栽培面積逐年增加。如何進(jìn)一步提高其果實(shí)品質(zhì)釀出具有產(chǎn)區(qū)特色的葡萄酒是目前急需解決的生產(chǎn)問(wèn)題。

花色苷是釀酒葡萄與葡萄酒中至關(guān)重要的一類物質(zhì)。葡萄果實(shí)和葡萄酒呈現(xiàn)出的顏色主要是由花色苷組分和含量決定，而顏色是評(píng)價(jià)葡萄果實(shí)和葡萄酒品質(zhì)的一項(xiàng)重要依據(jù)[1]。葡萄品種中含有的花色苷組分主要由遺傳因素決定[2]，但目前也有研究表明，環(huán)境因素和管理方式也會(huì)影響花色苷的組分和含量[3-6]。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外對(duì)于果際微氣候調(diào)控對(duì)釀酒葡萄果實(shí)花色苷的影響開(kāi)展了很多研究。大多數(shù)的釀酒葡萄適宜摘葉的時(shí)期是快速著色期，但不同品種和不同產(chǎn)區(qū)之間也有些許差異。LEMUT M S等[7]在維帕瓦谷測(cè)定的黑比諾表示在坐果期摘葉處理最佳。雷玉娟等[8]在新疆地區(qū)采用不同時(shí)期結(jié)合不同摘葉的方式處理赤霞珠，表明轉(zhuǎn)色后半摘葉和采收前全摘葉均提高了果實(shí)含糖量，有利于花色苷的合成；張國(guó)濤等[9]在香格里拉分五個(gè)時(shí)期對(duì)赤霞珠進(jìn)行摘葉處理，表示在轉(zhuǎn)色前期及中期效果較好。

為進(jìn)一步明確果際微氣候調(diào)控對(duì)煙臺(tái)產(chǎn)區(qū)馬瑟蘭果實(shí)中花色苷的影響，本研究擬通過(guò)轉(zhuǎn)色期前、后兩個(gè)時(shí)期對(duì)果穗周圍葉片進(jìn)行摘葉處理，探究馬瑟蘭果實(shí)中花色苷組分和含量的變化，為提高煙臺(tái)產(chǎn)區(qū)馬瑟蘭品質(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試品種為馬瑟蘭980，均采自于山東省煙臺(tái)產(chǎn)區(qū)蓬萊龍湖酒莊。

花翠素-3-O-葡萄糖苷、花青素-3-O-葡萄糖苷、甲基花青素-3-O-葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷及二甲花翠素-3-O-葡萄糖苷：Miragen公司；乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、甲酸（分析純）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260 Infinity高效液相色譜（high efficiencyliquid chromatography，HPLC）儀：安捷倫科技有限公司；BSA224S電子天平：北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；AA-56311有機(jī)相過(guò)濾器：安捷倫科技有限公司；H13237型超純水器：四川優(yōu)普超純科技有限公司；IKA MS3 basic渦旋振蕩器：艾卡儀器設(shè)備有限公司；Centrifuge 5430R高速離心機(jī)：德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本次試驗(yàn)選擇生長(zhǎng)健壯，長(zhǎng)勢(shì)一致的植株，每10棵樹(shù)為一個(gè)處理，重復(fù)3次，各處理隨機(jī)排列。分別在轉(zhuǎn)色前（花后35 d）和全部轉(zhuǎn)色結(jié)束后（花后65 d）兩個(gè)時(shí)期在果穗上下各摘除1片葉，不摘葉做對(duì)照。

1.3.2 果皮花色苷的提取

果實(shí)成熟時(shí)每個(gè)處理隨機(jī)取樣100粒漿果，樣品采集后放入冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室剝?nèi)」し湃胍旱兴賰?，然后用研缽磨成粉末放入真空冷凍干燥機(jī)-40℃下冷凍干燥24 h，果皮粉保存在-40℃冰箱內(nèi)備用。準(zhǔn)確稱量0.2 g放入研缽，加入1.5 mL的提取液（甲酸∶水∶甲醇=2∶28∶70）繼續(xù)研磨至無(wú)明顯顆粒狀，并用移液槍吸取1 mL于離心管中。室溫下1500r/min避光搖床振蕩10min，然后4℃條件下13000r/min低溫離心10 min，取上清液經(jīng)0.22 μm的濾膜過(guò)濾并收集到離心管內(nèi)。-80℃保存待測(cè)上機(jī)。

1.3.3 果皮花色苷的定性和定量

花色苷采用高效液相色譜技術(shù)測(cè)定。色譜條件如下：KromasilC18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流速1.0mL/mim；柱溫30℃；進(jìn)樣量20 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)525 nm；流動(dòng)相A甲酸∶水=1∶9，B甲酸∶乙腈=1∶9。

采用外標(biāo)法進(jìn)行定性和定量分析。準(zhǔn)確稱取花翠素-3-O-葡萄糖苷、花青素-3-O-葡萄糖苷、甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷、甲基花青素-3-O-葡萄糖苷和二甲花翠素3-O-葡萄糖苷這5種標(biāo)準(zhǔn)品用10%的甲酸溶液配制成質(zhì)量濃度為10mg/L、20 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)液，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后，在確定的色譜條件下上機(jī)測(cè)定，擬合5種花色苷的質(zhì)量濃度（Y）和峰面積（X），得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程進(jìn)行定量分析。相關(guān)系數(shù)均在0.999 2以上，線性關(guān)系良好，符合高效液相色譜的標(biāo)準(zhǔn)。其他各類?；ㄉ諈⒖剂赫癫腫10]測(cè)定結(jié)果推斷色譜峰代表成分。

2 結(jié)果與分析

2.1 花色苷組分和相對(duì)含量對(duì)比分析

如表1所示，轉(zhuǎn)色后摘葉處理組中檢測(cè)出的數(shù)量與對(duì)照組相同，而轉(zhuǎn)色前摘葉處理組中共檢測(cè)出16種花色苷單體。除了對(duì)照組中的那12種葡萄糖苷花色苷之外，還多檢測(cè)出2種單葡萄糖苷花色苷單體和2種雙葡萄糖苷花色苷。雖然大多數(shù)研究結(jié)果表明歐亞種葡萄中只含有單葡萄糖苷花色苷，但也有少數(shù)研究表明，一些歐亞種中也存在少量雙糖苷[11-14]，其在葡萄酒中的顏色和穩(wěn)定性具有雙重特性。在新酒中，雙糖苷花色苷在熱和光下的穩(wěn)定性好于花色素單糖苷，但在葡萄酒的成熟和陳釀過(guò)程中是非常不穩(wěn)定的[15-16]。至于本研究中轉(zhuǎn)色前摘葉增加果實(shí)中的雙糖苷花色苷對(duì)于后期葡萄酒呈色的影響有待于進(jìn)一步研究。

表1 三種處理馬瑟蘭葡萄皮中花色苷的分析Table 1 Analysis of anthocyanins in grape skins of Marselan with three types of treatments

煙臺(tái)產(chǎn)區(qū)馬瑟蘭果實(shí)中花色苷種類主要是五類，包括花翠素類、花青素類、甲基花翠素類、甲基花青素類和二甲基花翠素類，沒(méi)有檢測(cè)到花葵素類。其中相對(duì)含量最高的就是二甲基花翠素類，相對(duì)含量最低的是花青素類，這與多個(gè)研究結(jié)果一致[17-19]，摘葉處理沒(méi)有改變這個(gè)趨勢(shì)。三個(gè)處理對(duì)照組中二甲基花翠素類相對(duì)含量最高為92.06%，轉(zhuǎn)色前摘葉組的相對(duì)含量最低為87.51%；花青素類相對(duì)含量最低的是對(duì)照組為0.36%，而轉(zhuǎn)色前摘葉處理的相對(duì)含量最高為0.57%。轉(zhuǎn)色前摘葉處理組中除了二甲基花翠素類相對(duì)含量低于對(duì)照和轉(zhuǎn)色后摘葉的，其余四大類相對(duì)含量都要高于對(duì)照和轉(zhuǎn)色后摘葉的。轉(zhuǎn)色后摘葉的除了花翠素和二甲基花翠素類相對(duì)含量略低于對(duì)照組，其他三類相對(duì)含量高于對(duì)照組。

煙臺(tái)產(chǎn)區(qū)馬瑟蘭果實(shí)中的花色苷以未酰化、香豆酰化、咖啡?；鸵阴；姆N形態(tài)存在。轉(zhuǎn)色前摘葉組相對(duì)含量的高低順序?yàn)橄愣辊；ㄉ眨疚歹；ㄉ眨疽阴；ㄉ眨究Х弱；ㄉ?。轉(zhuǎn)色后摘葉處理與對(duì)照基本相似，只是相對(duì)含量比對(duì)照稍高，為45.68%。但轉(zhuǎn)色前摘葉處理中含量最高的是未?；ㄉ?，為45.27%，其次才是香豆?；ㄉ?，為35.07%，并且三種?；问交ㄉ障鄬?duì)含量都要少于轉(zhuǎn)色后摘葉處理和對(duì)照組。由此可以看出，轉(zhuǎn)色前摘葉在一定程度上抑制了花色苷的甲基化和?；?，這與PASTORE C等[20-21]的研究結(jié)果是一致的，漿果成熟過(guò)程中長(zhǎng)時(shí)間高溫灼燒或者曝光能顯著減少花色苷的甲基化和?；潭?。

如表2所示，三種處理方式共檢測(cè)到花翠素類3種，花青素類2種，甲基花翠素類3種，甲基花青素類3種，二甲基花翠素類5種。轉(zhuǎn)色前摘葉處理組比對(duì)照組多檢測(cè)到2種單葡萄糖苷花色苷單體（花青素-3-O-葡糖苷、甲基花翠素-3-O-（6-O-乙酰）葡糖苷）和2種雙葡萄糖苷花色苷（花翠素-3-O-（6-O-對(duì)香豆酰）葡糖苷-5-O-葡糖苷和二甲花翠素-3-O-（6-O-香豆酰）葡糖苷-5-O-葡糖苷）。轉(zhuǎn)色后摘葉處理組和對(duì)照處理組檢測(cè)的花色苷單體種類一致。

表2 三種處理馬瑟蘭葡萄皮中花色苷的相對(duì)含量Table 2 Relative percentage of anthocyanins in Marselan grape skins with three types of treatments

轉(zhuǎn)色前摘葉中相對(duì)含量最高的是二甲基花翠素-3-O-葡糖苷花色苷，為39.36%，其次是二甲花翠素-3-O-（6-O-對(duì)香豆酰）葡糖苷，相對(duì)含量為29.68%，再次是二甲花翠素-3-O-（6-O-乙酰）葡糖苷，相對(duì)含量為16.53%，三者共占了總花色苷的85.57%；而轉(zhuǎn)色后摘葉處理和對(duì)照組中二甲花翠素-3-O-（6-O-對(duì)香豆酰）葡糖苷含量最高，分別為40.85%和39.70%，其次是二甲花翠素-3-O-葡糖苷，相對(duì)含量分別為29.45%和30.82%；再次是二甲花翠素-3-O-（6-O-乙酰）葡糖苷，相對(duì)含量分別是18.07%和18.88%，三者共占了總花色苷的88.37%和89.40%。

2.2 五種基本花色苷含量對(duì)比

由表3看出，在相同的稱樣質(zhì)量和處理方法下，對(duì)照中只檢測(cè)出4種基本花色苷，沒(méi)有檢測(cè)出花青素-3-O-葡糖苷。轉(zhuǎn)色前摘葉檢測(cè)出5種，其含量最高的是二甲基花翠素-3-O-葡糖苷367.5mg/kg；含量最低的是花翠素-3-O-葡萄苷，只有19.17 mg/kg。轉(zhuǎn)色后摘葉處理也是檢測(cè)到4種基本花色苷，只是含量較對(duì)照略高。而轉(zhuǎn)色前摘葉處理中檢測(cè)出了5種基本花色苷，比對(duì)照增加了花青素-3-O-葡糖苷，但含量極少，僅為9.81 mg/kg。有研究表明，葡萄果實(shí)中花青素-3-O-葡糖苷含量低不僅是因?yàn)樗羌谆磅；ㄉ盏那绑w物質(zhì)[22-23]，而且它在B環(huán)上含有的O-酚類中相鄰的羥基官能團(tuán)對(duì)酶較為敏感，更易氧化[24]。本研究中只有轉(zhuǎn)色前摘葉處理組中檢測(cè)出該類花青素，進(jìn)一步說(shuō)明了曝光能顯著減少花色苷?；潭龋cPASTORE C等[20-21]研究結(jié)果一致。

表3 三種處理下馬瑟蘭葡萄果皮中5種花色苷含量Table 3 Contents of five kinds of anthocyanins in the Marselan grape skins with three types of treatments mg/kg

從五種基本花色苷含量分析，轉(zhuǎn)色前、后摘葉均能增加花色苷的含量，而轉(zhuǎn)色前摘葉處理效果更為顯著。轉(zhuǎn)色前摘葉處理的五類基本花色苷總量達(dá)到1 438.68 mg/kg，是對(duì)照組的3.16倍。其中含量最高的是二甲花翠素-3-O-葡糖苷（1177.85mg/kg），是對(duì)照組的3.21倍。而轉(zhuǎn)色后摘葉處理的五類基本花色苷總量為509.98mg/kg，含量略高于對(duì)照組（454.45 mg/kg）。這與MATSUYAMA S等[25-26]的研究結(jié)果一致，適當(dāng)?shù)恼~處理可以增加花色苷含量及改變單體的組分。通過(guò)果際微氣候調(diào)控改善果實(shí)的光照條件，一方面增加了花色苷的合成底物，另一方面促進(jìn)了花色苷合成相關(guān)酶的活性以及基因的表達(dá)[27-29]。而本研究試驗(yàn)結(jié)果的獲得是通過(guò)促進(jìn)哪些基因的表達(dá)需要進(jìn)一步探究。

3 結(jié)論

在煙臺(tái)產(chǎn)區(qū)，摘葉措施能夠有效增加馬瑟蘭釀酒葡萄中花色苷的單體種類和含量，并且轉(zhuǎn)色前處理優(yōu)于轉(zhuǎn)色后處理。轉(zhuǎn)色前處理比對(duì)照多檢測(cè)出4種單體，增加了雙葡萄糖苷花色苷的數(shù)量，但降低了花色苷的酰化程度，其基本花色苷總量是對(duì)照的3.16倍；轉(zhuǎn)色后處理與對(duì)照組的花色苷單體種類相同，其花色苷總量略高于對(duì)照組。不同摘葉處理對(duì)于馬瑟蘭葡萄酒的影響還在進(jìn)一步研究當(dāng)中。