李利軍，馬英輝，盧美歡

（陜西省微生物研究所，陜西 西安 710043）

高血壓是目前威脅人類健康的主要疾病之一，治療高血壓的化學(xué)藥物日益顯現(xiàn)出較為明顯的副作用。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin-convertingenzyme，ACE）是一種含鋅二肽羧肽酶，可以調(diào)節(jié)血壓，是引發(fā)人類患高血壓的主要因素之一[1]。它能將無升壓活性的血管緊張素I（angiotensin I，AngI）轉(zhuǎn)化為具有強升壓活性的血管緊張素II（angiotensin II，Ang II），同時會抑制有降壓作用的緩激肽的分解，從而導(dǎo)致人體血壓上升[2]。目前主要的ACE抑制藥物有卡托普利、依那普利、賴諾普利等。但易引起干咳，偶見血管神經(jīng)性水腫等許多不良反應(yīng)[3-4]。近年來，食源性的ACE抑制肽受到普遍關(guān)注，一般由幾個或幾十個氨基酸組成。理論上講，食物中的蛋白質(zhì)水解后都可以產(chǎn)生多肽或低聚肽，包括含有ACE抑制活性的多肽，目前已有的報道主要來自于動物蛋白、植物蛋白和藻類蛋白等[5]。大豆蛋白是其中的重要原料之一。

1 微生物發(fā)酵法生產(chǎn)ACE抑制肽

與化學(xué)法相比，利用微生物發(fā)酵產(chǎn)生的ACE抑制肽具有成本低、無污染的優(yōu)點，且所用菌種一般為可食用益生菌類，后期無需經(jīng)過高度純化也能食用，因而成為研究的熱點。另外，微生物發(fā)酵法并不是單純依靠微生物所產(chǎn)的蛋白酶將底物分解，產(chǎn)生目標(biāo)產(chǎn)物，而是能夠?qū)⒚附夂筢尫诺男‰脑俳?jīng)過微生物的修飾、轉(zhuǎn)移重組等作用，產(chǎn)生新的具有更優(yōu)性質(zhì)和更高應(yīng)用價值的多肽[6]。

MAHTA M等[7]利用馬克斯克魯維酵母（Kluyveromyces marxianus）發(fā)酵制備ACE抑制肽，獲得了氨基酸序列為Val-Leu-Ser-Thr-Ser-Phe-Pro-Pro-Lys的片段，其半抑制活性可達15.2 μmol/L；陳應(yīng)運等[8]以蛤蜊為原料，采用納豆菌發(fā)酵制備ACE抑制肽，發(fā)酵產(chǎn)物對ACE抑制率達到80.49%；李風(fēng)娟等[9]利用枯草芽孢桿菌發(fā)酵大豆，所產(chǎn)生的ACE半抑制率為0.312 mg/mL；李景[10]以豆粕為原料，利用米曲霉制備ACE抑制肽，抑制率可達到56.03%；李利軍等[11]以大豆分離蛋白為原料，利用枯草芽孢桿菌BS90進行發(fā)酵，發(fā)酵40 h，ACE抑制率達81.8%；LI Y等[12]篩選出Kluyveromyces marxianusZ17菌株發(fā)酵牛乳，并采用凝膠過濾色譜和反相高效液相色譜分離純化出2種ACE抑制肽，其半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值分別為59.2 μg/mL、86.3 μg/mL。但是由于微生物發(fā)酵法的機理較復(fù)雜，反應(yīng)進程不易控制，因此已有報道較少，多用于乳制品制備活性肽的研究中。而以蛋白為原料發(fā)酵的普通調(diào)味品中ACE活性抑制肽卻不被大家所關(guān)注。

2 發(fā)酵調(diào)味品中的ACE抑制肽

發(fā)酵調(diào)味品是采用微生物發(fā)酵的方法，生產(chǎn)的具有食品調(diào)味和佐餐功能的一類食品。近年來，生物技術(shù)的發(fā)展突飛猛進，腸道益生菌的研究，給酵素帶來巨大的市場空間。發(fā)酵調(diào)味品作為傳統(tǒng)發(fā)酵食品，所含有的各種生物活性物質(zhì)也得到廣泛認可，其中ACE抑制肽成為關(guān)注熱點之一。

發(fā)酵調(diào)味品主要有醬油、食醋、豆腐乳、黃豆醬、甜面醬、蠶豆醬、郫縣豆瓣、豆豉等。其中醬油、豆腐乳、黃豆醬、豆豉均以黃豆為主要原料，經(jīng)過微生物制曲、發(fā)酵產(chǎn)生氨基酸等鮮、香味物質(zhì)而成。食醋、甜面醬分別以淀粉質(zhì)原料為主，郫縣豆瓣以蠶豆為主要原料，經(jīng)微生物制曲發(fā)酵而成。事實上，即使制醋所用的原料以淀粉質(zhì)為主，也仍含較高的蛋白質(zhì)。如玉米、大米、高粱、小麥粉、蠶豆等，理論上說，均可產(chǎn)生ACE抑制肽，調(diào)味品主料及蛋白質(zhì)含量見表1。

表1 部分釀造調(diào)味品所用主料及蛋白質(zhì)含量Table 1 Main raw material and protein content for partial brewing condiments

2.1 發(fā)酵調(diào)味品中常用菌種

發(fā)酵調(diào)味品常用的微生物主要是能夠產(chǎn)生蛋白酶的菌株，如米曲霉、毛霉、黑曲霉、酵母、枯草芽孢桿菌等。

米曲霉是發(fā)酵調(diào)味品中常用的生產(chǎn)菌，主要用于醬油、豆醬、豆豉等的釀造。李響等[13]研究了大豆分離蛋白作底物不同菌種的發(fā)酵作用，用肽含量和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）抑制率為檢測指標(biāo)，分別對乳酸菌、霉菌和芽孢桿菌發(fā)酵后的產(chǎn)物進行ACE抑制活性測定，發(fā)現(xiàn)霉菌中具有較強ACE抑制活性的菌是米曲霉。其中曲霉菌分解大豆分離蛋白，使發(fā)酵液偏堿性，有利于大豆分離蛋白釋放ACE抑制肽。

毛霉主要用于豆腐乳的生產(chǎn)。杭梅等[14]利用毛霉菌接種到豆腐上保溫培養(yǎng)并發(fā)酵，采用乙醇為溶劑，進行提取，測定乙醇提取物的ACE抑制活性，發(fā)現(xiàn)到培養(yǎng)第5天時，活性最高?？莶菅挎呔饕糜诩毦远刽l(fā)酵，也有發(fā)酵豆醬等，種類較多，納豆菌也屬其中之一。酵母一般用于后熟發(fā)酵，起輔助發(fā)酵產(chǎn)乙醇的作用，發(fā)酵后期產(chǎn)生乙醇、丁醇等有機醇類，可以與有機酸反應(yīng)，生成有機酯類，是醬香風(fēng)味物質(zhì)的來源，但未見報道酵母菌產(chǎn)ACE抑制肽的研究。乳酸菌一般在釀造發(fā)酵食品中都有發(fā)現(xiàn)，屬發(fā)酵過程自然伴生細菌，主要功能是完成乳酸發(fā)酵，產(chǎn)豐富的乳酸等有機酸，可以與醇類發(fā)生反應(yīng)生成有機酯。萬月[15]利用德氏乳桿菌發(fā)酵還原脫脂乳，ACE抑制率可達65.2%。

2.2 常見發(fā)酵調(diào)味品

2.2.1 豆醬

豆醬一般以大豆為原料，常見的發(fā)酵豆醬用菌種有米曲霉、枯草芽孢菌等。大豆經(jīng)過浸泡蒸煮、晾涼，接入菌種進行通風(fēng)保溫制曲。然后加入食鹽水進行保溫發(fā)酵，制作而成。劉笑梅等[16]經(jīng)發(fā)酵試驗發(fā)現(xiàn)，豆醬制作過程中，發(fā)酵技術(shù)參數(shù)對ACE活性抑制率有影響：加水量為175%，保溫50℃發(fā)酵12 d，效果最好。

劉婉璐等[17]研究了利用米曲霉為菌種，發(fā)酵制備豆醬時ACE抑制肽的活性變化情況，并分析了相關(guān)化學(xué)成分的變化，認為在發(fā)酵過程的前期，ACE抑制活性升高迅速，認為美拉德反應(yīng)產(chǎn)物具有穩(wěn)定后期樣品高活性的作用。

2.2.2 醬油

醬油是我國傳統(tǒng)調(diào)味食品。生產(chǎn)原料以大豆為主，菌種也多數(shù)采用米曲霉。一般經(jīng)過原料處理、蒸熟變性、冷卻晾涼后接種制曲，然后加拌曲鹽水進行發(fā)酵。制作工藝主要有低鹽固態(tài)發(fā)酵法、原池淋澆發(fā)酵法、低溫稀醪發(fā)酵法。目前我國北方低鹽固態(tài)發(fā)酵法依然有很多企業(yè)采用，然而也有很多企業(yè)為了提高產(chǎn)品風(fēng)味，已經(jīng)改為原池淋澆發(fā)酵法。我國南方大部分地區(qū)醬油生產(chǎn)都采用低溫稀醪發(fā)酵法[18]。

日本的梅川逸人等[19]研究了日本溜醬油糟中的多肽對ACE的抑制及降壓作用，認為日本的溜醬油多肽含量高于濃口醬油，是濃口醬油的2倍，采用透析、脫鹽、凍干處理，精制后做成溜醬油糟多肽，ACE抑制作用明顯較高，在大白鼠高血壓模型（spontaneously hypertensive rat，SHR）的飼料中添加5 mg/kg就具有明顯的降壓效果。

李鳳娟等[20]分析了7種醬油產(chǎn)品中ACE抑制肽的活性。認為大豆蛋白水解程度與ACE抑制活性并非呈正比，可能與多種化合物綜合作用相關(guān)，有必要對其中的ACE抑制劑的結(jié)構(gòu)特點進行更深入的分析。

2.2.3 豆豉

豆豉是中國傳統(tǒng)食品，中醫(yī)上淡豆豉入藥。豆豉以整粒大豆為原料，經(jīng)蒸煮、制曲、發(fā)酵而成。所用菌種各不相同風(fēng)味各異：有米曲霉、毛霉，也有用枯草芽孢菌的。

雖然國內(nèi)這方面的研究較少，但故意無視或選擇性失明的現(xiàn)象卻非常多。例如，在鄉(xiāng)村學(xué)校中，老師有時會對調(diào)皮學(xué)生的一些行為故意無視，這種態(tài)度會使學(xué)生最終走上輟學(xué)的道路[15]。另外，在農(nóng)民工受到不公平待遇時[16]，在報刊編輯工作中[17]，在企業(yè)管理中[18-19]，都存在故意無視或選擇性失明的現(xiàn)象。旅游中也存在這樣的問題。例如，后繼旅游開發(fā)商無視前開發(fā)商與當(dāng)?shù)鼐用褚蚶鏇_突而退出當(dāng)?shù)氐那闆r，仍然限制居民的參與權(quán)，忽視居民的“決策”“經(jīng)營”“享益”的權(quán)利[20]。

蘇現(xiàn)波等[21]對永川豆豉的理化指標(biāo)、ACE抑制活性等指標(biāo)進行了測定與評價，分別采用分光光度法和高效液相色譜法測定ACE抑制活性。結(jié)果顯示，不同廠家生產(chǎn)的豆豉產(chǎn)品，其營養(yǎng)、感官及功能活性等指標(biāo)均有不同，技術(shù)參數(shù)對豆豉相關(guān)品質(zhì)的影響需要進一步研究。

2.2.4 豆腐乳

豆腐乳是中國傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品。在我國已有近千年的歷史，因味美，具有佐餐、助消化功能而深受海內(nèi)外華人歡迎。主要以大豆為原料，先制作為密度較大的豆腐，然后切小塊再接種毛霉，待毛霉菌絲布滿整個豆腐小塊后，加鹽水及輔料進行保溫發(fā)酵。常見的有紅方、白方、青方等。

加工工藝對豆腐乳中的ACE抑制活性影響較大。馬艷莉等[22]研究了不同輔料和發(fā)酵參數(shù)對腐乳ACE抑制活性的影響，認為酒、紅曲和面曲的添加對豆腐乳中的ACE抑制活性都有影響，乙醇使其在后酵第5周達最大；紅曲作用在后酵第6周達最大；面曲的作用也是在后酵第6周達最大?？偟膩碚fACE抑制活性在腐乳制作的后期發(fā)酵過程中，表現(xiàn)為先升后降趨勢。

3 ACE抑制肽的分離純化技術(shù)

ACE抑制肽都是混合多肽中的小組分物質(zhì)，所以進行分離純化是必不可少的環(huán)節(jié)。為了提高純度，對多肽混合物目前常用的分離純化方法主要有靜態(tài)吸附法、超濾法、離子交換層析法、凝膠過濾層析法、高效毛細管電泳法、反相高效液相色譜法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法、質(zhì)譜分析及氨基酸序列分析等方法。一般是先采用超濾處理，使不同分子質(zhì)量的多肽混合物進行分離，再通過凝膠過濾色譜或者與離子交換色譜相結(jié)合達到進一步的分離，最后純化技術(shù)采用反向高效液相色譜（reverse phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC）、毛細管電泳。

陳合等[23]采用超濾法初步純化，采用DA201-C型大孔吸附樹脂脫鹽，得到并富集具有ACE抑制活性的成分；鐘芳等[24]運用RP-HPLC、大孔吸附樹脂、凝膠過濾色譜法分離純化ACE抑制肽，其ACE抑制率達到96.92%；鄒基豪等[25]在綠豆中提取ACE抑制肽，用SephadexG-25凝膠柱色譜對酶解產(chǎn)物分離純化，純化后得到3個組分；刁靜靜等[26]采用模擬移動床（simulated moving bed，SMB）色譜技術(shù)產(chǎn)業(yè)化分離具有較高血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）抑制活性的綠豆肽；毛跟年等[27]采用超濾、Sephadex G-25、Sephadex G-15及反相高效液相色譜對松仁清蛋白酶解液進行分離純化，對純化后樣品（組分D2）進行質(zhì)譜結(jié)構(gòu)鑒定。質(zhì)譜結(jié)果進行從頭測序，篩選得到ACE抑制肽Tyr-Leu-Leu-Lys（YLLK），分子質(zhì)量為535.34 Da。該肽經(jīng)固相合成純度為99.80%，其半數(shù)抑制濃度測定值為0.282 5 μmol/L；毛跟年等[28]利用堿性蛋白酶解魔芋蛋白，制備ACE抑制肽粗品；通過超濾法除去大分子雜質(zhì)，再經(jīng)過Sephadex G-15柱層析分離，最后經(jīng)過RP-HPLC純化，得到的魔芋ACE抑制肽純度較高；張瑩等[29]以豬皮水解液為原料，采用Sephadex G-15、半制備高效液相色譜分離純化膠原ACE抑制肽，獲得AP-I、AP-II兩個組分，IC50值分別為19.50 mg/mL、1.01 mg/mL；李開等[30]采用超濾、離子交換色譜和反相高效液相色譜對薏苡仁谷蛋白中的ACE抑制肽進行分離純化，最終獲得組分B2在質(zhì)量濃度0.01mg/mL時，ACE抑制率為（73.41±1.05）%；上海師范大學(xué)的杜夢珂[31]從富硒堿性茶蛋白中也獲得了較高活性的ACE抑制肽。

另外，ACE抑制肽檢測方法大都采用體外檢測法，通過檢測血管緊張素I的模擬物馬尿酰組氨酰亮氨酸（hippurlyhistidyl-leucine，HHL）的產(chǎn)物馬尿酸的產(chǎn)量來反映ACE抑制肽的活性。目前，主要有紫外檢測法、可見分光光度法和高效液相法。分光光度法由于操作步驟繁瑣，導(dǎo)致結(jié)果誤差較大。高效液相色譜能夠準(zhǔn)確的測定體系中馬尿酸的產(chǎn)生量，是近年來測定ACE抑制肽的主要方法。

吳瓊英等[32]用高效液相色譜法測定治療高血壓藥物卡托普利（Captopril）對ACE的抑制效率，以馬尿酰組氨酰亮氨酸（HHL）為反應(yīng)底物，反應(yīng)生成的馬尿酸（hippuric acid，HA）為測定指標(biāo)，利用直接進樣和等度洗脫的方法進行測定，該法中等度洗脫可使馬尿酸（HA）、組氨酰亮氨酸（histidyl-leucine，HL）、馬尿酰組氨酰亮氨酸（HHL）良好分離，方便快捷。后又改進，利用高效液相色譜法測定ACE抑制肽的抑制率，更為簡捷、精密、準(zhǔn)確。

近年來高效毛細管電泳（high performance capillary electrophoresis，HPCE）[34]發(fā)展迅猛，是傳統(tǒng)電泳和現(xiàn)代微柱分離相結(jié)合的一種新型分離分析技術(shù)。具有時間短、分離效率高、檢測限低、進樣量小、溶劑消耗少、自動化程度高等優(yōu)點，是高效液相色譜分析的補充。在蛋白質(zhì)、氨基酸、有機化合物、藥物分離分析等方面極為重要，特別是在活性肽純度檢驗方面應(yīng)用廣泛。

4 釀造發(fā)酵調(diào)味食品的發(fā)展趨勢展望

食源性的ACE抑制肽應(yīng)是今后高血壓防治研究領(lǐng)域關(guān)注的重點。目前我國ACE抑制肽的研究較多，但較為分散，不夠系統(tǒng)，主要是在初級的制備、篩選、分離純化方面，真正應(yīng)用所形成的產(chǎn)品很少，偶有也是以功能食品的形式出現(xiàn)，難以實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化[35]。

發(fā)酵調(diào)味品是我國傳統(tǒng)佐餐調(diào)味食品，原料富含蛋白質(zhì)，選擇優(yōu)良的高產(chǎn)菌并優(yōu)化制曲、發(fā)酵工藝和相關(guān)關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)，提高發(fā)酵調(diào)味品中的ACE抑制肽含量，開發(fā)出高抑制活性的低鹽腐乳、低鹽豆醬、低鹽醬油、低鹽豆豉等產(chǎn)品，既可以滿足群眾日常生活中食品調(diào)味佐餐的消費需求，還具有調(diào)節(jié)虛血壓的功能，使高血壓患者或潛在高血壓人群通過合理飲食就可以改善或調(diào)節(jié)血壓，減少那些潛在的發(fā)病患者，是未來產(chǎn)業(yè)發(fā)展方向。

隨著ACE抑制肽研究的不斷深入，對發(fā)酵調(diào)味品中ACE抑制肽的研究，應(yīng)關(guān)注：（1）提高產(chǎn)品中ACE抑制肽的含量，開發(fā)具有降壓作用的釀造發(fā)酵調(diào)味食品；（2）采用計算機網(wǎng)絡(luò)技術(shù)對制備條件進行模擬和優(yōu)化，提高生成率；（3）研究ACE抑制肽構(gòu)象與功能的關(guān)系，優(yōu)化小分子ACE抑制肽的化學(xué)合成途徑與技術(shù)；（4）構(gòu)建基因工程菌，進行ACE抑制肽的大量表達；（5）開發(fā)具有ACE抑制肽功能的降壓發(fā)酵調(diào)味食品。

其實中國傳統(tǒng)的釀造發(fā)酵食品，歷史悠久，對人體有重要的健康促進作用，通過ACE抑制肽的研究，發(fā)現(xiàn)并弘揚傳統(tǒng)釀造產(chǎn)品的生理功能活性，帶動傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)升級換代具有重要意義。