鄧崇文 陳艷輝 張志偉

[摘要]目的：探討環(huán)狀RNA circEPSTIl對人胃癌SGC-7901細(xì)胞的生物學(xué)功能。方法：運用MTT實驗檢測circEPSTIl對人胃癌SGC-7901細(xì)胞的生長能力；AnnexinV-FITC/PI檢測circEPSTIl對人胃癌SGC-7901細(xì)胞的凋亡作用。結(jié)果：MTT檢測發(fā)現(xiàn)，敲低circEPSTIl可抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞的生長，具有時間依賴性；AnnexinV-FITC/PI實驗顯示，敲低circEPSTIl能顯著促進(jìn)胃癌SGC-7901細(xì)胞的凋亡作用，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），結(jié)論：敲低circEPSTIl可抑制人胃癌細(xì)胞生長，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡

[關(guān)鍵詞]circEPSTIl；胃癌；生長與凋亡

非編碼RNA的種類繁多，其中包括了具有調(diào)節(jié)功能的微小RNA（microRNAs， miRNAs）以及環(huán)狀RNA（ circular RNAs，circRNAs）等。miRNA是一類廣泛存在于真核牛物中的長度約22nt的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA分子[1]。miRNA的主要作用機制是與靶基因的3' UTR形成不完全互補配對，阻斷靶基因翻譯從而達(dá)到基因調(diào)控的目的。或與靶基因形成完全互補配對，引起靶基因在互補區(qū)發(fā)牛斷裂，導(dǎo)致基因沉默[2]。circRNA是南外顯子和（或）內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄物構(gòu)成的共價環(huán)狀閉合的單鏈RNA，其廣泛存在于各種細(xì)胞中，有著比線性RNA更為穩(wěn)定的特性[3]。然而目前關(guān)于circEPSTIl在胃癌中的表達(dá)情況、牛物學(xué)功能以及參與胃癌發(fā)牛發(fā)展的作用機制仍不清楚。本研究采用MTT、細(xì)胞流式檢測分析circEPSTIl在人胃癌SGC-7901細(xì)胞中的牛物學(xué)行為，為進(jìn)一步闡明胃癌發(fā)牛發(fā)展的分子機制提供實驗依據(jù)。

1 實驗方法

1.1 體外細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)培養(yǎng)。

1.2 MTT測定以每孔5000個細(xì)胞的密度接種在96孔板中，并在370C孵育24小時。然后將細(xì)胞再培養(yǎng)48小時，并且根據(jù)說明書進(jìn)行MTT測定。使用Bio-Tek EPOCH2測量570nm的吸光度；

1.3 si-RNA轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞完全培養(yǎng)基中細(xì)胞生長至約50%密度；計算配好lipofectamin2000及轉(zhuǎn)染；室溫下放置20 min，使DNA與脂質(zhì)體形成復(fù)合體；用無血清培養(yǎng)液洗滌培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞。往復(fù)合體中加入無血清的培養(yǎng)液（不含抗牛素），溫和混勻，加入到待轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)瓶中；置于37。C，5%C02培養(yǎng)箱中，放置24-48 h后，收集細(xì)胞，進(jìn)行實驗。

1.4 Annexin V/PI雙染色法細(xì)胞凋亡實驗 （1）用去離子水將10×Binding Buffer稀釋成1×緩沖液；（2）細(xì)胞收集。用不含EDTA的胰酶消化收集后，于室溫2000rpm離心5～10分鐘，收集細(xì)胞；（3）細(xì)胞洗滌：用預(yù)冷1×PBS（ 40C）重懸細(xì)胞一次，2000rpm離心5～10分鐘，洗滌細(xì)胞；（4）加入300卜L1的1×緩沖液懸浮細(xì)胞；（5）Annexin V-FITC標(biāo)記：加入5μ1的Annexin V-FITC混勻后，避光，室溫孵育15分鐘；PI標(biāo)記：上機前5分鐘再加入5μ1的PI染色；（6）補加200卜Ll的1×緩沖液；（7）流式細(xì)胞儀分析：流式細(xì)胞儀激發(fā)光波長用488 nm，用一波長為515 nm的通帶濾器檢測FITC熒光，另一波長大于560 nm的濾器檢測PI；（8）結(jié)果判讀：在雙變量流式細(xì)胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細(xì)胞，為（ FITC-IPI-）；有上象限是非活細(xì)胞，即壞死細(xì)胞，為（ FITC+/PI+）；而右下象限為凋亡細(xì)胞，顯現(xiàn)（FITC+/PI-），

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。所有結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。兩組間比較用t檢驗，多組間比較用單因素方差分析，當(dāng)P<0.05時，為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT檢測circEPSTIl對人胃癌SGC-7901細(xì)胞生長的影響通過轉(zhuǎn)染circEPSTIl的siRNA及其對照過夜后，消化細(xì)胞，將人胃癌SGC-7901細(xì)胞以2×103個的密度接種于96孔板，每種細(xì)胞接種4孔，連續(xù)3天在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔吸光度值，記錄結(jié)果取均值并繪圖，實驗重復(fù)3次。結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)染circEPSTIl siRNA 24h、48h、72h后OD值為（0.484±0.003）、（0.575±0.003）、（0.654±0.003）分別與對照組（0.563±0.037）、（0.759±0.028）、（0.955±0.031）比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），提示過表達(dá)circEPSTIl可抑制人胃癌SGC-7901細(xì)胞的生長。

2.2 敲低circEPSTIl誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞的凋亡為檢測敲低circEPSTIl對胃癌細(xì)胞的抑制效果，我們選用SGC-7901胃癌細(xì)胞，circEPSTIl處理48 h后，選用AnnexinV-FITC和PI染色來檢測凋亡細(xì)胞，結(jié)果顯示，circEPSTI1可以引起的細(xì)胞凋亡（21.67±1.49）%，而經(jīng)sl-control處理的陰性對照組（7.50±0.87）%，無明顯的細(xì)胞凋亡發(fā)生。該結(jié)果說明敲低circEPSTIl可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞SGC-7901發(fā)生凋亡。

3 討論

近幾年隨著牛物信息學(xué)以及高通量測序技術(shù)的進(jìn)步，環(huán)狀RNA的研究得到了前所未有的關(guān)注與發(fā)展。迄今為止，科學(xué)家們已經(jīng)在各種生物體中發(fā)現(xiàn)了超過一萬種不同的環(huán)狀RNA。由于環(huán)狀RNA具有獨特的結(jié)構(gòu)，細(xì)胞類型特異性和組織特異性表達(dá)模式，以及在血液，唾液和外泌體中穩(wěn)定表達(dá)的特點，環(huán)狀RNA成為了當(dāng)今癌癥研究中的熱點。關(guān)于clrcRNA在胃癌中的作用知之甚少，circRNA 000479來自EPST11基因，其位于染色體13q14上，因此我們將circRNA 000479命名為“circEPSTIl”。EPSTI1基因功能涉及廣泛的上皮一基質(zhì)相互作用[2]，先天性免疫[2]，并且該基因的表達(dá)可能是癌癥侵襲和轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵事件[1]。攜帶EPSTI1和circEPSTIl的染色體13q14的異常常見于包括胃癌在內(nèi)的多種癌癥[3-5]。本研究通過MTT以及細(xì)胞凋亡實驗證實敲低circEPSTIl能夠抑制胃癌細(xì)胞系的生長與增殖，并且促進(jìn)凋亡。這些結(jié)果說明circEPSTIl能夠促進(jìn)胃癌的惡性生物學(xué)行為，有可能成為潛在的治療靶點。

綜上所述，我們的研究表明環(huán)狀RNA在胃癌惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮作用，可能通過作為miRNA海綿發(fā)揮調(diào)節(jié)功能。下一步通過體內(nèi)體外的功能實驗，闡明circEPSTIl通過涉及競爭性內(nèi)源RNA的機制影響胃癌的增殖和凋亡的分子機制。對環(huán)狀RNA的進(jìn)一步研究和關(guān)注將有助于我們更好地了解胃癌的進(jìn)展，并為胃癌的生物標(biāo)志物或潛在治療靶點提供新的思路。

參考文獻(xiàn)

[l]Chen LL.The biogenesis and emerging roles of circular RNAs.Nature reviews Molecular cell biology.2016；17：205-11

[2]Sanger HL，Klotz qRiesner D.Viroids are single-stranded covalently closed circular RNA molecules existing as highly base-paired rod-like structures.Ptoceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.l976；73：3852-6

[3lSalzman J，Gawad C，Wang PL.Circular RNAs are the predominant transcript isofonn from hundreds of human genes in diverse cell types.PloS one.2012；7：e30733.

[4]Jeck WR，Sharpless NE.Detecting and characterizing circular RNAs.Nature biotechnology.2014；32：453-61.

[5]Jeck WR，Sorrentino JA，Wang K.Circular RNAs are abundant，conserved，and associated with ALU repeats.Rna.2013；19：141-57