劉靜 袁婷 倪細(xì)爐 朱強(qiáng) 王翠平

摘 要： 以寧夏枸杞新品種‘寧杞8號(hào)幼嫩葉片為外植體， 探討激素組合及添加物對(duì)‘寧杞8號(hào)體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)、體胚增殖、萌發(fā)和植株再生的影響，并建立高效穩(wěn)定的體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系。結(jié)果表明：通過(guò)對(duì)6-BA、2，4-D和IAA進(jìn)行正交分析，篩選出‘寧杞8號(hào)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)最優(yōu)激素組合：6-BA 1.0 mg·L-1+2，4-D 0.3 mg·L-1 + IAA 0.4 mg·L-1，體胚誘導(dǎo)率達(dá)88.67%。極差分析比較各激素間的影響，6-BA對(duì)體胚誘導(dǎo)影響最顯著。當(dāng)高濃度的生長(zhǎng)素及低濃度細(xì)胞分裂素濃度適宜的配比時(shí)，才能誘導(dǎo)產(chǎn)生形態(tài)正常數(shù)量多的‘寧杞8號(hào)體細(xì)胞胚。在體胚增殖培養(yǎng)中，6-BA的濃度過(guò)高易導(dǎo)致玻璃化，不利于‘寧杞8號(hào)體胚增殖生長(zhǎng)。隨著激素濃度的增高，體胚增殖倍數(shù)增加，玻璃化率也越高，綜合分析得到‘寧杞8號(hào)最佳體胚增殖培養(yǎng)基為6-BA 0.4 mg·L-1+NAA 0.6 mg·L-1。當(dāng)添加IBA 0.3 mg·L-1+GA3 0.4 mg·L-1+蔗糖10 g·L-1時(shí)，‘寧杞8號(hào)體胚萌發(fā)率最高，萌發(fā)率達(dá)89.17%。添加GA3及低濃度蔗糖能促進(jìn)成熟的體胚萌發(fā)。對(duì)‘寧杞8號(hào)體萌發(fā)的影響程度依次是IBA> 蔗糖 > GA3?；钚蕴磕苡行岣摺畬庤?號(hào)體胚再生植株率，同時(shí)對(duì)萌發(fā)體胚的根的發(fā)育也有促進(jìn)作用，當(dāng)IBA 0.1 mg·L-1+KT 0.4 mg·L-1+活性炭1 g·L-1時(shí)，‘寧杞8號(hào)體胚再生植株效果最佳，體胚再生率達(dá)91.67%。

關(guān)鍵詞： ‘寧杞8號(hào)， 體細(xì)胞胚胎發(fā)生， 體胚誘導(dǎo)增殖， 體胚萌發(fā)， 植株再生

中圖分類(lèi)號(hào)： Q945 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1000-3142（2018）09-1183-08

Abstract： In order to establish a high-frequency regeneration system for Lycium barbarum. The leaf of L. barbarum ‘Ningqi-8 was selected as material to explore the crucial effects of hormone combinations and additives on the induction of somatic embryogenesis， somatic embryo proliferation and germination and plant regeneration. The results showed that by orthogonal analysis of 6-BA， 2，4-D and IAA， the optimal hormone combination of L. barbarum ‘Ningqi-8 somatic embryos was 6-BA 1.0 mg·L-1+2，4-D 0.3 mg·L-1+IAA 0.4 mg·L-1， the highest induction rate could get to 88.67%. Range analysis showed that 6-BA had the most significant effect on somatic embryogenesis. Using suitable proportion of hormone combination was possible to induce somatic embryogenesis of L. barbarum ‘Ningqi-8， which had a large number of normal morphology. In the culture of somatic embryos， the high concentration of 6-BA was easy to cause vitrification， which was not conducive to the growth and proliferation of L. barbarum ‘Ningqi-8 somatic embryos. The proliferation rate of somatic embryos increased with the increase of hormone concentration， and the vitrification rate increased， too. Then the most efficient proliferation medium for L. barbarum ‘Ningqi-8 was 6-BA 0.4 mg·L-1+NAA 0.6 mg·L-1， and the highest germination rate of L. barbarum ‘Ningqi-8 somatic embryo was obtained when IBA 0.3 mg·L-1+GA3 0.4 mg·L-1+ sucrose 10 g·L-1 was added. The highest germination rate could get to 89.17%， and the degree of influence on the germination of L. barbarum ‘Ningqi-8 was IBA > sucrose > GA3. Adding GA3 and low concentration sucrose could promote the mature somatic embryo germination. Activated carbon could effectively improve the regeneration rate of L. barbarum ‘Ningqi-8 somatic embryo， and simultaneously promote the development of the root of germination embryo. IBA 0.1 mg·L-1+KT 0.4 mg·L-1+ activated carbon 1 g·L-1 was found to be the suitable medium for regeneration in which L. barbarum ‘Ningqi-8 demonstrated the highest multiplying capacity， and the regeneration rate could get to 91.67%.

Key words： Lycium barbarum ‘Ningqi-8， somatic embryogenesis， somatic embryo induction and proliferation， somatic embryo germination， plant regeneration

寧夏枸杞（Lycium barbarum）屬于茄科枸杞屬，多年生分枝灌木，具有很高的藥用價(jià)值和生態(tài)價(jià)值。隨著寧夏枸杞藥用保健方面的深入發(fā)掘，種植面積逐年增加，用途單一的枸杞品種很難滿(mǎn)足加工企業(yè)的需求，要培育用途廣泛的枸杞新品種，以滿(mǎn)足生產(chǎn)加工的需要（何軍等，2006）。雜交育種是運(yùn)用最早且最為常規(guī)的育種手段，但其新品種育種年限長(zhǎng)。植物體細(xì)胞胚具有單細(xì)胞起源、繁殖速度快、體胚個(gè)體間遺傳背景一致、染色體穩(wěn)定等特點(diǎn)，是開(kāi)展植物細(xì)胞工程育種中遺傳轉(zhuǎn)化、種質(zhì)保存、人工種子等研究工作的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是懸浮細(xì)胞系建立、細(xì)胞突變體誘導(dǎo)與篩選、原生質(zhì)體培養(yǎng)與融合等諸多生物技術(shù)應(yīng)用的基礎(chǔ)。枸杞體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系的建立將為寧夏枸杞生物技術(shù)育種提供良好的平臺(tái)，同時(shí)有助于加快生物技術(shù)在寧夏枸杞品種改良方面的應(yīng)用。

曹有龍等（1997）以‘寧杞1號(hào)髓部組織為材料， 通過(guò)懸浮培養(yǎng)誘導(dǎo)胚狀體發(fā)生。馬和平等（2005）對(duì)‘寧杞 2 號(hào)幼果未成熟胚進(jìn)行體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)，探討了激素、光照及溫度對(duì)體胚發(fā)生及植株再生的影響。王兆賓等（2014）以‘寧杞1號(hào)‘寧杞2號(hào)‘寧杞4號(hào)及新疆枸杞種子為外植體，構(gòu)建了體細(xì)胞胚高頻發(fā)生再生體系。這些報(bào)道為枸杞體細(xì)胞發(fā)生體系的建立提供了借鑒。然而，由于基因型的差異，體細(xì)胞胚發(fā)生體系建立的最優(yōu)條件在枸杞不同品種間存在較大差異?！畬庤?號(hào)是通過(guò)自然選優(yōu)的方式獲得的大果寧夏枸杞新品種，具有生長(zhǎng)旺盛、果粒大、果實(shí)營(yíng)養(yǎng)成分高等優(yōu)良特性（南雄雄等，2014）?！畬庤?號(hào)單個(gè)果實(shí)縱徑可達(dá)4.3 cm，是‘寧杞1號(hào)等品種的兩倍，但目前有關(guān)‘寧杞8號(hào)體胚發(fā)生的相關(guān)研究尚未見(jiàn)有報(bào)道?！畬庤?號(hào)體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系的建立，為枸杞品種改良和新品種選育提供新途徑，不受時(shí)間和空間的限制，同時(shí)短時(shí)間大量繁殖，加快優(yōu)良品種的繁育，滿(mǎn)足新品種工廠(chǎng)化生產(chǎn)。國(guó)內(nèi)更多研究是以枸杞胚乳、種子、子葉及下胚軸等為外植體進(jìn)行體胚誘導(dǎo)，對(duì)于葉片誘導(dǎo)研究較少。

利用枸杞葉片進(jìn)行體胚誘導(dǎo)取材更為方便，還能較大地保存植株的遺傳特性。因此，本研究以寧夏枸杞新品種‘寧杞8號(hào)葉片為外植體，探索不同種類(lèi)及濃度的附加物對(duì)體細(xì)胞胚胎發(fā)生的影響，旨在建立體細(xì)胞胚胎發(fā)生體系，也為寧夏枸杞生物技術(shù)育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

所用外植體材料為寧夏枸杞新品種‘寧杞8號(hào)頂梢幼嫩葉片，采自寧夏林業(yè)研究院枸杞種質(zhì)資源圃。該品種于2012年通過(guò)國(guó)家植物新品種保護(hù)，2015年通過(guò)寧夏自治區(qū)林木良種審定。

1.2 方法

1.2.1 ‘寧杞8號(hào)體細(xì)胞胚誘導(dǎo) 采取健壯無(wú)病蟲(chóng)害的‘寧杞8號(hào)的幼嫩葉片，自來(lái)水沖洗30 min，在超凈工作臺(tái)上，先用75%酒精處理30 s，無(wú)菌水沖洗3～4遍。再用0.1%的HgCl2溶液處理3～4 min，無(wú)菌水沖洗3～4次后，將葉片剪成0.5 cm×0.5 cm的小塊，接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基中。采用L9 （34 ） 正交設(shè)計(jì)，研究6-BA（0.5、1.0、1.5 mg·L-1）、2，4-D（0.3、0.6、0.9 mg·L-1）、IAA（0.2、0.4、0.6 mg·L-1）對(duì)‘寧杞 8 號(hào)體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)的影響，共9個(gè)處理， 基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+蔗糖30 g·L-1+瓊脂6 g·L-1。每處理10瓶，每瓶5個(gè)外植體，每處理重復(fù)3次。培養(yǎng)40 d后，統(tǒng)計(jì)體胚誘導(dǎo)率及體胚的生長(zhǎng)情況。培養(yǎng)溫度23～25 ℃，光照 16 h·d-1，光照強(qiáng)度2 000 lx，培養(yǎng)方式下同。

1.2.2 ‘寧杞8號(hào)體胚增殖培養(yǎng) 采用二因素完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，探究6-BA（0.4、0.8 mg·L-1）和NAA（0.2、0.4、0.6 mg·L-1）對(duì) ‘寧杞8號(hào)體胚增殖的影響，共設(shè)6個(gè)處理，基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+蔗糖30 g·L-1+瓊脂6 g·L-1。取‘寧杞8號(hào)生長(zhǎng)正常的體胚組織塊，切成0.2 cm × 0.3 cm小塊接種于上述體胚增殖試驗(yàn)培養(yǎng)基內(nèi)。每處理10瓶，每瓶5個(gè)體胚塊，重復(fù)3次。培養(yǎng)40 d后統(tǒng)計(jì)增體胚再生率和增殖倍數(shù)。

1.2.3 ‘寧杞8號(hào)體細(xì)胞胚萌發(fā) 研究IBA、GA3、蔗糖對(duì)‘寧杞8號(hào)體胚萌發(fā)的影響，采用L9 （34）正交設(shè)計(jì)，即A.IBA（濃度為0.1、0.2、0.3 mg·L-1），B.GA3（濃度為0.2、0.4、0.6 mg·L-1），C.蔗糖（濃度為10、20、30 g·L-1），MS為基本培養(yǎng)基。將成熟體胚分別接種于上述試驗(yàn)處理中，每處理10瓶，每瓶4個(gè)成熟體胚，重復(fù)3次。培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計(jì)體胚萌發(fā)率，記錄體胚萌發(fā)生長(zhǎng)狀況。

1.2.4 ‘寧杞8號(hào)體胚完整植株再生 添加 0.1、0.3 mg·L-1的IBA和0.2、0.4 mg·L-1的KT，同時(shí)又分為①不添加活性炭，②添加1 g·L-1活性炭?jī)山M，共設(shè)8個(gè)處理（表4），基本培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基+蔗糖30 g·L-1+瓊脂6 g·L-1。將長(zhǎng)有胚根的體胚接種于上述培養(yǎng)基中，每處理10瓶，每瓶4個(gè)材料，重復(fù)3次，培養(yǎng)25 d后，記錄植株再生率、植株的生長(zhǎng)情況及芽增殖系數(shù)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì) 體胚誘導(dǎo)率=生成體胚葉片數(shù)/接種的葉片總數(shù)×100%； 體胚增殖倍數(shù)=葉片體胚團(tuán)產(chǎn)生新的體胚數(shù)/該處理接種的體胚數(shù)； 體胚玻璃化率=新增殖體胚中的玻璃化體胚數(shù)/供試體胚總數(shù)×100%； 體胚萌發(fā)率=生根的體胚數(shù)/供萌發(fā)試驗(yàn)的體胚總數(shù)×100%； 再生植株率=根芽完整的植株/供試的體胚總數(shù)×100%； 芽增殖系數(shù)=體胚產(chǎn)生的芽數(shù)/供試接種數(shù)。用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，Duncans檢驗(yàn)顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 激素對(duì)‘寧杞8號(hào)體細(xì)胞胚胎誘導(dǎo)的影響

根據(jù)表1中K值的大小，通過(guò)6-BA、KT、NAA各因素水平間的比較，6-BA在1.0 mg·L-1時(shí)為最優(yōu)，2，4-D 在0.3 mg·L-1時(shí)為最優(yōu)，IAA在0.4 mg·L-1時(shí)為最優(yōu)，可得出‘寧杞 8 號(hào)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)最優(yōu)激素組合6-BA 1.0 mg·L-1+2，4-D 0.3 mg·L-1 + IAA 0.4 mg·L-1，即處理4。處理4體胚誘導(dǎo)率最高，達(dá)到了88.67%，說(shuō)明處理4對(duì)誘導(dǎo)體胚發(fā)生效果最好，這一結(jié)果與K值分析結(jié)果一致。綜合以上分析結(jié)果，可以確定‘寧杞 8 號(hào)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)最佳組合為6-BA 1.0 mg·L-1+2，4-D 0.3 mg·L-1+IAA 0.4 mg·L-1。極差值R越大，說(shuō)明該因素對(duì)指標(biāo)的影響越顯著，從表1可以看出，6-BA的R值最大，說(shuō)明在本研究中6-BA為主導(dǎo)因素，對(duì)‘寧杞 8 號(hào)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的影響最大，在這三個(gè)因素中，根據(jù)R值的大小，對(duì)‘寧杞8號(hào)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)的影響程度依次是6-BA > IAA >2，4-D。

2.2‘寧杞 8 號(hào)體胚發(fā)育不同階段形態(tài)觀(guān)察

‘寧杞8號(hào)體胚誘導(dǎo)培養(yǎng)過(guò)程中，10 d后葉片逐漸膨大，葉面拱起。15 d膨大的葉片切口處生成許多密集小突起，呈現(xiàn)綠色球形小點(diǎn)（圖1： A）。培養(yǎng)20 d后，逐漸生成細(xì)胞團(tuán)，呈不規(guī)則形態(tài)。培養(yǎng)25 d后，細(xì)胞團(tuán)不斷增殖，包圍整個(gè)胚體。通過(guò)顯微觀(guān)察發(fā)現(xiàn)，清晰可見(jiàn)許多發(fā)育良好的球形胚（圖1： B）、心形胚（圖1： C）和魚(yú)雷胚（圖1： D）。球形胚因形態(tài)較大，肉眼可見(jiàn)。隨著發(fā)育程度的變化，同一體胚團(tuán)塊能觀(guān)察到各個(gè)時(shí)期的體胚同時(shí)存在，以球形胚居多，可見(jiàn)魚(yú)雷胚和發(fā)育較快的子葉胚，并有綠色或紫紅色芽出現(xiàn)（圖1： E）。隨著胚狀體逐漸成熟，萌發(fā)體胚團(tuán)塊上生長(zhǎng)大量胚根（圖1： F）。

2.3 6-BA和NAA對(duì)‘寧杞8號(hào)體胚增殖的影響

從表2可以看出，當(dāng)6-BA濃度不變時(shí)，隨著NAA濃度的升高，體胚增殖倍數(shù)逐漸增加，在處理6中6-BA為0.8 mg·L-1、NAA為0.6 mg·L-1時(shí)，體胚增殖倍數(shù)最高（達(dá)13.22），其玻璃化率也達(dá)到最高。在體胚增殖培養(yǎng)中，不是激素濃度越高越好，6-BA的濃度過(guò)高易導(dǎo)致玻璃化，不利于‘寧杞8號(hào)體胚增殖生長(zhǎng)。當(dāng)降低6-BA濃度（為0.6 mg·L-1）時(shí)，即處理3。處理3體胚增殖倍數(shù)為12.28，在P=0.05水平下與處理6差異不顯著，體胚玻璃化率明顯低于處理6，差異顯著，且處理3體胚玻璃化率與處理1、處理2差異不顯著。因此，綜合分析可得，最優(yōu)‘寧杞8號(hào)體胚增殖的配方為6-BA 0.4 mg·L-1+NAA 0.6 mg·L-1，即處理3。

2.4 激素和蔗糖對(duì)‘寧杞8號(hào)體胚萌發(fā)的影響

‘寧杞8號(hào)體胚萌發(fā)統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3，8號(hào)處理體胚萌發(fā)率最高（達(dá)89.17%），體胚萌發(fā)效果最佳且差異顯著。從表3中的K值大小可以看出，IBA為0.3 mg·L-1、GA3為0.4 mg·L-1時(shí)，蔗糖在10 g·L-1時(shí)為最優(yōu)，可得出‘寧杞8號(hào)體胚萌發(fā)最優(yōu)激素組合為IBA 0.3 mg·L-1+GA3 0.4 mg·L-1+蔗糖10 g·L-1，即處理8，這與試驗(yàn)數(shù)據(jù)所得結(jié)果一致，可確定該組合是‘寧杞8號(hào)體胚萌發(fā)最佳激素配方。IBA的R值最大，說(shuō)明‘寧杞8號(hào)體胚萌發(fā)中IBA為主導(dǎo)因素，對(duì)‘寧杞8號(hào)體胚萌發(fā)的影響最大。根據(jù)R值的大小，對(duì)‘寧杞8號(hào)體胚萌發(fā)的影響程度依次是IBA>蔗糖>GA3。

2.5 激素及活性炭對(duì)‘寧杞8號(hào)體胚植株再生的影響

由表4可知，添加活性炭對(duì)‘寧杞8號(hào)體胚植株再生有顯著效果，植株再生率、新生根數(shù)、根長(zhǎng)及芽增殖系數(shù)添加活性炭的處理組都高于未添加活性炭的處理組，說(shuō)明添加活性炭有利于‘寧杞8號(hào)體胚植株再生。在IBA 0.1 mg·L-1的濃度處理下，KT 0.4 mg·L-1處理對(duì)‘寧杞8號(hào)體胚植株再生的效果要優(yōu)于KT 0.2 mg·L-1處理，當(dāng)提高IBA濃度（為0.3 mg·L-1）時(shí)，KT 0.2 mg·L-1處理效果優(yōu)于KT 0.4 mg·L-1處理，說(shuō)明生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素在一定的比例配比下，更有利于‘寧杞8號(hào)體胚植株再生，不是配比越高生長(zhǎng)情況越好。綜上所述，IBA 0.1 mg·L-1+KT 0.4 mg·L-1+活性炭1 g·L-1為‘寧杞8號(hào)體胚植株再生最優(yōu)組合，即處理4，此時(shí)植株再生率最高（達(dá)91.67%）。

3 討論與結(jié)論

在植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生過(guò)程中，植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑是誘導(dǎo)體細(xì)胞胚胎發(fā)生最活躍的因子，體胚發(fā)生不同階段所需植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類(lèi)和濃度存在差異。本研究結(jié)果表明，當(dāng)高濃度的生長(zhǎng)素及低濃度細(xì)胞分裂素濃度適宜的配比時(shí)，才能誘導(dǎo)產(chǎn)生形態(tài)正常數(shù)量多的‘寧杞8號(hào)體細(xì)胞胚。當(dāng)6-BA 1.0 mg·L-1+2，4-D 0.3 mg·L-1+IAA 0.4 mg·L-1時(shí)，‘寧杞8號(hào)體胚誘導(dǎo)率最高，達(dá)88.67%，誘導(dǎo)效果最佳，但6-BA濃度過(guò)高，反而抑制了體胚的生成。對(duì)‘寧杞8號(hào)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)各激素效應(yīng)由大到小依次為6-BA> IAA >2，4-D，其中6-BA的影響最顯著。張新寧等（1996）研究也有與本研究相同的發(fā)現(xiàn)，枸杞幼胚接種在含6-BA 0.5～1.0 mg·L-1和IAA 0.5 mg·L-1兩種激素的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，幼胚胚性愈傷組織的發(fā)生率最高。羅青等（2016）通過(guò)對(duì)枸杞花藥進(jìn)行培養(yǎng)試驗(yàn)指出6-BA和NAA配合使用，胚性愈傷組織分化頻率最高，與本研究結(jié)果相比較，在激素種類(lèi)，濃度選擇上有著相似的地方。大多數(shù)植物細(xì)胞在離體培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)胚性細(xì)胞的發(fā)生必須在含有2，4-D的條件下，并認(rèn)為2，4-D對(duì)內(nèi)源生長(zhǎng)素的調(diào)節(jié)和平衡起重要作用（張濤，2007）。張波等（2016）研究中指出，枸杞花藥在2，4-D 0.2 mg·L-1體胚誘導(dǎo)效果最佳。這和本研究添加2，4-D 0.3 mg·L-1體胚誘導(dǎo)效果最佳結(jié)果相似，但由于品種和外植體種類(lèi)的不同，2，4-D最適宜濃度略有不同。枸杞體胚誘導(dǎo)材料主要有胚乳、種子、子葉、花藥、花粉及下胚軸等，本實(shí)驗(yàn)以枸杞葉片為外植體，與以往枸杞體胚誘導(dǎo)方式相比取材更為方便，數(shù)量也比較多，可以隨時(shí)采集，在本實(shí)驗(yàn)篩選的最適宜三種激素配比下，枸杞體細(xì)胞胚誘導(dǎo)率遠(yuǎn)高于胚乳、種子、子葉、花藥、花粉及下胚軸等材料體胚誘導(dǎo)率。

體細(xì)胞胚通過(guò)增殖，能獲得大量形態(tài)正常的體胚，為體胚萌發(fā)及植株再生研究提供材料。通過(guò)6-BA和NAA配比對(duì)‘寧杞8號(hào)體胚增殖倍數(shù)影響進(jìn)行研究，當(dāng)6-BA濃度達(dá)到0.8 mg·L-1，NAA 0.6 mg·L-1時(shí)，體胚增殖能力最強(qiáng)，玻璃化率也最高，當(dāng)6-BA 0.4 mg·L-1，NAA 0.6 mg·L-1時(shí)，體胚增殖能力較強(qiáng)，玻璃化率明顯降低。綜合分析得到6-BA 0.4 mg·L-1+ NAA 0.6 mg·L-1為最優(yōu)‘寧杞8號(hào)體胚增殖培養(yǎng)基。潘珺等（2018）在抗性赤松體胚增殖條件優(yōu)化研究中發(fā)現(xiàn)，添加適宜濃度的NAA和6-BA能夠有效提高體胚增殖速度，對(duì)抗性赤松體胚增殖影響顯著，這與本研究的結(jié)果一致。在‘寧杞8號(hào)體胚增殖過(guò)程中，各處理都出現(xiàn)了玻璃化現(xiàn)象，‘寧杞8號(hào)體胚增殖玻璃化控制還需進(jìn)一步研究。此外，本研究所取增殖的外植體為體胚發(fā)育的各個(gè)時(shí)期，‘寧杞8號(hào)體胚具體哪個(gè)發(fā)育時(shí)期更有利于體胚增殖也有待進(jìn)一步的研究。

體胚的成熟、萌發(fā)和轉(zhuǎn)化是一種相互依賴(lài)的關(guān)系。成熟是萌發(fā)和轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)，只有形態(tài)和生理上都成熟的體胚才能順利進(jìn)行隨后的萌發(fā)和轉(zhuǎn)化。GA3在體細(xì)胞胚進(jìn)一步的發(fā)育成熟、刺激胚根生長(zhǎng)和形成完整小植株中起重要的作用（Evans，1983）。低濃度蔗糖，胚性愈傷停留在組織階段，球形胚甚少，但愈傷組織量多，再生能力強(qiáng)，而且正常苗比例高（Abdoulaye & Mark，2006）。蔣菁等（2013）通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，成苗培養(yǎng)基中添加GA3利于促進(jìn)體細(xì)胞胚誘導(dǎo)成苗，GA3對(duì)花生的體胚萌發(fā)與植株再生有促進(jìn)作用。趙蘋(píng)靜（2009）研究中同樣也指出在添加GA3及低蔗糖濃度條件下，能促進(jìn)成熟的體胚萌發(fā)。本研究通過(guò)對(duì)IBA、蔗糖和GA3進(jìn)行三因素三水平的正交試驗(yàn)，篩選出‘寧杞8號(hào)體胚萌發(fā)最優(yōu)激素組合為IBA 0.3 mg·L-1+GA3 0.4 mg·L-1+蔗糖10 g·L-1，其體胚萌發(fā)率高達(dá)89.17%，與上述觀(guān)點(diǎn)一致。培養(yǎng)基中添加活性炭有利于體胚的成熟發(fā)育（王麗和張煥玲，2016）。本研究結(jié)果也表明，在‘寧杞8號(hào)植株再生培養(yǎng)基中添加適量活性炭，能有效提高體胚萌發(fā)后再生植株率，活性炭對(duì)萌發(fā)體胚根的發(fā)育也有促進(jìn)作用。IBA 0.1 mg·L-1+KT 0.4 mg·L-1+活性炭1 g·L-1為‘寧杞8號(hào)體胚植株再生最優(yōu)組合。王曉春等（2004）在大豆體細(xì)胞胚研究中也同樣得出，添加適量的活性碳促進(jìn)體胚萌發(fā)成正常苗，且促進(jìn)根系生長(zhǎng)，幼苗健壯?；钚蕴磕芪张囵B(yǎng)基中組織產(chǎn)生的抑制胚胎發(fā)生的物質(zhì)及多余的激素，通過(guò)調(diào)整激素濃度的配比而促進(jìn)體胚的正常發(fā)育（袁澍等，2003）。

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