成彩霞 蘇雪 高婷 周璇

摘 要：藜科植物Grayia spinosa是美國西部地區(qū)的特有種，多生長在干旱鹽堿地，具有重要的生態(tài)價值。該研究測定了采自美國西部猶他州G. spinosa 的nrDNA ITS序列，與GenBank中已提交的G. spinosa 的所有ITS序列以及G. spinosa的四個近緣種作為外類群進行比較，分析了美國西部不同地區(qū)G. spinosa ITS序列的一級結構與其RNA二級結構的變異規(guī)律。結果表明：所有G. spinosa樣品的nrDNA ITS序列長度在611～623 bp之間，GC含量在60.35%～61.0%之間，序列間共存在22個變異位點，5個為簡約信息位點。各樣品間的遺傳距離在0.001 8～0.008 9之間，不同樣品間的遺傳距離與地理距離的相關性不顯著。鄰接法構建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示所有G. spinosa聚為一大支，與外類群形成明顯分支。此外，利用RNAfold在線軟件預測了G. spinosa ITS序列的RNA二級結構，將8個G. spinosa 樣品的RNA二級結構根據(jù)構型差異大體上分為四類，分別記為type A，B，C和D四類，主要變異出現(xiàn)在ITS1和ITS2區(qū)。所不同的是在G. spinosa ITS的一級結構分析中GSNE1與GSWA8體現(xiàn)出更近的親緣關系，但二者的RNA二級結構差異明顯，同時GSNE2、GSUT3、GSUT4、GSCA5、GSCA6、GSCO7在ITS序列一級結構分析中也體現(xiàn)出較近的親緣關系，但是他們的RNA二級結構差異明顯。這可能與ITS序列的RNA二級結構在進化中體現(xiàn)出更大的保守性有關。

關鍵詞：Grayia spinosa，ITS 序列變異，二級結構，藜科

中圖分類號：Q949.745.1

文獻標識碼：A

文章編號：1000-3142（2018）05-0617-09

Abstract：Grayia spinosa，a species endemic to the Western United States，is mainly distributed in arid and saline areas and has important ecological value. ITS sequence of G. spinosa collected from Utah State of the United States was sequenced，and aligned with other sequences from GenBank of this species by Blast. The relationship among G. spinosa from the West United States were analyzed based on ITS sequences and four related species of Grayia were selected as outgroup. ITS sequence variation of G. spinosa and its RNA secondary structure was analyzed in different regions of the United States. The results showed that the length of ITS sequences ranged from 611 bp to 623 bp and the GC contents was 60.35%-61.0%. There were 22 variants sites and five parsimony informative sites in the ITS sequences of G. spinosa from different regions in the United States. Genetic distance ranged from 0.001 8 to 0.008 9 between samples，the correlation was not significant between genetic distances and geographical distances of different samples. The phylogenetic tree constructed by Neighbor-joining method indicated that all samples of G. spinosa were clustered together，forming a distinct branch with the outer group. In addition，the RNA secondary structure of G. spinosa ITS sequence was predicted by RNA fold online software. The RNA secondary structure of G. spinosa samples were roughly divided into four types according to the configuration differences，which were named type A，B，C and D. Unlike the primary structure analysis of G. spinosa ITS sequences，RNA secondary structure did not reflect the more related phylogenetic relationships between GSNE1 and GSWA8. GSUT3，GSUT4，GSCA5，GSCA6 and GSCO7 indicated closer phylogenetic relationships in the primary structure analysis of ITS sequences，but their RNA secondary structures were significantly different，which was related to the higher conservation of RNA secondary structure.

Key words：Grayia spinosa，ITS sequence variation，secondary structure，Chenopodiaceae

藜科植物是被子植物的大科之一，是干旱、荒漠生態(tài)環(huán)境中的主要植物類群，全球共有130 屬，約1 500種。我國的藜科植物資源相當豐富，尤其是在以干旱、鹽堿土為主的西北部大面積生態(tài)脆弱區(qū)，藜科植物成為其植被的最重要構成部分之一，具有十分重要的生態(tài)維持與建設價值。參考中國植物志英文版發(fā)現(xiàn)，豬毛菜屬、鹽爪爪屬、堿蓬屬等為我國西北地區(qū)的主要藜科植物，這些類群大多為草本，植株低矮、葉片較小，花很小無觀賞性，生長于農田周圍或城市綠化區(qū)域，而且多以雜草對待。Grayia spinosa為藜科中少有的灌木，植物體較大，壽命長，花被紅色、大而鮮艷，不同于大多數(shù)藜科植物，具有一定的觀賞價值。此外，G. spinosa耐干旱、鹽堿及貧瘠的能力極強，是植被恢復重建的極好材料，但僅分布于北美，美國西部是它最重要的分布區(qū)。

近年來，隨著分子標記技術的迅速發(fā)展，DNA序列分析被廣泛應用于植物系統(tǒng)發(fā)育分析和遺傳多樣性研究。與此同時，由這些分子標記所揭示的DNA等生物大分子的變異式樣及特征成為了研究了解一個物種的最為基本和重要的環(huán)節(jié)，并為進一步的科學研究提供基礎。核DNA ITS序列是介于18S至26S之間的非編碼內轉錄間隔區(qū)，包含一個5.8S編碼區(qū)，由于ITS序列在進化過程中受到的選擇壓力小且進化速率較快等特點，被廣泛用于屬及種水平等較低分類階元親緣關系和系統(tǒng)進化研究（Jaehav & Shama，2014；Liang & Wu，2017；Guo et al，2016）。近年來，ITS序列也開始應用于種內系統(tǒng)關系的研究和藥用植物真?zhèn)纹疯b定等方面（蔣玲艷和郭志剛，2009；Chen et al，2010；Khan et al，2014）。同時，ITS序列雖然在部分區(qū)域出現(xiàn)較高的突變率，卻可能會通過堿基補償替換等方式抵消這些位點的突變對二級結構的干擾，使得在進化過程中其RNA二級結構體現(xiàn)出更大的保守性。因此，本研究通過對美國西部不同地區(qū)G. spinosa的ITS序列一級結構及其RNA二級結構的分析，以期了解以下問題：（1）不同G. spinosa樣品 ITS序列的變異規(guī)律。（2）G. spinosa ITS一級結構與其RNA二級結構的變化是否一致？

1 材料

鑒于該研究的主要目的是探討G. spinosa分布范圍內不同區(qū)域ITS序列的變異樣式，取樣地點的選擇以涵蓋其主要分布區(qū)為準，并且在每個地區(qū)盡可能取2～3個不同地點的材料，凡NCBI已有記錄的樣點不再另行采樣而直接下載其序列的相關信息（包括分布在科羅拉多、加利福尼亞、內華達、華盛頓和猶他州等G. spinosa主要分布區(qū)的所有G. spinosa ITS序列共7個樣品）。樣品GSUT4由朱格麟教授采自猶他州一野外居群，葉片干燥后測序。另外，選擇與G. spinosa親緣關系較近的G. brandegeei、Holmbergia tweedii、Atriplex joaquinana和Chenopodium fremontii為外類群，它們的來源、產地和序列登錄號見表1。

2 方法

2.1 基因組DNA的提取

對采自猶他州的G. spinosa樣品用變色硅膠干燥儲藏，帶回實驗室后采用改良的CTAB法（Doyle，1987）提取基因組總DNA。

2.2 ITS序列的PCR擴增

采用ITS通用引物，即ITS1（5′AGA AGT CGT AAC AAG GTT TCC GTA GC 3′）和 ITS4（5′TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC 3′）。PCR反應總體系為20 μL，其中PCR Mix（寶生物公司）10 μL，上下游引物（20 μmol·L-1）及DNA模板各1μL，加ddH2O 至 20 μL 。擴增程序：（1）70 ℃預變性4 min；（2）94 ℃變性1 min，退火溫度52 ℃，退火1 min；（3）72 ℃延伸1 min，循環(huán)35次；（4）保持72 ℃ 4 min；（5）4 ℃保存PCR產物。

2.3 PCR產物檢測與測序

PCR產物在經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳、EB（溴化乙錠）染色、在紫外燈檢測后，送蘇州金唯智公司進行測序（為雙向測序，結果進行互相驗證）。

2.4 數(shù)據(jù)處理

利用NCBI中的Blast進行序列比對，并選擇與G. spinosa親緣關系近的四個種作為外類群。用DNAstar軟件包中的EditSeq計算ITS序列長度與GC含量，用DNAman計算遺傳距離，R軟件包vegan做Mantel檢驗。用Mage6.0計算變異位點、簡約信息位點并用鄰接法構建系統(tǒng)發(fā)育樹（利用1 000次重復的自展分析檢驗各分支的置信度）。利用RNAfold（RNA二級結構在線預測軟件，http：//rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAfold.cgi）預測G. spinosa的 ITS序列的RNA二級結構，該軟件采用最小自由能原理，參數(shù)設為默認值。

3 結果與分析

3.1 PCR產物電泳結果

利用1.5%的瓊脂糖電泳檢測PCR產物，結果見圖1。ITS序列條帶清晰，與DL2000 bp的DNA Marker比對后長度在500～750 bp，符合ITS序列的長度范圍。

3.2 不同樣品ITS序列比較

對8個G. spinosa樣品進行比較發(fā)現(xiàn)，除GSCA6的ITS序列不完整（575 bp）外，其余來自不同地區(qū)的7個G. spinosa 樣品ITS區(qū)（包括ITS1、5.8S和ITS2序列）長度范圍為 611～623 bp，長度變化12 bp。其中各樣品ITS1區(qū)長度除GSNE1為223 bp外其他均為222 bp，長度變化不大。多數(shù)樣品5.8S區(qū)的長度為164 bp，僅GSWA8出現(xiàn)了3個堿基的缺失。美國西部不同地區(qū)G. spinosa ITS2區(qū)的變化范圍在225～237 bp之間，但GSCA6的ITS2區(qū)長度僅為189 bp。ITS序列的GC含量為60.35%～61.0%，ITS1與ITS2的GC量相近且較5.8S高（表 2）。ITS區(qū)全序列排列后長度為623 bp，共22個變異位點，5個簡約信息位點，其中ITS1區(qū)含5個變異位點，位點79、103、113為簡約信息位點，位點88為堿基G顛換為堿基T，且包含有一個簡并堿基，位點111為堿基C轉換為堿基T。 5.8S區(qū)含3個變異位點，無簡約信息位點，其中位點223、248為堿基C轉換為T，位點266為堿基G轉換為堿基C。ITS2區(qū)有14個變異位點，其中除位點425、616為簡約信息位點外，其余均為變異位點，其中位點563、590、601、614、615為堿基G-C之間的轉換，位點613為堿基T顛換為堿基G，448為堿基C顛換為堿基T，位點600出現(xiàn)了堿基G-C間的轉換以及堿基G-T間的顛換。位點542、622為堿基G-A間的顛換，位點617為堿基A顛換為堿基C，位點621為堿基C顛換為堿基A。表3結果表明，各樣品間的長度變化主要出現(xiàn)在ITS2區(qū)。GC含量ITS2區(qū)較高，ITS1區(qū)次之，5.8S區(qū)較低。此外，簡約信息位點ITS1區(qū)較ITS2區(qū)多一個，而就變異位點而言，ITS2區(qū)變異位點較ITS1區(qū)多，5.8S區(qū)除個別樣品可能存在有變異位點外，其他位點均未出現(xiàn)變異。因此，ITS序列的主要變異也出現(xiàn)在ITS2區(qū)。G. spinosa的ITS序列堿基的主要變化是堿基的缺失，堿基的轉換主要出現(xiàn)在G-C間，堿基的顛換主要出現(xiàn)在G-T間，而與分布區(qū)間并沒有表現(xiàn)出相關聯(lián)系。整個ITS區(qū)變異位點與簡約信息位點分別占總位點的3.53%和0.80%。

3.3 樣品間遺傳距離分析

G.spinosa各樣品間的遺傳距離在0.0 018～0.008 9之間（表4），其中GSNE1與GSWA8、GSNE2與GSUT4、GSUT3與GSUT4、GSUT4與GSCA5、GSUT4與GSCA6間的遺傳距離最小均為0.001 8。GSCO7與GSWA8 間的遺傳距離最大，為0.008 9。外類群與G. spinosa各樣品間的遺傳距離均較G. spinosa各樣品間的遺傳距離大，在0.010 7～0.081 5之間。GSNE1與GBCO9間的遺傳距離相對較小，為0.010 7，GSWA8與CFCA12間的遺傳距離最大為0.081 5。對不同產地G. spinosa地理距離和遺傳距離的Mantel檢驗表明，來自不同地區(qū)G. spinosa各樣品間的遺傳距離與地理距離的相關性不顯著（R2=0.325，P=0.359）。

3.4 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

鄰接法構建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖2，各分支的支持率均達到50以上。8個G. spinosa樣品聚為一支，支持率為93，并與同屬的GBCO9為姊妹群關系。其中，GSUT3，GSUT4，GSCA5，GSCA6，GSCO7與GSNE2聚為一支，GSNE1與GSWA8聚為一支，但均分布于內華達地區(qū)的GSNE1與GSNE2卻分屬于這兩支。由此可見，分布在同一地區(qū)的G. spinosa并未表現(xiàn)出更近的親緣關系。

由于GSCA6未提交完整ITS2序列，且GSCO7與GSWA8（GSCO7和GSWA8的5.8S區(qū)出現(xiàn)了堿基的缺失與轉換）可能存在假基因，因此我們僅以ITS1區(qū)序列重新構建了鄰接樹（圖3）。結果與基于ITS全序列構建的鄰接樹的分支結構相同，不同僅表現(xiàn)在支持率較低、分支長度較短。

3.5 ITS序列RNA二級結構預測

利用在線軟件RNAfold對美國西部不同分布區(qū)G. spinosa ITS的RNA二級結構進行了預測（圖4）。ITS1區(qū)與ITS2區(qū)均含有封閉的環(huán)狀結構，8個G. spinosa ITS序列的RNA二級結構依它們的相似狀況大體上可以分為四類，分別記為type A，B，C和D。GSNE1、GSNE2與GSUT3三者的RNA二級結構的構象相似記為type A。

RNA二級結構構象相似的GSUT4和GSCA6記為type B，他們在5.8S區(qū)與ITS2區(qū)均出現(xiàn)了差異，且GSCA6的最小自由能更低，推測與GSCA6 ITS序列的缺失有關。GSCA5與GSWA8（type C）的構象相似，主要差異出現(xiàn)在ITS1區(qū)，由于GSWA8的最小自由能較GSCA5的高，因此推測GSCA5較GSWA8的RNA二級結構穩(wěn)定。GSCO7（type D）在ITS1區(qū)出現(xiàn)了兩個封閉的環(huán)，其RNA二級結構均不同于以上三類構象，在ITS1區(qū)出現(xiàn)了兩個封閉的環(huán)?？傮w而言，G. spinosa ITS序列RNA 二級結構在ITS1，ITS2區(qū)以及5.8S區(qū)均出現(xiàn)了差異。雖然8個G. spinosa ITS樣品彼此間RNA二級結構的相似性狀況與一級結構的并不相同，但同樣與其地理分布區(qū)間沒有體現(xiàn)出一定的相關性。

4 討論

ITS序列是近年來用于探討植物近緣屬間、種間系統(tǒng)關系和種內變異的重要分子標記。被子植物的ITS區(qū)長度比較穩(wěn)定，包括5.8S rDNA在內，總長度為600～700 bp。該研究序列分析結果顯示，8個G. spinosa ITS序列的長度僅GSNE1為623 bp，其余均為622 bp，符合被子植物ITS序列長度的變化范圍。G. spinosa ITS1區(qū)序列長度保守，除GSNE1為223 bp外，其余均為222 bp，ITS序列長度的主要變化出現(xiàn)在ITS2區(qū)，多數(shù)樣品5.8S區(qū)長度為164 bp，但是GSWA8為161 bp。Baldwin（1992）最早對被子植物ITS序列假基因的研究表明：被子植物5.8 S序列一般長度都在163～164 bp之間，若出現(xiàn)了插入或缺失就有可能形成假基因（人們把含有不具編碼功能5.8S區(qū)ITS序列定義為ITS假基因）。G. spinosa ITS序列包括22個變異位點，說明ITS序列在G. spinosa系統(tǒng)發(fā)育關系分析中能夠提供足夠的證據(jù)。5.8S區(qū)最為保守，無簡約信息位點，變異位點少。從ITS序列的變異位點來看，G. spinosa共有22個變異位點，這些變異位點主要存在于ITS2區(qū)，包含14個變異位點，占總變異位點數(shù)的63.63%，ITS1區(qū)僅有5個變異位點，5.8S區(qū)最為保守，含3個變異位點，無簡約信息位點，因此僅以ITS1區(qū)構建系統(tǒng)發(fā)育樹并不能提供足夠信息量。屈良鵠和陳月琴（1999）通過對不同生物類群的ITS序列的比較得出：被子植物大多數(shù)科屬ITS序列的種間差異值為1.2%～10.2%，曾明等（2003）和車建等（2007）在利用ITS序列分別對葛根和西紅花正偽品的鑒定中均認為ITS序列種內差異值小于1%。該研究測得5個地區(qū)的8個G. spinosa樣品在ITS區(qū)的堿基差異為3.53 %，表現(xiàn)出較大的遺傳分化。同樣，在對同一地區(qū)的G. spinosa樣品系統(tǒng)發(fā)育分析中得出分布在內華達的GSNE1與GSNE2、猶他州的GSUT3與GSUT4以及分布在加利福利亞的GSCA5與GSCA6，相互間的遺傳距離除GSUT3與GSUT4外，其余并非最小，采用鄰接法構建的系統(tǒng)發(fā)育樹，顯示出同一地區(qū)的GSNE1與GSNE2也未聚在一起。這與地理距離與遺傳距離Mantel檢驗的結果相吻合。

由于RNA二級結構比一級結構更具保守性，因此可以通過二級結構反映一級結構所反映不出的生物信息。該研究對8個G. spinosa樣品的ITS序列RNA二級結構進行了比較，發(fā)現(xiàn)主要差異出現(xiàn)在ITS1區(qū)和ITS2區(qū)，這與ITS序列一級結構分析中其主要的變異位于ITS1區(qū)和ITS2區(qū)的結論相一致。

但是，有研究表明多數(shù)真核生物中ITS1區(qū)的RNA二級結構具有較高保守性（Musters et al，1990），并且3′端無論是在ITS序列一級結構還是其RNA二級結構中都比5′端更保守。而在我們的研究中對8個G. spinosa樣品的ITS序列RNA二級結構的比較中發(fā)現(xiàn)僅GSUT4與GSCA6的ITS2區(qū)的RNA二級結構與其他6個樣品較大的不同，較ITS1區(qū)RNA二級結構更為保守，這與ITS2區(qū)在進化中所受的選擇壓力較高有關。該研究對ITS序列一級結構與其RNA二級結構的分析還發(fā)現(xiàn)，在ITS序列一級結構系統(tǒng)發(fā)育分析中GSNE1與GSWA8體現(xiàn)出更近的親緣關系，但是二者的RNA二級結構差異明顯，分屬于2個不同的類型中，同時GSNE2，GSUT3，GSUT4，GSCA5，GSCA6，GSCO7在ITS序列一級結構分析中也體現(xiàn)了較近的親緣關系，但是在它們的RNA二級結構分析中發(fā)現(xiàn)，GSNE2卻與在一級結構分析中處在另一分支上的GSNE1的RNA二級結構基本一致，相似的情況也出現(xiàn)在GSWA8與GSCA5之間。研究發(fā)現(xiàn)突變位點若位于莖區(qū)，則有可能使二級結構改變，若突變發(fā)生在環(huán)上或自由基則對二級結構的影響不大，這可能與環(huán)狀結構與維持RNA的功能有關。比較該研究中 8個G. spinosa樣品ITS一級結構的突變位點僅ITS1區(qū)的位點88、103、111，ITS2區(qū)的位點621、622位于莖區(qū)，其余均位于環(huán)上，則對其二級結構的影響不大。總之，G. spinosa樣品ITS一級結構與其RNA二級結構的變化并未表現(xiàn)出完美的一一對應關系，RNA二級結構體現(xiàn)出了更高的保守性。

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