張圣新 羅盼盼 鮑恩東 尚斌 王冉 魏瑞成

摘要：通過水培試驗，對畜牧業(yè)中廣泛使用的典型獸藥強力霉素，開展了4種葉菜（綠羅莎、苦苣、綠箭和綠直立）的吸附富集特征及去除規(guī)律研究，評價抗生素環(huán)境污染的植物修復(fù)能力。結(jié)果表明：強力霉素在有蔬菜種植的培養(yǎng)液中降解速度明顯快于無蔬菜種植的培養(yǎng)液，空白對照組中去除率37.8%，而在葉菜處理組中去除率超過95%，在空白對照培養(yǎng)液以及綠羅莎、苦苣、綠箭和綠直立的培養(yǎng)液中強力霉素去除半衰期分別為22.1d、1.4d、1.5d、2.3d和2.8d，與空白對照相比差異極顯著（P<0.01）;在吸收富集能力上，綠羅莎和苦苣莖葉部分對強力霉素具有較強的累積作用，富集系數(shù)分別為7.20和4.95，而綠箭和綠直立的富集系數(shù)分別為0.76和0.49，累積作用相對較弱。說明富集能力較強的蔬菜作物可作為降低抗生素環(huán)境污染的備選植物。

關(guān)鍵詞：強力霉素;富集：植物修復(fù)

中圖分類號：X592

文獻標識碼： A

文章編號： 1000-4440（2018） 05-1066-06

在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中，獸藥抗生素在提高生產(chǎn)能力等方面發(fā)揮了重要作用，中國每年獸藥使用量大概占全球消耗量的25%左右。據(jù)報道，動物采食飼用抗生素后，約有30%～ 90%獸藥以母體或代謝物的形式經(jīng)動物糞尿等排泄物排出。目前，中國尚未制定動物糞便和土壤中抗生素相關(guān)污染標準.糞肥的施用引起抗生素在環(huán)境介質(zhì)及食物鏈中遷移累積。研究發(fā)現(xiàn)，規(guī)模化養(yǎng)殖場畜禽糞污中和農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)地土壤中可檢測到四環(huán)素類、磺胺類、喹諾酮類等多種抗生素藥物。環(huán)境中抗生素對作物生長具有毒性效應(yīng)，會誘導(dǎo)處于長期選擇壓下的病原菌產(chǎn)生抗性，長期攝入受到污染的產(chǎn)品可能對易感人群產(chǎn)生不良反應(yīng)。

強力霉素（Doxycycline，DOX）為四環(huán)素類抗生素，在養(yǎng)殖場廣泛使用，四環(huán)素類抗生素對土壤有較強的吸附力，在環(huán)境中不易降解等。通過超富集作物品種吸收進行植物修復(fù)，或者通過充分利用低積累作物品種的種植來減少土壤污染從而生產(chǎn)安全食品，利用超富集作物品種修復(fù)污染土壤是當前較為經(jīng)濟有效的環(huán)境中抗生素污染的修復(fù)手段。在富集植物的篩選中，水培試驗是理想的手段，雖然液體中植物根部對抗生素的吸收量相對于土壤環(huán)境下較高，但是水培方法周期短和環(huán)境條件可操控，能充分排除干擾因素并快速篩選出富集植物。

本試驗以強力霉素為研究對象，考察4種葉菜品種在水培條件下對強力霉素的富集特征，比較不同植物對強力霉素的吸收量和富集系數(shù)的變化，研究強力霉素在培養(yǎng)溶液中的去除規(guī)律，為科學(xué)認識蔬菜中抗生素殘留風險以及抗生素污染土壤的植物修復(fù)技術(shù)應(yīng)用提供參考和借鑒。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選擇綠羅莎、苦苣、綠直立和綠箭4種蔬菜品種為試驗對象。強力霉素標準品（純度≥97.0%）購自Dr.Ehrenstorfer公司，甲醇和乙腈（色譜純）購自Te-dia公司，乙二胺四乙酸二鈉、檸檬酸、磷酸氫二鈉、鹽酸、氫氧化鈉、乙二酸、硝酸鈣、硝酸鉀、乙二胺四乙酸二鈉鐵、磷酸二氫鉀、磷酸二氫銨、硫酸鎂、硼酸、硫酸鋅、硫酸銅、硫酸錳和鉬酸銨均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 儀器設(shè)備

三重四極桿質(zhì)譜儀（Agilent 6410，配ESI源）、高效液相色譜儀（Agilent1200S）為Agilent公司產(chǎn)品，分析天平（AL204）和pH計（320）為梅特勒一托利多儀器有限公司產(chǎn)品，高速離心機（Eppendorf）為德國Eppendorf公司產(chǎn)品，氮吹儀（N-EVAPTM112）為美國Organomation公司產(chǎn)品，固相萃取裝置為美國Supelco公司產(chǎn)品，HLB固相萃取柱（200mg，6ml）為美國Waters公司。

1.3 營養(yǎng)液配制和預(yù)培養(yǎng)

水培營養(yǎng)液由營養(yǎng)液A和營養(yǎng)液B組成，使用前按照等比例混合。營養(yǎng)液A成分為：硝酸鈣413.300mg/L、硝酸鉀404.400mg/L和乙二胺四乙酸二鈉鐵40.000 mg/L;營養(yǎng)液B成分為：磷酸二氫鉀68.000mg/L、磷酸二氫銨32.000mg/L、硫酸鎂246.000 mg/L、硼酸2.000mg/L、硫酸鋅0.430mg/L、硫酸銅1.360mg/L、硫酸錳0.100mg/L和鉬酸銨0.034 mg/L。

在蔬菜收割前20 d，將移栽的蔬菜苗定植于黑色塑料試驗盆內(nèi)，每盆4株。試驗設(shè)置5個處理組，第1組為含有20 mg/L強力霉素的空白對照組，第2至第5組分別為種植綠羅莎、苦苣、綠直立和綠箭的處理組。加入營養(yǎng)液后在溫室中預(yù)培養(yǎng)3d，日光燈補充光照，光暗比為12 h∶12 h，晝夜溫差10℃。培養(yǎng)過程中補充營養(yǎng)液并記錄用量。

1.4樣品采集和強力霉素含量測定

試驗時向每個試驗盆內(nèi)加入一定濃度和體積的強力霉素儲備溶液，使培養(yǎng)液中強力霉素質(zhì)量濃度為20mg/L。分別在試驗的第Od、ld、2d、3d、4d、Sd、7d、9d、11d、13d、15d對不同試驗組植株和培養(yǎng)液取樣，將去除根部的植株用蒸餾水沖洗，晾干后用粉碎待測。

準確稱取樣品5.0g至50ml離心管中，加入20ml甲醇和0.1mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液（pH=6.0），漩渦30 s，振蕩10 min，超聲波處理20min，10000 r/min離心5min，移取上清液至另一離心管中，重復(fù)提取2次，合并上清液，于40℃下氮氣吹至5—10 ml，加0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液（pH=6.0）稀釋至30—50 ml，備用。將HLB固相萃取柱依次用6ml甲醇、6ml 0.1 mol/LNa2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液（pH=4.0）活化，將上述提取液過柱，流速≤3 ml/min，用10 ml水淋洗，抽干。8ml甲醇洗脫，收集洗脫液，于40 ℃下氮氣吹干，加人流動相1.0 ml溶解殘余物，超聲波處理2min，混勻后過0.22μm尼龍濾膜，待儀器測定。

測定參數(shù)：C18柱色譜柱（2.1mmX100.0mm），流速為0.30ml/min.流動相為甲醇和0.1%甲酸溶液（體積比60∶40）;電噴霧離子源正離子模式，噴霧電壓為4.0 kV，氣體溫度為350℃，氣體流速為12L/min.強力霉素的特征離子對為m/z 445>428（定量離子），m/z 445>410以及m/z 445 >154。測定時為了減少基質(zhì)效應(yīng)干擾，植株樣品的標準曲線用無抗生素處理的植株提取溶液配制，培養(yǎng)液樣品的標準曲線用營養(yǎng)液作為背景溶液配制。強力霉素在葉菜樣品中平均回收率72.16%～ 88.64%，日內(nèi)相對標準偏差為3.51%～6.87%，日間相對標準偏差為1.44%～1.82%，方法滿足試驗研究要求。

1.5 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 16.0軟件進行Duncan's差異性統(tǒng)計分析。富集系數(shù)計算（Bioconcentration fac-tor，BCF）公式為BCF=C植株/C培養(yǎng)液，式中，C植株和C培養(yǎng)液分別為植株中強力霉素含量和培養(yǎng)液中強力霉素質(zhì)量濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 水培葉菜對強力霉素的吸收轉(zhuǎn)移

4種供試葉菜對強力霉素具有相似的吸收與轉(zhuǎn)移規(guī)律（圖1）。在處理后7d，4種蔬菜的莖和葉中強力霉素含量快速上升，在第5～7d達到最大吸收值，隨后隨著暴露時間延長含量急劇下降。綠羅莎莖和葉中強力霉素含量在處理后5d達到最大值（20.60 mg/kg）。在處理后24h，強力霉素在綠羅莎莖、葉中的含量為2.59 mg/kg，在處理結(jié)束時（15d），綠羅莎莖、葉中的含量為6. 18 mg/kg，分別是其最大吸收量的12.6%和30.0%?？嘬?、綠直立和綠箭莖、葉中強力霉素含量均在處理后7d達到最大值，分別為10.40mg/kg、1.79mg/kg和3.54mg/kg。在處理后24h，苦苣、綠直立和綠箭莖、葉中強力霉素的含量分別為1.83mg/kg、0.60mg/kg和0.31mg/kg，分別是最大吸收量的17.6%、33.6%和8.9%。處理后15 d，苦苣、綠直立和綠箭莖、葉中強力霉素的含量分別為4.07mg/kg、0.39mg/kg和0.81mg/kg，分別是其最大吸收量的39.1%、21.7%和23.0%。

盡管4種供試葉菜對強力霉素的吸收和轉(zhuǎn)移具有相似的規(guī)律，但在達到對強力霉素最大吸收值所需要的時間和最大吸收量等方面仍然存在差別。通過比較發(fā)現(xiàn)，強力霉素在綠羅莎莖、葉中的含量是其在苦苣、綠箭和綠直立莖、葉中含量的2倍、6倍和11倍，強力霉素在苦苣莖、葉中的含量是其在綠箭和綠直立莖、葉中含量的3倍和6倍。說明4種葉菜對強力霉素的吸收能力具有很大差異，在同一處理質(zhì)量濃度下，綠羅莎富集能力最大，其次是苦苣，它們與其他2種蔬菜相比較差異均極顯著（P<0.01），綠箭和綠直立之間富集能力差異不顯著，4種葉菜對強力霉素的吸收富集能力高低順序為：綠羅莎>苦苣>綠箭>綠直立。

2.2 不同處理時間下4種葉菜培養(yǎng)液中強力霉素質(zhì)量濃度的變化

在不同處理時間下培養(yǎng)液中強力霉素質(zhì)量濃度變化如圖2所示。強力霉素在4種葉菜培養(yǎng)液中具有相似的去除規(guī)律，在空白對照組（無蔬菜植株）的培養(yǎng)液中去除最慢，在綠直立和綠箭的培養(yǎng)液中的去除速度比對照組快，在綠羅莎和苦苣培養(yǎng)液中去除速度最快。處理后ld，綠羅莎和苦苣的培養(yǎng)液中強力霉素去除率為53%—59%，綠箭和綠直立的培養(yǎng)液中強力霉素去除率為48%左右，與初始濃度相比差異均顯著（P<0.01），而空白對照組去除率僅為2.3%，與初始濃度相比差異不顯著，說明綠羅莎、苦苣、綠直立和綠箭植株對強力霉素均有較強的吸收和富集能力。

在處理15d后，強力霉素在空白對照培養(yǎng)液中去除了37.8%，在4種葉菜培養(yǎng)液中去除率超過95.0%，與對照組比較差異極顯著（P<0.01）。強力霉素在空白對照、綠羅莎、苦苣、綠箭和綠直立的培養(yǎng)液中的去除半衰期分別為22.1d、1.4d、1.5d、2.3d和2.8d（表1）。

2.3 水培葉菜對強力霉素的富集系數(shù)

綠羅莎、苦苣、綠箭和綠直立4種葉菜莖和葉對強力霉素的富集系數(shù)分別為7.20、4.95、0.76、0.49。富集能力大小依次為綠羅莎>苦苣>綠箭>綠直立。綠羅莎和苦苣對強力霉素的富集系數(shù)均大于l，說明這2種葉菜對強力霉素的吸收富集能力較強，屬于超富集作物，而綠箭和綠直立對強力霉素的富集系數(shù)均小于1。說明對強力霉素的吸收和累積大小與植物種類有關(guān)，這與已經(jīng)報道的四環(huán)類抗生素在植物中吸收特征相一致。

3 討論

本研究結(jié)果表明，在短時間內(nèi)4種葉菜對強力霉素具有相似的吸收和轉(zhuǎn)移的規(guī)律，但是由于植物對抗生素等有機污染物的吸收轉(zhuǎn)移能力，與植物和有機污染物的特性以及環(huán)境污染強度等因素有顯著相關(guān)性，所以4種蔬菜的富集能力表現(xiàn)出明顯差異，在同一處理質(zhì)量濃度下，吸收富集能力高低順序為：綠羅莎>苦苣>綠箭>綠直立。許多文獻也報道，不同種類的水生植物對介質(zhì)中抗生素的吸收效率存在差異。崔馨等采用水培法研究了生菜對土霉素的吸收效果，發(fā)現(xiàn)生菜對土霉素的吸收量與營養(yǎng)液中土霉素質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。Lu等研究發(fā)現(xiàn)鳳眼蓮根系與水體接觸12 h后，對水體中四環(huán)素的吸收率可達70%。Hijosavalsero等研究了人工濕地污水處理系統(tǒng)對強力霉素、甲氧芐啶、磺胺甲惡唑等抗生素的吸收效果，同樣發(fā)現(xiàn)不同種類的植物對抗生素吸收存在明顯差異。由此可見，通過種植合適的植物可以進行污染土壤的植物修復(fù)。

處理15d后，在4種葉菜培養(yǎng)液中強力霉素去除率超過95.0%，而在空白對照培養(yǎng)液中去除率僅37.8%，可見培養(yǎng)液中強力霉素含量減少主要是受到植物吸收的影響。Azanu等發(fā)現(xiàn)胡蘿卜和生菜能夠吸收四環(huán)素和阿莫西林，并遵循劑量效應(yīng)關(guān)系。Mwm用土霉素和泰樂菌素的發(fā)酵垃圾作為番茄肥料時發(fā)現(xiàn)其可以吸收殘留的抗生素。Dong等報道11種蔬菜在2種不同土壤中對金霉素、莫能菌素、磺胺二甲嘧啶、泰樂菌素和維及霉素存在不同程度的吸收。這些結(jié)論均與本研究一致，說明強力霉素含量的減少可能與蔬菜的生長稀釋和植物體內(nèi)代謝及組織形成無法提取的結(jié)合殘留物相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)植物對環(huán)境中污染物的吸收機制主要有2種，分別是植物的外排機制（即將大部分污染物累積在根部）和植物的積累（將根系吸收的污染物多數(shù)運輸和貯存到地上部分）。通過強力霉素在4種葉菜培養(yǎng)液中的去除試驗發(fā)現(xiàn)，處理第ld4種蔬菜對強力霉素的去除率為48%—59%，并被植物根吸附后向莖葉轉(zhuǎn)移，在試驗的5～7d，綠羅莎和苦苣莖、葉中強力霉素含量是綠箭和綠直立中的3—11倍。據(jù)報道，1.0

本試驗發(fā)現(xiàn)，葉菜綠羅莎和苦苣對培養(yǎng)液中強力霉素均有很強的吸收富集作用，富集系數(shù)分別為7.20和4.95，屬于超富集作物，而綠箭和綠直立對培養(yǎng)液中強力霉素的吸收富集能力較弱，富集系數(shù)分別為0.76和0.49，屬于低積累蔬菜作物。這些不同蔬菜之間富集系數(shù)的差異證明植物對抗生素的吸收可能取決于植物的種類，而同一株植物不同時間的吸收差異可能是由于植物不同生長階段會影響抗生素在其體內(nèi)的分布和積累。除此之外，抗生素的物理化學(xué)性質(zhì)和環(huán)境暴露都可能影響植物對抗生素的富集。因此可以利用超富集植物（例如綠羅莎和苦苣）進行污染土壤的植物修復(fù)，或者種植低積累作物品種（例如綠箭和綠直立）以保證食品安全，以及利用抗生素低積累作物品種和超富集植物間套種植對污染土壤進行修復(fù)并生產(chǎn)出較為安全的農(nóng)產(chǎn)品，以實現(xiàn)經(jīng)濟效益和生態(tài)功能的有機結(jié)合。