牛麗影 沈凌雁 劉春菊 李大婧 劉春泉 肖麗霞

摘要：為探討生鮮糯玉米汁主要揮發(fā)性成分己醛與己醇的生成與脂氧合酶（LOX）的關系，對4個籽粒發(fā)育期的鮮食糯玉米京甜紫花糯2號和蘇玉糯11號生鮮玉米汁中己醛與己醇含量、脂氧合酶活性以及ZmLOX1、Zm-LOX2、ZmLOX3、ZmLOX10基因的相對表達量進行了測定和比較。結果顯示己醛與己醇含量顯著正相關（P<0.05），4種LOX基因的表達量之間顯著正相關（P<0.05），但LOX活性與其他指標之間未表現出顯著的相關關系。主成分分析（ PCA）結果顯示所有指標聚為3類：4種LOX基因表達量、己醛與己醇含量、LOX活性，三者之間未表現出顯著的相關性關系。

關鍵詞：鮮食糯玉米;己醛;脂氧合酶（LOX;基因表達量

中圖分類號：S513.01

文獻標識碼： A

文章編號： 1000-4440（2018）05-1138-06

糯玉米為起源中國的玉米類型，作為鮮食玉米廣受消費者喜愛。鮮食糯玉米蒸煮后散發(fā)的玉米香與類似青葉、青草的清香是其重要特征之一。在鮮食糯玉米揮發(fā)性成分與香氣變化研究中發(fā)現，來自脂氧合酶（LOX）途徑的己醛和己醇為生鮮玉米汁揮發(fā)性成分的主要成分，并可能與糯玉米的青香有關。LOX途徑為LOX啟動的具異戊二烯結構的多元不飽和脂肪酸（Polyunsaturated fatty acid，PUFA）的氧化過程，植物中多以亞油酸和亞麻酸為底物，在LOX作用下生成9-氫過氧化物（9-HPOT）和13-氫過氧化物（13-HPOT），然后由氫過氧化物裂解酶（HPL）作用生成的C6醛和C9醛，并在乙醇脫氫酶（ADH）的作用下生成相應的醇。其中C6的醛、醇、酮以及衍生的酯類被稱為青葉揮發(fā)性成分（Green leaf volatile， GLV）。GLV在植物生理研究中被作為抗逆反應的標志性成分，在番茄、黃瓜或柑橘中為新鮮香氣的表征成分，在豆類、速凍玉米、水稻等谷物中則與油脂氧化味等不良風味相關。

從基因水平研究LOX途徑及風味調控是近年來的趨勢。LOX是一個大基因家族，每種植物中都會有多個LOX同工酶，在番茄、蘋果等植物中只有某特定的LOX同工酶調控GLV的生成。目前已知玉米中有13種LOX，ZmLOX1基因存在于成熟籽粒中，具有9-LOX和13-LOX的非傳統(tǒng)型雙位點特異性;ZmLOX2基因在玉米生長發(fā)育過程中表達.ZmLOX3存在于玉米植株的根部以及發(fā)育的胚中;ZmLOX10位于葉綠體中，主要調節(jié)GLV的生成。在對鮮食糯玉米LOX酶特性研究中發(fā)現，鮮食糯玉米中至少存在2種LOX同工酶，并且生鮮糯玉米汁的GLV則主要為己醛與己醇。為了在基因表達水平上探討鮮食糯玉米中GLV生成和香氣變化機制，本研究對2個品種4個發(fā)育期的鮮食糯玉米中己醛和己醇含量、LOX酶活性以及Zm-LOX1、ZmLOX2、ZmLOX3、Zm LOX10的相對基因表達量之間的相關性進行分析，為鮮食糯玉米香氣的調控提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

糯玉米京甜紫花糯2號（JT）、蘇玉糯11號（SY）均采自江蘇省農業(yè)科學院六合動物科學基地試驗田。2種糯玉米于授粉后14d、19d、25d、31d進行采收，分別對應于籽粒建成期、乳熟前期、乳熟后期和蠟熟期，記為JT1—4和SY1～4。采收當日手工去除苞葉，分離完整玉米籽粒，液氮速凍后真空包裝，置于-80℃冰箱待用。

1.2 主要儀器和試劑

Agilent 7890A/5975C氣相色譜質譜聯用儀，美國Agilent公司產品;CAR/PDMS/DVB固相微萃取萃取頭，美國supelco公司產品;HP-INNOWAX毛細管色譜柱，美國Agilent公司產品;熒光定量PCR儀，美國Roche公司產品。Trizol試劑盒，美國Gibco公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 己醛、己醇含量的測定冷凍玉米粒10g加入40ml 4℃預冷的蒸餾水，迅速研磨，用5ml水轉移至均質儀進行均質后定容到50ml，取5ml于15ml頂空瓶中并加入攪拌子及1.6g NaCl，密封后40℃水浴平衡15min，插入萃取頭（CAR/PDMS/DVB），使之與液面保持1.5cm的距離，加入攪拌子置于磁力攪拌器上，攪拌速度200 r/min，在40℃下萃取15min。色譜條件：色譜柱為HP-INNOWAX（30mx0.32mmx0.25μm）分析柱;升溫程序為：起初溫度40℃保持2 min，然后5μ/min升溫至220cC，進樣口溫度250℃，解析2min，采用不分流進樣;載氣：He。質譜條件：離子源溫度230℃，傳輸線溫度為150℃，電離化方式為EI、電子能量70eV，質量掃描范圍m/z 30～ 450，掃描速率為5.27scan/s，溶劑延遲l min。定量方法采用外標法，首先用色譜純甲醇配置1mg/ml的貯備液，再稀釋為0.2～200.0 mg/L的測定液，建立待測組分標準品的峰面積與對應質量濃度的標準曲線。

1.3.2 LOX活性的測定同牛麗影等的方法 。

1.3.3 實時熒光定量PCR測定LOX基因表達量使用Trizol試劑盒提取樣品總RNA，用隨機引物將RNA反轉錄成cDN。反轉錄反應條件為25℃10 min，42℃30 min.85℃5 min。根據基因序列設計特異性引物，通過實時熒光定量PCR方法，采用SYBR GREEN染料法，以GA PDH為內參基因，測定LOX基因表達量，以乳熟期甜玉米晶甜3號為對照。引物序列見表l。PCR反應條件為：94℃30s;94℃10s，60℃12s，72℃30s，循環(huán)45次，72℃單點檢測信號。采用2-？？法對結果進行相對定量分析。

1.4 數據分析

采用JMP（JMP 10.0，SAS Institute Inc.）進行單因素方差分析（ANOVA）和主成分分析（PCA）。各指標重復測定3次，結果以平均值±標準差表示。采用單因素方差分析（ANOVA） Tukey HSD進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同采收期兩種鮮食糯玉米中己醛和己醇含量比較

4個采收期兩種鮮食糯玉米京甜紫花糯2號（JT）和蘇玉糯11號（SY）中己醛含量為6.00～59.90μg/kg，己醇含量為0.11～8.29μg/kg。兩種糯玉米的己醛均在籽粒建成期含量最高，在乳熟期含量最低，到蠟熟期略有回升，但蠟熟期蘇玉糯11號的己醛含量與乳熟前期和乳熟后期京甜紫花糯2號差異未達顯著水平（圖1）。JT的己醇含量隨籽粒發(fā)育期的延長而呈降低趨勢，而SY的己醇含量變化不顯著。

2.2 兩種鮮食糯玉米脂氧合酶（LOX）活性比較

LOX活性測定結果（圖2）顯示，兩種糯玉米京甜紫花糯2號（JT）和蘇玉糯11號（SY） LOX活性均隨籽粒發(fā)育期延長呈現直線上升趨勢（R2=0.980 6、R2= 0.9978），在4個發(fā)育期兩種玉米的LOX活性并未表現出顯著差異（P>0.05）。

2.3 兩種鮮食糯玉米ZmLOX1、Zm LOX2、Zm-LOX3、ZmLOX10基因表達量差異

京甜紫花糯2號的4種LOX基因表達量在發(fā)育過程中變化趨勢一致，均為籽粒建成期≤乳熟后期≤乳熟前期<蠟熟期（圖3）。蘇玉糯11號的變化趨勢與京甜紫花糯2號不同，京甜紫花糯2號的4種LOX基因表達量均為蠟熟期最高，而蘇玉糯11號中ZmLOX3在乳熟后期表達量最高。另外，蘇玉糯11號ZmLOX1、ZmLOX2、ZmLOX10的表達量在4個時期均等于甚至低于京甜紫花糯2號籽粒建成期的最低值。2種玉米差異較大的為乳熟前期和蠟熟期，乳熟前期京甜紫花糯2號的ZmLOX2和Zm-LOX3基因表達量分別為蘇玉糯11號的117.25和4.92倍，蠟熟期京甜紫花糯2號的ZmLOX3基因表達量為蘇玉糯11號的5.54倍。另外，與GLV相關的ZmLOX10基因表達量京甜紫花糯2號大于蘇玉糯11號，對應4個發(fā)育期京甜紫花糯2號的基因表達量分別為蘇玉糯11號的2.56、92.96、10.52和45.15倍。

2.4玉米己醇和己醛含量與LOX活性、LOX基因表達量的相關性分析

己醛和己醇是生鮮玉米汁中最主要的揮發(fā)性成分。通過調節(jié)pH以及加熱等方法抑制LOX的活性可以減少二者的生成，說明LOX途徑是二者生成的主要途徑。相關性分析結果（表2）顯示，己醛含量與己醇含量之間以及4種LOX基因表達量之間呈顯著正相關關系。己醇含量與己醛含量呈顯著正相關，說明生成的己醛越多，才能生成更多的己醇，但是二者的量與LOX活性、LOX基因表達量的相關性不顯著。

主成分分析（PCA）結果（圖4）表明，主成分l與主成分2可解釋總方差的87. 0%。從圖4中可以看出己醛與己醇含量、4種ZmLOX基因分別在第1象限和第2象限聚集。而樣品與指標在空間上的接近則表明此樣品在此指標上具有突出的特征，例如籽粒建成期的京甜紫花糯2號己醛與己醇含量最高，蠟熟期的京甜紫花糯2號ZmLOX基因表達量最高。

3 討論

不同植物的LOX代謝機制存在差別。本研究中京甜紫花糯2號和蘇玉糯11號2種糯玉米之間也存在顯著差異，例如在乳熟后期京甜紫花糯2號ZmLOX1、ZmLOX2、ZmLOX10基因表達量均高于蘇玉糯11號，在籽粒建成期和蠟熟期京甜紫花糯2號的己醛和己醇含量也高于蘇玉糯11號。京甜紫花糯2號和蘇玉糯11號糯玉米在發(fā)育過程中GLV的生成量和LOX活性存在顯著變化，但是與LOX基因表達量隨生長期的變化并不一致，未表現為顯著的相關性關系。獼猴桃中隨果實發(fā)育階段的延長，6種LOX基因表達量不同.AdLOX1和AdLOX5在成熟期間上調，而AdLOX2、AdLOX3、AdLOX4和AdLOX6則下調。番茄中TomLOXC基因只有在成熟時才被檢測到，被認為是C6醛醇生成的功能基因。ZmLOX10在玉米植株受到傷害時表達量迅速增加，促進GLV的產生。但在本研究中，在糯玉米籽粒建成期己醛與己醇含量最高，但籽粒發(fā)育后期ZmLOX10表達量最高，二者的變化并不一致。陳巧等研究發(fā)現黃瓜GLV含量與LOX基因表達間也未呈現顯著相關性，而且黃瓜中Cs LOX2基因表達高峰的出現先于LOX活性高峰。但是，Zhang等發(fā)現桃成熟過程中GLV含量與PpLOX一2、PpLOX一3、PpHPL-1和PpADHl-3等基因表達水平存在一致的變化趨勢。Boukobza等發(fā)現添加外源亞油酸/亞麻酸可以增加番茄GLV的生成，但是添加LOX或者乙醇脫氫酶（ADH）都不能影響GLV的生成。在氫過氧化物裂解酶（HPL）過度表達的番茄中，揮發(fā)性短鏈醛醇的量幾乎沒有改變。這些結果說明在番茄中GLV含量并不取決于LOX途徑中酶的基因表達量以及酶的活性。鮮食玉米中LOX活性與C6醛醇含量之間的相關性不顯著，而與亞油酸含量顯著相關。谷物（如水稻、玉米）種子中LOX基因表達量與病原菌入侵引發(fā)的抗逆機制以及發(fā)芽時的生理變化有關。LOX雖然是催化脂肪氧化的酶，但是在谷物中有水的情況下會加速反應。鮮食糯玉米作為發(fā)育中的谷物種子，水分含量與果蔬接近，在蒸煮.制汁等條件下LOX作用的微環(huán)境和生化機制，及其對產品新鮮風味的影響仍待進一步研究。