王海燕 楊金龍 谷山林 王小燕 王介平 周嬋 呂金鳳 曾秀

摘要： 桑葉是藥食兩用植物資源，桑葉槲皮素是其主要的黃酮類化合物，具有廣泛生理活性。為了更深入研究桑葉槲皮素活性作用，文章對桑葉槲皮素抗氧化性展開研究，采用大孔樹脂法對桑葉槲皮素提取物進行純化，并對其抗氧化活性進行研究。結(jié)果表明：在還原力、清除DPPH方面桑葉槲皮素純化物較槲皮素粗提取作用較好；在清除超氧陰離子作用方面，低濃度時粗提物優(yōu)于純化物，高濃度時純化物優(yōu)于粗提物；在清除羥基自由基作用時，粗提物則表現(xiàn)比純化物較強的清除作用。

關(guān)鍵詞： 桑葉；大孔樹脂法；槲皮素；抗氧化性；抗壞血酸

中圖分類號： TS195.644文獻標志碼： A文章編號： 1001-7003（2018）03-0015-06引用頁碼： 031103

Abstract： The mulberry leaf is a kind of medicinal and edible plant leaves. Quercetin is the main flavonoids in mulberry leaves， with a wide range of physiological activity. In order to study the activity of quercetin in mulberry leaves， this paper studies the antioxidant activity of quercetin in mulberry leaves. The quercetin extract from mulberry leaves was purified by macroporous resin method， and its antioxidant activity was studied. The results showed that the crude extract of mulberry leaf quercetin was less than purified product in reducing power and eliminating the DPPH； and the crude extract was superior to the purified product in the removal of superoxide anion when the concertration is low， high concentration of the purification was better than the crude extract； in the removal of hydroxyl radicals， the crude extract was better than the purification of the role of purification.

Key words： mulberry leaves； macroporous resin method； quercetin； antioxidant activity； ascorbic acid

中國是栽桑大國，擁有豐富的桑葉資源，隨著養(yǎng)蠶業(yè)的縮減，大量桑園處于荒廢狀態(tài)，造成桑葉的浪費，多元化利用桑葉資源對穩(wěn)定蠶桑產(chǎn)業(yè)具有重要作用。桑葉因其含有豐富的黃酮、生物堿、多糖等活性成分[1-2]，在降血糖、降血脂、抗衰老、預(yù)防心腦血管疾病、提高免疫力等方面呈現(xiàn)較好作用[3-10]。研究顯示，桑葉所具有的功能作用與黃酮類活性物質(zhì)的抗氧化性關(guān)系密切[11-15]。槲皮素是桑葉中主要黃酮醇化合物，抗氧化活性較強，大量文獻報道槲皮素抗腫瘤、抑制血小板凝結(jié)、抗粥樣動脈硬化、抑制胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌轉(zhuǎn)移等方面效果顯著[16-19]。深入開發(fā)桑葉槲皮素活性成分資源，對天然藥物的開發(fā)和桑葉資源的高效利用具有重要意義。

目前關(guān)于桑葉槲皮素的研究主要集中在檢測方法的研究[20-21]，槲皮素的分離純化及抗氧化活性測定方面報道較少。因此，本研究采用大孔樹脂法進一步對桑葉粗提物進行分離純化，以提高槲皮素的含量，并比較其抗氧化活性，為桑葉槲皮素的進一步開發(fā)利用提供可靠依據(jù)。

1材料與設(shè)備

1.1材料與試劑

桑葉（重慶市畜牧科學(xué)院蠶業(yè)研究所），槲皮素標準品（中國食品藥品檢定研究院），DPPH（東京化成工業(yè)株式會社），AB-8大孔樹脂（南開大學(xué)），色譜純甲醇（天津四友試劑有限公司）；分析純無水乙醇、磷酸氫二鈉、氯化鈉、三氯乙酸、三羥基甲基氨基甲烷等（成都市科龍化工試劑廠）。

1.2儀器與設(shè)備

FA2004 B電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司），XMTD-4000電熱數(shù)顯恒溫水槽（上海比朗儀器有限公司），THC-10B數(shù)控超聲波提取機（濟寧天華超聲電子儀器有限公司），SHZ-DⅢ循環(huán)水式真空泵、RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），TU-1901雙光束紫外可見分光光度計（普析通用儀器有限責(zé)任公司），Agilent1260高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）。

2試驗方法

2.1桑葉槲皮素粗提物制備方法

稱取5g桑葉（60目）置于250mL提取瓶內(nèi)，加入50%乙醇12.5mL，放入超聲波提取器，在70℃下，超聲功率200W、提取0.5h。超聲波提取2次，抽濾，合并濾液，真空減壓濃縮，回收乙醇，定容至50mL，獲得桑葉槲皮素粗提物樣品，備用[22]。

2.2桑葉槲皮素檢測方法

色譜條件：高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）。檢測條件：色譜柱為Alltima C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動相為甲醇和0.2%磷酸（體積比65︰35）；檢測器紫外波長360nm；進樣量10μL；流速1.0mL/min；柱溫25℃。

2.3桑葉槲皮素純化方法

以95%乙醇浸AB-8大孔樹脂24h，再用95%乙醇淋洗，大量去離子水洗去乙醇；將AB-8大孔樹脂裝入層析柱（3cm×30cm），5%HCl溶液浸泡4h，用去離子水洗至中性；5%NaOH溶液進行堿處理，去離子水洗至中性，備用。將桑葉槲皮素粗提取物稀釋成質(zhì)量濃度為1.28mg/mL，加入至預(yù)處理好的AB-8大孔樹脂層析柱中，上樣體積100mL，過濾，收集流出液；再加入100mL60%乙醇洗脫液洗脫，洗脫流速為1mL/min，收集流出液，濃縮至干，備用[23]。

2.4抗氧化性測定

2.4.1還原力的測定

將桑葉槲皮素粗提物、純化物、抗壞血酸、槲皮素標準品配成質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL的溶液。取2.5mL樣液加入到2.5mL、pH 6.6的磷酸鹽緩沖液中，再加入1%的鐵氰化鉀溶液2.5mL，混合，在50℃水浴鍋中恒溫20min，再加入2.5mL、10%的三氯乙酸溶液，然后以3000r/min離心10min，取上清液5.0mL，并加去離子水5.0mL和0.1% FeCl3溶液1.0mL，在700nm處測定吸光度。平行試驗重復(fù)3次，同時進行空白試驗。

2.4.2抑制超氧陰離子（O-2·）活性試驗

將桑葉槲皮素粗提物、純化物、抗壞血酸、槲皮素標準品配成質(zhì)量濃度分別為2、4、6、8、10mg/mL的溶液。將4.5mL、0.05mol/L的Tris-HCl緩沖液于25℃水浴預(yù)熱20min，分別加入1.0mL不同質(zhì)量濃度的樣液和0.4mL、25mmol/L鄰苯三酚溶液，混勻，25℃水浴反應(yīng)4min，立即加入0.5mL、8mol/L的HCl終止反應(yīng)，320nm處測定吸光值，平行試驗重復(fù)3次?？瞻讓φ战M以相同體積的去離子水代替。清除率計算公式為：

式中：A0為空白液的吸光度值；A1為樣液未加鄰苯三酚的吸光度值；A2為樣液加鄰苯三酚的吸光度值。

2.4.3清除羥自由基（·OH）活性試驗

將槲皮素粗提物、純化物、抗壞血酸、槲皮素標準品配成質(zhì)量濃度分別為2、4、6、8、10mg/mL的溶液。取6.0mmol/L的FeSO4溶液、6.0mmol/L的水楊酸-乙醇溶液各2.0mL于試管中，加入樣液2.0mL，再加入6.0mmol/L的H2O2溶液2.0mL，混勻，放置10min后于510nm處測定吸光值。平行試驗重復(fù)3次，同時以去離子水做空白試驗。清除率計算公式為：

式中：A0為空白液的吸光度值；A1為樣液未加H2O2的吸光度值；A2為樣液加H2O2的吸光度值。

2.4.4清除二苯代苦味?；杂苫―PPH·）作用

將槲皮素粗提物、純化物、抗壞血酸、槲皮素標準品配成質(zhì)量濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mg/mL的溶液。分別取3.0mL不同質(zhì)量濃度的樣液于試管中，加入3.0mL、20 μg/L的DPPH·溶液，搖勻，放置30min后于517nm處測定其吸光度A2。同時測定3.0mL樣液與3.0mL溶劑混合后的吸光度A1，3.0mL溶劑與3.0mL、20μg/L的DPPH·溶液混合后的吸光度A0。平行試驗重復(fù)3次。清除率計算公式為：

式中：A0為溶劑與DPPH·溶液混合后的吸光度值，A1為待測液與溶劑混合后的吸光度值，A2為待測液與DPPH·溶液混合后的吸光度值。3結(jié)果與分析

3.1桑葉槲皮素含量測定

桑葉槲皮素粗提物和純化物的樣品利用高效液相色譜測定，主要成分是槲皮素、綠原酸、蘆丁、槲皮苷、山奈酚。桑葉槲皮素標準品和桑葉槲皮素純化物高效液相色譜圖見圖1、圖2。槲皮素標準曲線方程式：y=608.5x-626.3，R2=0.999。

在關(guān)于桑葉槲皮素研究報道中，戴開金等[20]對測定桑葉槲皮素最高含量為0.731mg/g。徐艷陽等[24]通過熒光法測定桑葉槲皮素含量為（41.92±0.11）mg/g。蔣立娣等[25]對經(jīng)酸處理后桑葉提取物中槲皮素的含量為6%。本研究通過對桑葉槲皮素粗提物進行大孔樹脂純化、濃縮，槲皮素含量顯著提高，由粗提物中（12.03±0.95）mg/g提高到（548.92±10.23）mg/g。

3.2還原力的測定

抗氧化劑清除自由基的機制主要因其具有較強的給電子能力，使不穩(wěn)定的自由基的未成對電子成對，從而失去反應(yīng)力。一般來說抗氧化劑的還原力越大，抗氧化的能力也就越強。還原能力越強，在波長為700nm下吸光值就越高。由圖3可知，桑葉槲皮素粗提物、純化物、抗壞血酸、槲皮素標準品均具有還原能力，還原力由大到小順序：抗壞血酸>槲皮素標準品>桑葉槲皮素純化物>桑葉槲皮素粗提物。在0.2～1mg/mL內(nèi)，隨著提取液質(zhì)量濃度的增加，粗提物、純化物、抗壞血酸的還原力逐漸增大，呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。在0.2～0.4mg/mL內(nèi)，槲皮素純化物的還原力增加迅速，隨后增加緩慢。在試驗濃度范圍內(nèi)抗壞血酸還原力增長趨于平穩(wěn)。槲皮素標準品隨著質(zhì)量濃度的增加，呈現(xiàn)先增加（在0.8mg/mL時達到最大），隨后有所降低。

3.3抑制超氧陰離子（O-2·）活性試驗

由圖4可知，桑葉槲皮素粗提物、純化物、抗壞血酸、槲皮素標準品均對超氧陰離子具有較強的清除作用。對超氧陰離子清除作用由大到小順序為：在2～6mg/mL時，桑葉槲皮素粗提物>桑葉槲皮素純化物>槲皮素標準品>抗壞血酸；在6～10mg/mL時，桑葉槲皮素純化物>槲皮素標準品>桑葉槲皮素粗提物>抗壞血酸。當(dāng)質(zhì)量濃度為2～6mg/mL時，各樣品間的清除作用大小為：桑葉槲皮素粗提物>桑葉槲皮素純化物>槲皮素標準品>抗壞血酸；在質(zhì)量濃度為6～8mg/mL時，桑葉槲皮素純化物和槲皮素標準品急劇增加，但是桑葉槲皮素粗提物呈下降趨勢；在質(zhì)量濃度為8～10mg/mL時，抗壞血酸的清除率仍呈現(xiàn)急劇增加，桑葉槲皮素純化物和槲皮素標準品增加呈緩慢趨勢，但是桑葉槲皮素粗提物由降轉(zhuǎn)為增加趨勢。

3.4清除羥自由基（·OH）活性試驗

在當(dāng)前所知的活性氧中，羥自由基對生物體毒性最強和危害最大。它可通過電子轉(zhuǎn)移、加成和脫氫等方式和生物體內(nèi)的多種分子反應(yīng)作用，造成大分子物質(zhì)的氧化性損傷，細胞壞死或者突變。由圖5可知，各樣品對羥基自由基都有一定的清除作用。在質(zhì)量濃度為2～10mg/mL時，桑葉槲皮素粗提物、桑葉槲皮素純化物、抗壞血酸、槲皮素標準品清除羥自由基的作用均呈現(xiàn)緩慢增加，各樣品清除羥自由基作用由大到小的順序為：抗壞血酸>槲皮素標準品>桑葉槲皮素粗提物>桑葉槲皮素純化物。與牛天羽[26]研究表明的桑葉黃酮提取物抗氧化活性低于抗壞血酸一致。

3.5清除二苯代苦味?；杂苫―PPH·）作用

DPPH（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl）是一種穩(wěn)定的有機自由基，抗氧化劑的作用主要是使DPPH的單電子被配對而呈現(xiàn)顏色變淺現(xiàn)象，且其顏色變淺的程度和配對電子數(shù)成化學(xué)計量的關(guān)系。由圖6可知，各樣品的桑葉槲皮素對DPPH自由基都有一定的清除作用。在0.2～1.0mg/mL均呈現(xiàn)隨著質(zhì)量濃度的增加對DPPH自由基的清除能力緩慢增加，清除作用由大到小為：抗壞血酸>槲皮素標準品>桑葉槲皮素純化物>桑葉槲皮素粗提物。與陳柳萌[27]研究發(fā)現(xiàn)的DPPH清除率與黃酮類成分含量成正相關(guān)結(jié)果一致。

4結(jié)論

本研究通過對桑葉槲皮素粗提物進行大孔樹脂純化、濃縮，槲皮素含量顯著提高。根據(jù)各樣品抗氧化活性測定結(jié)果可知，桑葉粗提物和純化物抗氧化活性的高低與槲皮素含量具有較大相關(guān)性。在還原力、清除DPPH方面桑葉槲皮素純化物較粗提物效果較好。在清除超氧陰離子作用方面，在2～6mg/mL濃度范圍時，粗提物優(yōu)于純化物，在6～10mg/mL濃度范圍時，純化物優(yōu)于粗提物；在清除羥基自由基作用方面，桑葉槲皮素粗提物優(yōu)于純化物。與抗壞血酸、槲皮素標準品比較，桑葉槲皮素粗提物和純化物在還原力、清除羥自由基、清除DPPH方面作用均低于兩種標準品。而在清除超氧陰離子作用時桑葉提取物卻呈現(xiàn)較好的效果，分析認為是桑葉提取物中含有的其他活性物質(zhì)協(xié)同作用清除了超氧陰離子自由基，有待后續(xù)進一步研究。

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