于雪萍 袁秀麗

摘要 目的：觀察針刺曲池穴及足三里穴對(duì)MCAO大鼠的行為學(xué)干預(yù)效應(yīng)，同時(shí)評(píng)價(jià)其對(duì)Notch信號(hào)通路標(biāo)志性蛋白的影響。方法：將36只SD大鼠隨機(jī)分成空白組、模型組及針刺組，各12只。模型組及針刺組大鼠均接受改良線栓法建立左側(cè)大腦中動(dòng)脈局灶性缺血（MCAO）再灌注模型，空白組大鼠僅進(jìn)行血管分離術(shù)，術(shù)后空白組及模型組大鼠每日接受模擬捉拿1次，針刺組大鼠予針刺曲池穴及足三里穴，連續(xù)干預(yù)14 d，用神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分評(píng)估大鼠行動(dòng)能力，TTC染色法觀察腦梗死體積變化，HE染色法觀察大鼠腦組織細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)，Western blotting法檢測(cè)各組大鼠腦組織Notch1、Hes1蛋白表達(dá)變化。結(jié)果：1）與模型組比較，針刺組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯提高，并縮小了腦梗死體積;2）針刺可明顯改善MCAO術(shù)大鼠腦組織細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu);3）Western blot結(jié)果顯示針刺可明顯上調(diào)大鼠腦組織Notch1、Hes1的蛋白水平。結(jié)論：電針曲池穴及足三里穴可改善MCAO大鼠行為能力，其作用機(jī)制可能與介導(dǎo)Notch通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞 局灶性腦缺血;針刺;曲池穴;足三里穴;Notch信號(hào)通路

Mechanism for Neuroprotection against MCAO Rats of Acupuncturing at Quchi （LI 11）

and Zusanli （ST 36） based on Notch Signaling Pathway

Yu Xueping1， Yuan Xiuli2

（1 Sichuan College of Traditional Chinese Medicine， Mianyang 621000， China; 2 Mianyang City Hospital

of Traditional Chinese Medicine， Mianyang 621000， China）

Abstract Objective：To observe the behavioral effects of acupuncture at Quchi （LI 11） and Zusanli （ST 36） acupoints on MCAO rats and to evaluate the effects on Notch signaling pathway marker proteins. Methods：A total of 36 SD rats were randomly divided into blank group， model group and acupuncture group， with 12 rats in each group. The rats in the model group and the acupuncture group received the modified suture method to establish the model of left middle cerebral artery occlusion （MCAO） reperfusion. The rats in the blank group were only subjected to vascular segmental surgery. The postoperative blank control group and model group rats were subjected to simulated catching once a day. Rats in acupuncture group were given acupuncture at Quchi and Zusanli points for continuous intervention for 14 days. Neurobehavioral scores were used to assess the ability of rats to exercise. TTC staining was used to observe changes of cerebral infarction volume. HE staining was used to observe morphology and structure of rat brain cells. The expression of Notch1 and Hes1 protein in brain tissue of each group was detected by Western blotting. Results：1） Compared with the model group， neurobehavioral score of acupuncture group was significantly increased and the volume of cerebral infarction was reduced; 2） Acupuncture significantly improved the morphology and structure of brain cells in MCAO rats; 3） Western blotting results showed that acupuncture significantly increased the protein levels of Notch1 and Hes1 in rat brain. Conclusion：Electroacupuncture at Quchi and Zusanli points can improve the behavioral abilities of MCAO rats， which may be related to the mechanism of Notch pathway.

Key Words Focal cerebral ischemia; Needling; Quchi （LI 11）; Zusanli （ST 36）; Notch signal pathway

中圖分類號(hào)：R245.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.03.037

運(yùn)動(dòng)功能障礙是缺血性腦卒中最常見(jiàn)的后遺癥，嚴(yán)重制約了患者日常生活及工作能力，大量動(dòng)物及臨床研究[1-4]均證實(shí)刺激曲池穴及足三里穴可明顯改善腦卒中的運(yùn)動(dòng)功能，但其機(jī)制尚未完全闡明。分子生物學(xué)是近年來(lái)研究針刺作用機(jī)制的熱點(diǎn)，有資料顯示Notch信號(hào)通路在腦組織缺血時(shí)可被激活，從而調(diào)控缺血后神經(jīng)的再生及修復(fù)過(guò)程，實(shí)現(xiàn)了神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)，由此，針刺曲池穴及足三里穴改善腦卒中病情的機(jī)制是否通過(guò)Notch信號(hào)通路介導(dǎo)？我們建立了MCAO大鼠模型模擬臨床缺血性腦卒中，證實(shí)電針曲池穴及足三里穴確可明顯改善MCAO大鼠的神經(jīng)行為學(xué)能力，我們亦進(jìn)行一系列分子生物學(xué)技術(shù)檢測(cè)，以期探討其作用機(jī)制，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 36只清潔級(jí)SD大鼠均購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物責(zé)任有限公司，鼠齡10～12周，平均（11.23±0.24）周，體重220～280 g，平均（250.42±4.23）g。

1.1.2 主要試劑及儀器 10%水合氯醛（青島宇龍海藻有限公司），液氮（凱福達(dá)化工有效公司），環(huán)球牌不銹鋼毫針（蘇州針灸用品有限公司）、2%TTC染色液（Solarbio公司）、Notch1一抗（CST公司）、Hes1一抗（CST公司）、-actin抗體（CST公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 1）分組：適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后對(duì)36只大鼠進(jìn)行隨機(jī)數(shù)字編號(hào)，造模后將造模大鼠隨機(jī)分為模型組及針刺組，各組均12只大鼠。3組大鼠在鼠齡、體重等方面差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），可進(jìn)行比較。2）模型制備[5]：適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后禁食不禁水12 h，稱重后使用10%水合氯醛以0.3 mL/kg比例對(duì)各組大鼠進(jìn)行充分麻醉，參照Z(yǔ)ea-Longa法進(jìn)行MCAO模型制備，將大鼠固定于手術(shù)臺(tái)上于頸部正中處切開(kāi)皮膚，左側(cè)頸總動(dòng)脈充分暴露于術(shù)者視野中，使用顯微鑷逐步分離出頸內(nèi)動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈，并于頸內(nèi)動(dòng)脈及頸外動(dòng)脈分叉口處對(duì)頸外動(dòng)脈進(jìn)行充分結(jié)扎，隨后用血管夾夾閉頸內(nèi)動(dòng)脈，在頸內(nèi)動(dòng)脈做一切口插入線栓，隨后取出血管夾至線栓插入約2.0 mm為度，隨后縫合皮膚?？瞻捉M大鼠僅進(jìn)行皮膚切開(kāi)及血管分離術(shù)后縫合皮膚。所有大鼠均注意保暖。

1.2.2 干預(yù)方法 造模次日對(duì)針刺組大鼠進(jìn)行電針曲池穴及足三里穴，穴位定位參考李忠仁主編的《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》，針刺深度達(dá)到約6 mm時(shí)接入電針儀，選用疏密波，頻率2～10 Hz，以大鼠肢體輕微抖動(dòng)為度，30 min/次，1次/d?？瞻捉M及模型組大鼠均僅接受模擬捉拿，1次/d。連續(xù)干預(yù)14 d后處死所有大鼠，并進(jìn)行取材。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 對(duì)大鼠神經(jīng)缺損癥狀進(jìn)行評(píng)估，具體如下：大鼠未出現(xiàn)任何神經(jīng)缺損癥狀視為0分;造模后大鼠出現(xiàn)右側(cè)肢體伸展不利視為1分;造模后大鼠行走時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈視為2分;造模后大鼠行走時(shí)向右傾倒視為3分;造模后大鼠無(wú)法行走視為4分。

1.2.3.2 TTC染色 利用TTC染色法對(duì)各組大鼠腦梗死體積的測(cè)量，各組大鼠干預(yù)結(jié)束后處死取出腦組織，均勻切成厚度約2 mm的腦片，利用2，3，5-氯化三苯基四氮唑進(jìn)行染色，正常腦組織可與2，3，5-氯化三苯基四氮唑進(jìn)行脫氫酶反應(yīng)最終顯示鮮紅色，而梗死腦區(qū)域因無(wú)法進(jìn)行脫氫酶反應(yīng)或者反應(yīng)減弱而呈現(xiàn)白色。利用Image-Pro Plus 6.0分析軟件對(duì)白色區(qū)域進(jìn)行計(jì)算，得出腦梗死體積百分比（%）=（腦片白色區(qū)域面積總和×2 mm）/全腦片面積×2 mm×100%。

1.2.3.3 HE染色 于腹主動(dòng)脈注入4%的多聚甲醛進(jìn)行腦組織灌流固定，冰上取出腦組織后均勻分成4等份，分別置于70%、80%、95%、100%梯度乙醇液體中進(jìn)行脫水，再用二甲苯透明，再用石蠟進(jìn)行包埋，待蠟塊充分冷卻后切成厚度約5 μm薄片，固定于載玻片上備用。隨后將切片固定10～30 s，再用蘇木精-伊紅染色，采用光學(xué)顯微鏡對(duì)樣本進(jìn)行讀取。

1.2.3.4 Western blot 充分麻醉后取出左側(cè)腦組織約100 mg，加入蛋白裂解液充分裂解后將樣本置于4 ℃、14 000 g/min條件下離心10 min，抽取上清液，利用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定并計(jì)算出各組上樣量。將上述總蛋白分裝于1.5 mL EP管中，在100 ℃水浴中煮沸變性5 min，充分冷卻后根據(jù)事先計(jì)算的上樣量加至SDS-PAGE凝膠孔道中，80 V恒壓電泳，再用PVDF膜轉(zhuǎn)膜目標(biāo)蛋白，再用5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉2 h，再分別加入一抗（羊抗Notch1 1∶1 000，羊抗Hes1 1∶1 000，β-actin 1∶1 000），孵育過(guò)夜，隨后用TBST洗滌3次，5 min/次，再用HRP標(biāo)記的二抗（1∶5 000）室溫反應(yīng)2 h，加入ECL顯影液，反應(yīng)60 s后于顯影儀器中進(jìn)行條帶掃描，得出灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)運(yùn)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布使用t檢驗(yàn)，偏態(tài)分布采用秩和檢驗(yàn)，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 電針曲池穴及足三里穴可降低MCAO大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分 接受造模的2組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分均明顯升高，進(jìn)行為期14 d干預(yù)后，針刺組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分明顯提高，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分比較（±s，分）

注：組內(nèi)比較，*P<0.05;與模型組干預(yù)第14天比較，△P<0.05

2.2 電針曲池穴及足三里穴可縮小MCAO大鼠腦梗死體積 接受造模的2組大鼠腦組織可見(jiàn)明顯白色區(qū)域，進(jìn)行為期14 d干預(yù)后，針刺組大鼠區(qū)域較模型組明顯縮小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表2、圖1。

表2 各組腦梗死體積比較（±s，%）

注：組內(nèi)比較，*P<0.05，與模型組干預(yù)第14天比較，△P<0.05

圖1 各組大鼠腦片TTC染色結(jié)果

2.3 電針曲池穴及足三里穴可明顯改善MCAO大鼠腦組織結(jié)構(gòu)及形態(tài) 空白組大鼠腦組織細(xì)胞排列整齊有序，細(xì)胞核完整。模型組大鼠腦片可見(jiàn)神經(jīng)元細(xì)胞排列錯(cuò)亂及皺縮，存在明顯壞死現(xiàn)象;針刺組大鼠腦組織部分神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)尚可，排列較模型組整齊，部分神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)濃染。見(jiàn)圖2。

圖2 各組MCAO大鼠腦組織結(jié)構(gòu)及形態(tài)

2.4 電針曲池穴及足三里穴可明顯改善上調(diào)MCAO大鼠腦組織Notch1、Hes1蛋白濃度 使用Western blot法對(duì)各組大鼠腦組織Notch1、Hes1的蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MCAO術(shù)后模型組及針刺組大鼠Notch1、Hes1的蛋白表達(dá)均降低，與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。經(jīng)過(guò)14 d干預(yù)后針刺組大鼠Notch1、Hes1的蛋白水平有所上調(diào)，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖3。

圖3 各組大鼠Western blot結(jié)果

3 討論

腦卒中屬于古籍中“中風(fēng)”“痿證”等范疇，認(rèn)為腦脈痹阻、腦髓失養(yǎng)使其主要病機(jī)，由此導(dǎo)致半身不遂等諸癥[6-8]。此病病位在頭部，《景岳全書》曰：“凡病此者……陰虧于前而陽(yáng)損于后……以致陰陽(yáng)相失，……卒然仆倒”，《靈樞·根結(jié)》亦記載：“太陽(yáng)為開(kāi)，陽(yáng)明為合，少陽(yáng)為樞……合折則氣所止息，而痿疾起矣。故痿疾者，取之陽(yáng)明”，故調(diào)節(jié)陽(yáng)明經(jīng)是治療腦卒中的關(guān)鍵。曲池穴為手陽(yáng)明大腸經(jīng)合穴，足三里是足陽(yáng)明胃經(jīng)合穴，兩穴均是陽(yáng)明經(jīng)要穴，乃陽(yáng)明經(jīng)氣匯聚之所，故使用二穴治療腦卒中由來(lái)已久，正如《針灸逢源·中風(fēng)門》中認(rèn)為：“癱瘓，此由將息失宜，……猝倒無(wú)知也，曲池……足三里”，此外，亦有學(xué)者[9]總結(jié)近年來(lái)中西醫(yī)手段治療腦卒中的相關(guān)文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)曲池穴及足三里穴是使用頻率最高的穴位，因此本研究選用曲池穴及足三里穴對(duì)MCAO大鼠進(jìn)行干預(yù)具有理論可行性。在對(duì)各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分統(tǒng)計(jì)中我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)MCAO造模后大鼠平很明顯升高，這提示MCAO術(shù)使大鼠產(chǎn)生了明顯神經(jīng)缺損癥狀，經(jīng)過(guò)針刺干預(yù)后大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分下降，提示針刺曲池穴及足三里穴可明顯改善大鼠神經(jīng)缺損癥狀，與此同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)模型組及針刺組大鼠腦片TTC染色后出現(xiàn)明顯白色區(qū)域，這提示本研究造模是成功的，且經(jīng)過(guò)針刺干預(yù)后大鼠腦梗死體積明顯縮小，這提示電針能夠減MCAO造模大鼠腦梗死體積，這一數(shù)據(jù)與國(guó)內(nèi)外諸多文獻(xiàn)結(jié)果一致。

研究中我們還發(fā)現(xiàn)MCAO術(shù)后大鼠神經(jīng)元細(xì)胞排列錯(cuò)亂及皺縮，存在明顯壞死現(xiàn)象，經(jīng)過(guò)針刺干預(yù)后大鼠腦組織神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)及形態(tài)有明顯改善，這說(shuō)明針刺曲池穴及足三里穴具有明顯的腦保護(hù)作用。在進(jìn)一步研究中我們對(duì)各組大鼠腦組織Notch信號(hào)通路上的標(biāo)志性蛋白Notch1、Hes1進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示MCAO術(shù)后模型組及針刺組大鼠Notch1、Hes1的蛋白表達(dá)均降低，與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。經(jīng)過(guò)14 d干預(yù)后針刺組大鼠Notch1、Hes1的蛋白水平有所上調(diào)，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。Notch信號(hào)通路在機(jī)體中扮演信號(hào)裝置的角色，相鄰的神經(jīng)元細(xì)胞通過(guò)Notch受體與相應(yīng)配體結(jié)合，從而產(chǎn)生自我更新效應(yīng)，亦有學(xué)者[10]認(rèn)為Notch信號(hào)通路是決定神經(jīng)元細(xì)胞增殖或凋亡的關(guān)鍵。Notch受體與配體結(jié)合后釋放大量的活性物質(zhì)，促進(jìn)Notch 1因子出現(xiàn)核移位，與細(xì)胞核內(nèi)的DNA相結(jié)合，由此激活其下游因子Hes家族，而Hes家族尤其是Hes1是調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的重要因子，并可促進(jìn)膠質(zhì)生成而發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用[11-15]，由此看來(lái)，針刺曲池穴及足三里穴發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)效應(yīng)的作用機(jī)制可能通過(guò)Notch信號(hào)通路進(jìn)行介導(dǎo)。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)針刺曲池穴及足三里穴可明顯改善MCAO大鼠神經(jīng)缺損癥狀，通過(guò)激活Notch信號(hào)通路發(fā)揮腦保護(hù)作用，但本研究對(duì)MCAO大鼠進(jìn)行為期14 d干預(yù)，大鼠具有極強(qiáng)的自愈能力，可能對(duì)本研究結(jié)果產(chǎn)生一定偏倚，下階段將進(jìn)行更嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以期更為客觀研究針刺的作用機(jī)制。

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