莫國棟 楊瑾 林麗 譚芳廷

中圖分類號 R284 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）20-2796-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.20.13

摘 要 目的：建立柴苓護肝顆粒的質(zhì)量標準。 方法：采用薄層色譜法（TLC）對制劑中柴胡、白術(shù)、甘草藥材進行定性鑒別，采用紫外-可見分光光度法測定制劑中總黃酮（以蘆丁計）的含量，并對制劑的水分、溶化性、粒度進行檢查。 結(jié)果：柴胡、白術(shù)、甘草的TLC圖斑點清晰，分離度好，陰性對照無干擾。蘆丁檢測質(zhì)量濃度線性范圍為 0.050～0.300 mg/mL（r=0.999 8）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD均小于2%；加樣回收率為97.89%～100.01%（RSD=0.68%，n=9）；樣品含量為1.920～2.018 mg/g。3批樣品的水分含量分別為1.54%、1.62%、1.57%，均在5 min內(nèi)溶化，不能通過一號篩且能通過五號篩的總和分別為2.13%、2.51%、2.38%，均符合2015年版《中國藥典》（四部）的規(guī)定。結(jié)論：初步擬定柴苓護肝顆粒中總黃酮的含量應(yīng)不得低于1.57 mg/g（以蘆丁計）；所建質(zhì)量標準的相關(guān)方法簡便、快速、準確、重復(fù)性好，可用于柴苓護肝顆粒的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 柴苓護肝顆粒；質(zhì)量標準；薄層色譜法；紫外-可見分光光度法；蘆??；總黃酮；柴胡；白術(shù)；甘草

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the quality standard of Chailing hugan granules. METHODS： TLC was used for qualitative identification of Radix bupleuri， Atractylodes macrocephala and Glycyrrhiza uralensis. The content of total flavonoids （by rutin） in preparation was determined by UV-visible spectrophotometry. The moisture， dissolubility and granularity of preparation were determined. RESULTS： TLC spots of R. bupleuri， A. macrocephala and G. uralensis were clear and well-separated without interference from negative control. The linear range of rutin was 0.050-0.300 mg/mL （r=0.999 8）. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 2%. The recoveries were 97.89%-100.01% （RSD=0.68%， n=9）. The content of samples were 1.920-2.018 mg/g. The contents of moisture in 3 batches of samples were 1.54%， 1.62% and 1.57%； all samples dissolved within 5 min. The sum of granules not passing through No.1 sieve and passing through No.5 sieve were 2.13%， 2.51%， 2.38%， which were all in line with the requirements of Chinese Pharmacopeia （2015 edition，Vol Ⅳ）. CONCLUSIONS： The content of total flavonoicle in Chailing hugan granules should be no less than 1.57 mg/g （by rutin）. Established quality standard is simple， rapid， accurate and reproducible， and can be used for quality control of Chailing hugan granules.

KEYWORDS Chailing hugan granules； Quality standard； TLC； UV-visible spectrophotometry； Rutin； Total flavonoids； Radix bupleuri； Atractylodes macrocephala； Glycyrrhiza uralensis

柴苓護肝方為逍遙散方[1]在結(jié)合臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)上加減藥味形成的經(jīng)驗方，由柴胡、白術(shù)、甘草（炙）8味中藥材組成，具有疏肝利膽、解酒瀉毒的功效，可用于酒精肝、脂肪肝、急慢性病毒性肝炎等病的治療[2]。柴苓護肝顆粒由處方藥材飲片經(jīng)水提、醇沉、濃縮、干燥、成型等工序制成，具有體積小、便于攜帶和保存、質(zhì)量穩(wěn)定可控等優(yōu)點[3-4]。為更好地控制其質(zhì)量，筆者根據(jù)藥材所含化學成分及其理化性質(zhì)，結(jié)合“君、臣、佐、使”的中醫(yī)藥理論[5]，采用薄層色譜法（TLC）對該制劑中柴胡、白術(shù)、甘草藥材進行定性鑒別，采用紫外-可見分光光度法測定該制劑中總黃酮的含量，并對其水分、溶化性、粒度進行檢查，旨在為該制劑質(zhì)量標準的建立提供參考。

1 材料

1.1 儀器

ZF-8型紫外分析成像儀（上海嘉鵬科技有限公司）；AS20500A型超聲波清洗機（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；XP26型百萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；UV-6100S型紫外-可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；DGX-9073型烘箱（上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司）；定量點樣毛細管（華西醫(yī)科大學儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

柴胡對照藥材（批號：120992-201509）、白術(shù)對照藥材（批號：120925-201611）、甘草對照藥材（批號：120904-201519）、蘆丁對照品（批號：100080-201409，純度：92.6%）均由中國食品藥品檢定研究院提供；柴苓護肝顆粒（我院制劑室自制，批號：20170611、20170613、20170615，規(guī)格：15 g/袋）；硅膠G薄層板（青島海洋化工廠分廠，批號：20150921）；其他試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 柴胡 取樣品10 g，加水40 mL，攪拌溶解，用水飽和正丁醇萃取2次，每次20 mL，棄去水層；合并正丁醇層，用40%氨試液洗滌2次，每次20 mL，棄去氨試液；取正丁醇層揮干，殘渣加甲醇1 mL溶解，搖勻，作為供試品溶液。取柴胡對照藥材0.5 g，加水40 mL，回流提取30 min，濾過，濾液按供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。取按柴苓護肝顆粒處方和工藝制備的缺柴胡的陰性樣品10 g，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。按2015年版《中國藥典》（四部）TLC法[6]試驗，吸取上述3種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-乙醇-水（1 ∶ 9 ∶ 2.5 ∶ 1，V/V/V/V）[7]為展開劑，展開，取出，晾干；以含1%對二甲氨基苯甲醛的10%硫酸乙醇溶液顯色，于105 ℃烘箱中加熱5 min，置紫外光燈（302 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，詳見圖1。

2.1.2 白術(shù) 取樣品10 g，加水30 mL，攪拌溶解，用石油醚（60～90 ℃）提取3次，每次30 mL，棄去水層；合并提取液，石油醚層揮干，殘渣加甲醇0.5 mL溶解，搖勻，作為供試品溶液。取白術(shù)對照藥材0.5 g，加水30 mL，煮沸30 min，放冷，濾過，濾液按供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。取按柴苓護肝顆粒處方和工藝制備的缺白術(shù)的陰性樣品10 g，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。按2015年版《中國藥典》（四部）TLC法[6]試驗，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以石油醚-乙酸乙酯（7 ∶ 3，V/V）[8]為展開劑，展開，取出，晾干；以含5%對二甲氨基苯甲醛的10%硫酸乙醇溶液顯色，于105 ℃烘箱中加熱5 min，置紫外光燈（302 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，詳見圖2。

2.1.3 甘草 取樣品5 g，加水40 mL，攪拌溶解，用水飽和正丁醇提取3次，每次20 mL，棄去水層；合并正丁醇層，用水洗滌3次，每次20 mL，棄去水層；取正丁醇層揮干，殘渣加甲醇3 mL溶解，搖勻，作為供試品溶液。取甘草對照藥材0.1 g，加水40 mL，煮沸30 min，放冷，濾過，濾液按供試品溶液制備方法制成對照藥材溶液。取按柴苓護肝顆粒處方和工藝制備的缺甘草的陰性樣品5 g，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。按2015年版《中國藥典》（四部）TLC法[6]試驗，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水（15 ∶ 1 ∶ 1 ∶ 2，V/V/V/V）[9]為展開劑，展開，取出，晾干；以10%硫酸乙醇溶液顯色，于105 ℃烘箱中加熱5 min，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，詳見圖3。

2.2 水分檢查

取3批樣品（批號：20170611、20170613、20170615）各適量，精密稱定，按2015年版《中國藥典》（四部）通則“0832水分測定法”第二法烘干法[6]測定水分，平行測定3次。結(jié)果顯示，3批樣品的平均水分含量分別為1.54%、1.62%、1.57%，均符合2015年版《中國藥典》（四部）規(guī)定的限度標準（不得超過8%）[6]。

2.3 溶化性檢查

取3批樣品（批號：20170611、20170613、20170615）各適量，精密稱定，按2015年版《中國藥典》（四部）通則“0104顆粒劑”項下有關(guān)溶化性的可溶顆粒檢查[6]測定溶化性，平行測定 3 次。結(jié)果顯示，3批樣品均在5 min內(nèi)溶化，均符合2015年版《中國藥典》（四部）規(guī)定的標準[6]。

2.4 粒度檢查

取3批樣品（批號：20170611、20170613、20170615）各適量，精密稱定，按2015年版《中國藥典》（四部）通則“0982粒度測定法”第二法雙篩法[6]測定粒度，平行測定 3 次。結(jié)果顯示，3批樣品不能通過一號篩且能通過五號篩的總和分別為 2.13%、2.51%、2.38%，均符合2015年版《中國藥典》（四部）規(guī)定的標準（不得超過15%）[6]。

2.5 含量測定

2.5.1 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品0.1 g，置于100 mL量瓶中，加70%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對照品溶液。

2.5.2 供試品溶液的制備 精密稱取樣品0.5 g，加70%乙醇至10 mL，超聲（功率：500 W，頻率：25 kHz）處理5 min，以3 000 r/min離心4 min，取上清液，即得供試品溶液。

2.5.3 檢測波長的選擇 精密吸取“2.5.1”項下對照品溶液2 mL，置于具塞玻璃試管中，加5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，于20～30 ℃下反應(yīng)6 min；加10%硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻，于20～30 ℃下反應(yīng)6 min；加氫氧化鈉溶液（4.3 g氫氧化鈉加水定容至100 mL）4 mL，搖勻，于20～30 ℃下反應(yīng)15 min。于200～600 nm波長范圍內(nèi)掃描[9]，測得其最大吸收波長為500 nm，詳見圖4。

2.5.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.5.1”項下對照品溶液0.5、1、1.5、2、2.5、3 mL，分別置于10 mL量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，搖勻，取2 mL置于具塞試管中，按“2.5.3”項下方法處理后于500 nm波長處測定吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度（x，mg/mL）為橫坐標、吸光度（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程y=4.039 4x-0.021 5（r=0.999 8）。結(jié)果表明，蘆丁檢測質(zhì)量濃度線性范圍為0.050～0.300 mg/mL。

2.5.5 精密度試驗 精密吸取“2.5.1”項下對照品溶液適量，按“2.5.3”項下方法處理后于500 nm波長處連續(xù)測定6次。結(jié)果，吸光度的RSD為1.76%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.5.6 穩(wěn)定性試驗 取“2.5.2”項下供試品溶液（批號：20170611）適量，分別于室溫下放置0、30、60、90、120、150 min時按“2.5.3”項下方法處理后于500 nm波長處進行測定。結(jié)果，吸光度的RSD為1.35%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置150 min內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5.7 重復(fù)性試驗 精密稱取樣品（批號：20170611）適量，共6份，按“2.5.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.5.3”項下方法處理后于500 nm波長處進行測定。結(jié)果，吸光度的RSD為1.67%（n=6），表明本方法重復(fù)性較好。

2.5.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知含量的樣品（批號：20170611）適量，共9份，每3份分別加入一定量的蘆丁對照品溶液，按“2.5.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.5.3”項下方法處理后于500 nm波長處進行測定并計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

2.5.9 樣品含量測定 取3批樣品各0.5 g，按“2.5.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.5.3”項下方法處理后于500 nm波長處進行測定，平行測定3次，記錄吸光度并計算樣品中總黃酮（以蘆丁計）的含量，結(jié)果見表 2。

3 討論

TLC法是快速分離和定性分析少量物質(zhì)的一種重要的試驗方法，也是中藥材定性鑒別的主要方法，常用于中藥成方制劑質(zhì)量標準的研究，在中藥分析與檢驗中具有重要的地位[10-11]。筆者在預(yù)試驗中參考2015年版《中國藥典》（一部）[12]及相關(guān)文獻[7-9，12-15]對柴苓護肝顆粒中8味藥材的主要活性成分進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除柴胡、白術(shù)、甘草的TLC鑒別專屬性強、色譜斑點清晰、分離度好、無拖尾現(xiàn)象，可用于定性鑒別外，其余藥材不宜作為該制劑的定性鑒別指標。

柴苓護肝顆粒中含有多種中藥材，成分復(fù)雜，主要有效成分為皂苷類、黃酮類和多糖類化合物，因此應(yīng)建立多指標綜合評價體系對制劑的質(zhì)量進行控制。柴胡皂苷為君藥柴胡的主要活性成分之一，對肝臟具有一定的保護作用，其含量本應(yīng)作為質(zhì)量控制指標。但筆者采用對二甲胺基苯甲醛比色法對其進行含量測定時，經(jīng)反復(fù)預(yù)試驗發(fā)現(xiàn)回收率達不到2015年版《中國藥典》（一部）的要求；進一步檢索2015年版《中國藥典》（一部）中收載的以柴胡為君藥的成方制劑[12]，如柴胡口服液、柴黃片、逍遙丸、柴銀口服液等，發(fā)現(xiàn)均未建立柴胡皂苷的含量測定方法。而目前已報道的柴胡皂苷含量測定方法差異較大，多為溶劑提取法[16]和大孔樹脂法[17]，步驟復(fù)雜煩瑣、重復(fù)性差、提取效率低，因此本研究未選擇總皂苷為控制該制劑質(zhì)量的指標。而經(jīng)查閱相關(guān)文獻[18-21]，發(fā)現(xiàn)該制劑中柴胡、豬苓、白術(shù)、甘草等藥材中均富含黃酮類化合物，其對肝病亦有不同程度的防治作用，故本研究以總黃酮（以蘆丁計）含量為質(zhì)量控制指標。

筆者對 3批樣品中的總黃酮進行含量測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其平均含量為1.97 mg/g。考慮到企業(yè)生產(chǎn)中中藥材飲片的有效成分含量具有一定的波動性，因此基于實際生產(chǎn)加工過程中的損耗和保存期等不穩(wěn)定因素，并結(jié)合相關(guān)文獻[22]，將樣品中總黃酮含量的平均值下調(diào)20%，初步擬定柴苓護肝顆粒中總黃酮的含量應(yīng)不得低于 1.57 mg/g（以蘆丁計）。

綜上所述，所建質(zhì)量標準的相關(guān)方法簡便、快速、準確、重復(fù)性好，可用于柴苓護肝顆粒的質(zhì)量控制。

參考文獻

[ 1 ] 鄧中甲. 方劑學[M]. 上海：上海科學技術(shù)出版社，2008：81.

[ 2 ] 楊瑾，莫國棟，宋鳳蘭，等. 柴苓護肝顆粒的優(yōu)化工藝 [J]. 環(huán)球中醫(yī)藥，2015，8（12）：1455-1459.

[ 3 ] 劉虓嶺. 中藥顆粒劑臨床應(yīng)用體會[J]. 中醫(yī)藥導(dǎo)報，2014，20（5）：134-135.

[ 4 ] 瞿劍. 中藥飲片和中藥顆粒劑使用情況調(diào)研分析[J]. 長春中醫(yī)藥大學學報，2012，28（6）：1106-1107.

[ 5 ] 韋佳，陳倩，馮泳. 試論中醫(yī)傳統(tǒng)方劑“君臣佐使”配伍理論的沿革[J]. 貴陽中醫(yī)學院學報，2014，36（6）：1-3.

[ 6 ] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典：四部[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：7、 57-58 .

[ 7 ] 溫勇，王德杭，陳瑞云，等. 小柴胡湯的質(zhì)量標準研究[J]. 中藥新藥與臨床藥理，2009，20（6）：562-565.

[ 8 ] 李艷，胡紅艷，黃秋明. 白術(shù)護肝合劑中當歸、白術(shù)、芍藥的薄層色譜鑒別[J]. 中醫(yī)學報，2012，3（27）：343-344.

[ 9 ] 陳美紅，陳建華，龍鳳來. 八珍片的甘草薄層鑒別方法對比研究[J]. 產(chǎn)業(yè)與科技論壇，2017，16（24）：72-73.

[10] 李麗，楊瑾，龍曉英，等. 柴苓護肝顆粒提取工藝的優(yōu)化[J]. 廣東藥學院學報，2016，32（6）：695-699.

[11] 羅由萍，鄧鵬飛. 薄層色譜及其在藥用植物研究中的應(yīng)用[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學，2011，39（6）：3309-3312.

[12] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典：一部[S]. 2015年版. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：87-1354.

[13] 壽旦，俞忠明，章建民. 改良的白術(shù)藥材薄層色譜鑒別研究[J]. 中華中醫(yī)藥學刊，2011，29（3）：535-536.

[14] 陳向前. 薄層色譜法同時鑒別知柏地黃丸中澤瀉、茯苓、山茱萸[J]. 海峽藥學，2014，26（3）：86-87.

[15] 劉少波. 新降糖顆粒制備工藝及質(zhì)量標準的研究[D]. 廣州：廣東藥科大學，2017.

[16] 李向軍，王超，王永，等. 中藥薄層色譜影響因素分析及應(yīng)用[J]. 中國藥業(yè)，2011，20（14）：13-15.

[17] 章佳赟. 含柴胡的常用中成藥中柴胡皂苷含量的測定及研究[D]. 上海：復(fù)旦大學，2010.

[18] 李軍，石任兵，劉斌，等. 四逆散不同配伍對柴胡皂苷a、b2及柴胡總皂苷煎出量的影響[J]. 北京中醫(yī)藥大學學報，2007，30（2）：115-120.

[19] 陽毅，莫偉彬，李啟暢. 甘草黃酮對運動大鼠肝組織自由基代謝及 p53 mRNA 表達的影響[J]. 中國實驗方劑學雜志，2013，19（19）：245-249.

[20] 孔繁陽，陳真. 黃酮類化合物防治酒精性肝病的研究進展[J]. 北方藥學，2016，13（5）：118-119.

[21] 崔瑩. 豬苓總黃酮提取工藝的研究[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學，2014，60（12）：41-42、56.

[22] 段麗，張永萍，徐劍，等. 精源膠囊的質(zhì)量標準研究[J]. 中國藥房，2017，28（9）：1231-1235.

（收稿日期：2017-12-13 修回日期：2018-08-27）

（編輯：陳 宏）