其曼古麗吐爾洪 玉蘇普買買提 馬依努爾拜克力

中圖分類號 R284.2；R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）20-2763-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.20.06

摘 要 目的：對西伯利亞白刺葉中總生物堿的大孔樹脂純化工藝進行優(yōu)化，并評價其抗氧化活性。方法：以樣品中總生物堿（以硫酸阿托品計）含量為考察指標，采用靜態(tài)吸附和解析法對大孔樹脂型號進行考察，采用動態(tài)吸附和解析法考察上樣液質(zhì)量濃度、上樣液pH、上樣液流速、柱子徑高比、上樣量、除雜用水量、洗脫溶劑體積分數(shù)，從而對大孔樹脂純化工藝進行優(yōu)化。以維生素C為陽性對照，考察樣品中總生物堿對1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基的清除能力，以評價其抗氧化活性。結(jié)果：HPD-450型大孔樹脂對樣品中總生物堿的吸附及解析能力較強；最優(yōu)純化工藝為上樣液質(zhì)量濃度0.88 mg/mL，上樣液pH 6，上樣液流速2 BV（柱體積）/h，柱子徑高比1 ∶ 8，上樣量5 BV，除雜用水量5 BV，洗脫溶劑30%乙醇。按最優(yōu)純化工藝優(yōu)化后的總生物堿含量為16.94 mg/g，半數(shù)抑制濃度為（58.78±3.00）μg/mL。結(jié)論：優(yōu)化的純化工藝穩(wěn)定、可行，可較好地分離和純化西伯利亞白刺葉中的總生物堿，且純化得到的總生物堿具有一定的抗氧化活性，其中30%乙醇洗脫得到的總生物堿清除DPPH自由基的能力最強。

關(guān)鍵詞 西伯利亞白刺葉；總生物堿；大孔樹脂；純化工藝；抗氧化活性

ABSTRACT OBJECTIVE： To optimize the purification technology of total alkaloids from the leaves of Nitraria sibirica with macroporous resin， and to evaluate its antioxidant activity. METHODS： Using the content of total alkaloids （by atropine sulfate） as index， static adsorption and analytical method were used to investigate the type of macroporous resin. Dynamic adsorption and analytical method were used to investigate the concentration of the sample solution， the pH of the sample solution， the flow rate of the sample solution， diameter-height ratio of column， sample capacity， the volume of elution water and volume fraction of elution solvent so as to optimize macroporous resin purification technology. Using vitamin C as positive control， scavenging capacity of total alkaloids to 1， 1- diphenyl-2-diphenyl picryl hydrazinyl （DPPH） radicals was investigated to evaluate its antioxidant activity. RESULTS： The adsorption and desorption effects of HPD-450 macroporous resin on total alkaloids were the best. The optimal purification technology included the sample solution concentration 0.88 mg/mL， sample solution pH 6， sample solution flow rate 2 BV/h，diameter-height ratio of column 1 ∶ 8， sample capacity 5 BV， the volume of elution water 5 BV， elution solvent 30% ethanol. The content of total alkaloid was 16.94 mg/g， and IC50 was （58.78±3.00）μg/mL by optimal purification technology. CONCLUSIONS： Optimized purification technology is stable and feasible， and can separate and purify total alkaloids from the leaves of N. sibirica. Purified total alkaloids display good antioxidant activities. The total alkaloids eluted with 30% ethanol show the strongest scavenging activity to DPPH radicals.

KEYWORDS Leaves of Nitraria sibirica； Total alkaloids； Macroporous resin； Purification technology； Antioxidant activity

西伯利亞白刺（Nitraria sibirica Pall.）別稱為白刺（Nitrariaceae），是蒺藜科的一種植物，分布于亞洲、歐洲、非洲和澳大利亞的荒漠，在我國新疆各地區(qū)都有零星分布。該屬植物是我國內(nèi)蒙古、甘肅和新疆一帶荒漠植被的重要建群之一[1]，其葉和果實均可入藥[2]。

西伯利亞白刺為傳統(tǒng)的維吾爾藥，其葉可被用于治療高血壓、月經(jīng)紊亂、腸胃炎等癥[3-4]。雖然在白刺屬的其他物種中發(fā)現(xiàn)含有總生物堿和黃酮類化合物[5-6]，但目前關(guān)于西伯利亞白刺葉化學成分的研究[7]甚少。有研究對西伯利亞白刺葉、成熟果實及未成熟果實中總生物堿含量進行比較，發(fā)現(xiàn)西伯利亞白刺葉中總生物堿含量較高，成熟果實次之，而未成熟果實中總生物堿含量較低，說明總生物堿的積累和貯存主要在其葉中[8]。因此，西伯利亞白刺葉可作為提取和富集白刺總生物堿的原料[9-11]，但如何科學地從其中提取和純化總生物堿是一個關(guān)鍵問題。為了闡明該藥用植物的物質(zhì)基礎(chǔ)，更有效地開發(fā)、利用其資源，本研究以總生物堿（以硫酸阿托品為對照品，該藥屬托烷生物堿類藥物）含量為考察指標，對該植物葉中總生物堿的大孔樹脂純化工藝進行優(yōu)化，并探討了其抗氧化活性，旨在為該植物的開發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

2550型紫外-可見光譜儀（日本島津公司）；EYELA-N-1100D-WD型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛郎儀器有限公司）；ESJ-180A型電子天平（沈陽神宇龍騰天平有限公司）；G2X-DH·300-BS-Ⅱ型電熱恒溫干燥箱（上海市躍進醫(yī)療器械一廠）；H14221型pH計（上海精密儀器儀表有限公司）；Spectra Max M5型酶標儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

硫酸阿托品對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100040-201210，純度：98%）；HPD-100、HPD-101、HPD-300、HPD-450、HPD-500、HPD-600、HPD-750、AB-8型大孔樹脂均由滄州寶恩吸附材料科技有限公司提供；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）[梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司]；其他試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 藥材

西伯利亞白刺葉采集于新疆和田，經(jīng)新疆大學資源與環(huán)境科學學院努爾巴依·阿布都沙力克教授鑒定為蒺藜科白刺屬西伯利亞白刺（N. sibirica Pall.）的葉。西伯利亞白刺葉經(jīng)自然晾干，粉碎后過20目篩，備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 總生物堿含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱取于120 ℃干燥至恒質(zhì)量的硫酸阿托品對照品25 mg，置于250 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置于100 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為50 μg/mL的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取樣品粗粉50 g，置于1 L圓底燒瓶中，加90%乙醇500 mL，于80 ℃水浴回流提取2.5 h，提取2 次；濾過，合并濾液，蒸干，殘渣加2%硫酸溶液10 mL溶解，濾過，濾液加5%碳酸鈉溶液調(diào)pH至10～12，用氯仿萃取 3 次；合并萃取液，蒸干，殘渣加2%硫酸溶液10 mL溶解，用5%碳酸鈉溶液調(diào)pH至7，加水定容于500 mL量瓶中，搖勻，即得供試品溶液。

2.1.3 檢測波長的選擇 精密吸取上述對照品溶液、供試品溶液各3 mL，分別置于25 mL分液漏斗中，加水至7 mL，加溴鉀酚氯溶液（pH 4.42）4 mL，搖勻；加氯仿15 mL，密塞瓶口振搖3 min，靜置1 h后取澄清的氯仿層，置于25 mL量瓶中，加氯仿定容，搖勻；移置于1 cm比色池中，以氯仿為空白溶液，在300～500 nm波長范圍內(nèi)掃描。結(jié)果顯示，對照品、供試品在415 nm波長處均有最大吸收，故選擇415 nm為本研究的檢測波長，詳見圖1。

2.1.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.1.1”項下對照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，按“2.1.3”項下方法顯色后于415 nm波長處測定吸光度。以硫酸阿托品質(zhì)量濃度（x，?g/mL）為橫坐標、吸光度（y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程為y=0.102x+0.101 5（r=0.999 8）。結(jié)果表明，硫酸阿托品檢測質(zhì)量濃度線性范圍為2～10 μg/mL。

2.1.5 樣品總生物堿含量 取“2.1.2”項下供試品溶液1 mL，按“2.1.3”項下方法顯色后于 415 nm波長處測定吸光度，根據(jù)“2.1.4”項下回歸方程計算總生物堿（以硫酸阿托品計）含量[12]。

2.2 大孔樹脂純化工藝優(yōu)選

2.2.1 樹脂預(yù)處理 分別稱取HPD-100、HPD-101、HPD-300、HPD-450、HPD-500、HPD-600、HPD-750、AB-8型大孔樹脂各10 g，加95%乙醇30 mL以流速2 BV（柱體積）/h通過樹脂并浸泡24 h，使其充分溶脹；加5%氯化鈉溶液30 mL以流速2 BV/h通過樹脂并浸泡3 h，用水洗至pH為中性，再加2%氫氧化鈉30 mL以流速2 BV/h通過樹脂并浸泡3 h，用水洗至pH為中性；于25 ℃晾干，計算含水量[含水量=（濕樹脂的質(zhì)量-干樹脂的質(zhì)量）/濕樹脂的質(zhì)量×100%]，結(jié)果見表1。

2.2.2 靜態(tài)吸附率和靜態(tài)解析率的測定 ①準確稱取“2.2.1”項下經(jīng)預(yù)處理的HPD-100、HPD-101、HPD-300、HPD-450、HPD-500、HPD-600、HPD-750、AB-8型大孔樹脂各3 g，分別置于錐形瓶中，加“2.1.2”項下供試品溶液30 mL，以100 r/min轉(zhuǎn)速振搖10 h，使樹脂充分吸附后濾過；濾液按“2.1.3”項下方法顯色后于415 nm波長處測定吸光度，計算濾液中總生物堿含量并計算8種型號大孔樹脂的靜態(tài)吸附量和靜態(tài)吸附率。②將吸附飽和的各型號大孔樹脂用水洗至無渾濁，加入不同體積分數(shù)的乙醇50 mL，以130 r/min轉(zhuǎn)速振搖3 h使其充分解析，解析液濾過，蒸至無乙醇味；殘留液用水定容，按“2.1.3”項下方法顯色后于415 nm波長處測定吸光度，計算大孔樹脂解析的總生物堿含量并計算8種型號大孔樹脂的靜態(tài)解析率。

靜態(tài)吸附量=（樣品溶液中總生物堿的質(zhì)量濃度×樣品溶液體積-吸附后溶液中總生物堿的質(zhì)量濃度×吸附后溶液體積）/吸附后溶液質(zhì)量。靜態(tài)吸附率=靜態(tài)吸附量/（樣品溶液中總生物堿的質(zhì)量濃度×樣品溶液體積）×100%。靜態(tài)解析率=解析液中總生物堿含量/大孔樹脂吸附的總生物堿含量×100%。8種型號大孔樹脂靜態(tài)吸附和解析試驗結(jié)果見表2（注：綜合評分=靜態(tài)吸附率×50%+靜態(tài)解析率×50%）。

由表2可知，HPD-450型大孔樹脂對總生物堿的靜態(tài)解析率、綜合評分均明顯高于其他型號大孔樹脂。全面考慮對總生物堿的靜態(tài)吸附率和靜態(tài)解析率以及綜合評分，選取HPD-100、HPD-450、HPD-500型大孔樹脂進行進一步考察。

2.2.3 靜態(tài)吸附動力學特征考察 準確稱取“2.2.1”項下經(jīng)預(yù)處理的HPD-100、HPD-450、HPD-500型大孔樹脂各3 g，分別置于錐形瓶中，加“2.1.2”項下供試品溶液30 mL，以100 r/min轉(zhuǎn)速振搖，分別于0.5、1、1.5、2、3、4、6、8 h時濾過；取7 mL濾液，按“2.1.3”項下方法顯色后于415 nm波長處測定吸光度，計算靜態(tài)吸附率并繪制靜態(tài)吸附動力學曲線，結(jié)果見圖2。

由圖2可知，隨著吸附時間的延長，靜態(tài)吸附率均逐漸增加，3種型號大孔樹脂在0～1 h內(nèi)靜態(tài)吸附率增加均較快，隨后增加逐漸緩慢，當吸附時間為2～3 h時靜態(tài)吸附率增加已極為緩慢。因此，確定上樣靜態(tài)吸附時間為2 h。同時，HPD-450型大孔樹脂的靜態(tài)吸附率明顯高于HPD-100、HPD-500型大孔樹脂，因此選擇HPD-450型大孔樹脂用于樣品總生物堿的純化工藝研究。

2.2.4 動態(tài)吸附性能考察 ①上樣液質(zhì)量濃度考察：取“2.2.1”項下經(jīng)預(yù)處理的HPD-450型大孔樹脂3 BV裝柱，另取按“2.1.2”項下方法制備質(zhì)量濃度（以總生物堿計）分別為1.33、0.88、0.66 、0.44 mg/mL的供試品溶液3 BV，各4份，以流速2 BV/h進行吸附試驗；收集流出液，靜置2 h后，用4 BV水洗脫，流速為5 BV/h；收集流出液，用水定容至50 mL，參照“2.2.2”項下公式計算動態(tài)吸附量和動態(tài)吸附率，結(jié)果見表3。

由表3可知，當上樣液質(zhì)量濃度為0.88 mg/mL時，動態(tài)吸附率和動態(tài)吸附量均較高，因此選擇上樣液質(zhì)量濃度為0.88 mg/mL。

②上樣液pH考察：取“2.2.1”項下經(jīng)預(yù)處理的HPD-450型大孔樹脂3 BV裝柱，另取“2.1.2”項下供試品溶液3 BV（質(zhì)量濃度為0.88 mg/mL，以總生物堿計），各4份，用2%硫酸溶液和無水碳酸鈉調(diào)上樣液pH分別為2、4、6、8，以流速2 BV/h進行吸附試驗；收集流出液，靜置2 h后，用4 BV水進行洗脫，流速為5 BV/h；收集流出液，用水定容至50 mL，參照“2.2.2”項下公式計算動態(tài)吸附量和動態(tài)吸附率，結(jié)果見表4。

由表4可知，當上樣液pH為6時，動態(tài)吸附量和動態(tài)吸附率均較高，因此選擇上樣液pH為6。

③上樣液流速考察：取“2.2.1”項下經(jīng)預(yù)處理的HPD-450型大孔樹脂3 BV裝柱，另取“2.1.2”項下供試品溶液3 BV（質(zhì)量濃度為0.88 mg/mL，以總生物堿計），各4份，分別以1、2、3、4 BV/h流速進行吸附試驗；收集流出液，靜置2 h后，用4 BV水進行洗脫，流速為5 BV/h；收集流出液，用水定容至50 mL，參照“2.2.2”項下公式計算動態(tài)吸附量和動態(tài)吸附率，結(jié)果見表5。

由表5可知，隨著上樣液流速的加快（1～3 BV/h），動態(tài)吸附率無明顯變化，考慮到大孔樹脂預(yù)處理過程中既要保證裝好的大孔樹脂中間無氣泡、均勻，又要使上樣液流速對動態(tài)吸附率無較大影響，因此選擇上樣液流速為2 BV/h。

④柱子徑高比考察：取“2.2.1”項下經(jīng)預(yù)處理的HPD-450型大孔樹脂3 BV，分別以徑高比1 ∶ 4、1 ∶ 6、1 ∶ 8、1 ∶ 10裝柱，另取“2.1.2”項下（質(zhì)量濃度為0.88 mg/mL）供試品溶液3 BV，各4份，以流速2 BV/h進行吸附試驗；收集流出液，靜置2 h后，用4 BV水進行洗脫，流速為5 BV/h；收集流出液，用水定容至50 mL，參照“2.2.2”項下公式計算動態(tài)吸附量和動態(tài)吸附率，結(jié)果見表6。

由表6可知，當柱子徑高比為1 ∶ 8時，動態(tài)吸附量和動態(tài)吸附率均較高，因此選擇柱子徑高比為1 ∶ 8。

⑤上樣量考察：取“2.2.1”項下經(jīng)預(yù)處理的HPD-450型大孔樹脂3 BV裝柱，另取“2.1.2”項下供試品溶液3 BV，各4份，以上樣液質(zhì)量濃度0.88 mg/mL、上樣液pH 6、上樣液流速2 BV/h、柱子徑高比1 ∶ 8進行吸附試驗；每上樣1 BV收集1份，共收集20份，按“2.1.3”項下方法顯色后于415 nm波長處測定吸光度并計算總生堿的含量，以上樣量（x，BV）為橫坐標、總生物堿含量（y，mg/mL）為縱坐標繪制吸附泄漏曲線，結(jié)果見圖3。

由圖3可知，當上樣量為5 BV時，總生物堿含量為0.1 mg/mL，此時達到泄漏點質(zhì)量濃度；當繼續(xù)增加上樣量時，總生物堿大量泄漏，因此選擇上樣量為5 BV。

⑥除雜用水量考察：取“2.2.1”項下經(jīng)預(yù)處理的HPD-450型大孔樹脂3 BV裝柱，另取“2.1.2”項下供試品溶液3 BV，各4份，以上樣液質(zhì)量濃度0.88 mg/mL、上樣液pH 6、上樣量5 BV、上樣液流速2 BV/h、柱子徑高比1 ∶ 8進行吸附試驗；收集流出液，靜置2 h后，用4 BV水洗脫雜質(zhì)（即樹脂間未被吸附的上樣液），流速為5 BV/h；收集流出液，用水定容至50 mL，按“2.1.3”項下方法顯色后于415 nm波長處測定吸光度并計算總生物堿的含量，以除雜用水量（x，BV）為橫坐標、總生物堿含量（y，mg/mL）為縱坐標繪制總生物堿含量-除雜用水量曲線，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，隨著除雜用水量的增加，總生物堿含量明顯減少；當除雜用水量大于5 BV時，總生物堿含量變化已較少，且流出液接近無色，因此選擇除雜用水量為5 BV。

⑦洗脫溶劑體積分數(shù)考察：取“2.2.1”項下經(jīng)預(yù)處理的HPD-450型大孔樹脂3 BV裝柱，另取“2.1.2”項下供試品溶液3 BV（質(zhì)量濃度為0.88 mg/mL，以總生物堿計），各4份，以流速2 BV/h進行吸附試驗；收集流出液，靜置2 h后，用4 BV水進行洗脫，流速為5 BV/h，后分別用30%、50%、70%乙醇進行洗脫；收集流出液，用水定容至50 mL，按“2.1.3”項下方法顯色后于415 nm波長處測定吸光度并計算總生物堿的含量及解析量，以洗脫液用量（x，BV）為橫坐標、解析量（y，mg/mL）為縱坐標繪制洗脫-解析曲線，結(jié)果見圖5。

由圖5可知，隨著洗脫液用量的增加，總生物堿的含量不斷減少；當洗脫液用量小于5 BV時解析量較多，但再增加洗脫液用量時，總生物堿流出量同時減少；其中以30%乙醇洗脫時解析量較高，因此選擇洗脫溶劑為30%乙醇。

綜合上述試驗結(jié)果，選擇最優(yōu)純化工藝為上樣液質(zhì)量濃度0.88 mg/mL、上樣液pH 6、上樣液流速2 BV/h、柱子徑高比1 ∶ 8、上樣量5 BV、除雜用水量5 BV、洗脫溶劑30%乙醇。經(jīng)驗證，此時總生物堿含量為16.94 mg/g；而當以50%乙醇洗脫時總生物堿含量為13.13 mg/g，以70%乙醇洗脫時總生物堿含量為12.44 mg/g。

2.3 總生物堿抗氧化活性研究

總生物堿抗氧化活性采用DPPH自由基清除法[13]進行評價。精密稱取DPPH自由基7.886 4 mg，加無水乙醇溶解，定容至10 mL，作為DPPH貯備液。將上述DPPH貯備液稀釋至2×10-4 mol/L后，加質(zhì)量濃度分別為25、50、75、100、125、150、175、200、300、400 μg/mL的3種總生物堿溶液（分別以30%、50%、70%乙醇洗脫后得到的固體，加水制得）100 μL，搖勻，于避光25 ℃下放置30 min后，用酶標儀于515 nm波長處測定吸光度。以維生素C為陽性對照，平行測定3次，計算半數(shù)抑制濃度（IC50）。IC50 越低表示對DPPH自由基的清除能力越強，結(jié)果見表7。

由表7可知，DPPH自由基清除能力由高到低依次為維生素C>30%乙醇>50%乙醇>70%乙醇。這提示30%乙醇洗脫后得到的總生物堿含量較高，抗氧化活性較強。

3 討論

大孔樹脂吸附作用是依靠其與被吸附的分子之間的范德華引力，通過其巨大的比表面進行物理吸附，使有機化合物根據(jù)被吸附力及其分子量大小可以經(jīng)一定溶劑洗脫而分開，以達到分離、純化、除雜、濃縮等目的[14]。

大孔樹脂是一類基于化合物分子量和極性來分離小分子的材料，其具有高負載能力，且可多次重復使用[15-16]。近年來，其已被廣泛用于中藥材中生物活性成分的分離和純化[17]。相比傳統(tǒng)分離和純化方法，大孔樹脂分離和純化具有操作簡單、效率高、成本低等優(yōu)點。

本研究結(jié)果顯示，西伯利亞白刺葉中總生物堿在弱極性大孔樹脂中的吸附和解析能力相對較好，尤其是 HPD-450型弱極性大孔樹脂最適于西伯利亞白刺葉中總生物堿的純化，純化后總生物堿的靜態(tài)解析率為94.84%。對不同體積分數(shù)乙醇作為洗脫溶劑的考察發(fā)現(xiàn)，30%乙醇洗脫得到的總生物堿含量最高，其次為50%乙醇，最后為70%乙醇。DPPH自由基已被廣泛應(yīng)用于檢測多種化合物的抗自由基活性中[18]。本研究中，30%乙醇洗脫得到的總生物堿對DPPH自由基的IC50為（58.78±3.00）μg/mL。

綜上所述，本研究優(yōu)化的純化工藝穩(wěn)定、可行，可較好地分離和純化西伯利亞白刺葉中的總生物堿，且純化得到的總生物堿具有一定的抗氧化活性，其中30%乙醇洗脫得到的總生物堿清除DPPH自由基的能力最強。

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（收稿日期：2018-03-06 修回日期：2018-09-03）

（編輯：陳 宏）