李欣 顧王文 李金豐 張志文 孫考祥

中圖分類號 R927.2 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）20-2758-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.20.05

摘 要 目的：建立同時測定抗感冒復(fù)方制劑中5種不同酸堿性成分含量的方法。方法：采用高效液相色譜法，工作站為ACQUITY Arc系統(tǒng)的Auto·Blend Plus軟件，色譜柱為Discovery? HS F5-5，流動相為酸混合液-堿混合液-甲醇-0.3%三乙胺（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為270 nm（對乙酰氨基酚、水楊酰胺、馬來酸氯苯那敏、鹽酸曲普利啶）、299 nm（乙酰水楊酸），柱溫為35 ℃，進樣量為20 μL。結(jié)果：對乙酰氨基酚、水楊酰胺、乙酰水楊酸、馬來酸氯苯那敏、鹽酸曲普利啶檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為26～411 μg/mL（r=0.999 6）、16～254 μg/mL（r=0.999 8）、16～748 μg/mL（r=0.998 1）、35～565 μg/mL（r=0.999 8）、25～404 μg/mL（r=0.999 7）；定量限分別為3.6、3.1、4.0、9.6、6.3 μg/mL，檢測限分別為1.9、1.3、1.4、2.9、2.3 μg/mL；中間精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗的RSD均小于2%；加樣回收率分別為100.0%～102.0%（RSD=0.59%，n=9）、95.2%～101.0%（RSD=1.55%，n=9）、96.2%～99.9%（RSD=1.24%，n=9）、96.2%～101.5%（RSD=1.57%，n=9）、96.3%～98.9%（RSD=0.83%，n=9）；耐用性試驗的RSD均小于3%。結(jié)論：該方法操作簡便、準確，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性、耐用性好，可用于抗感冒復(fù)方制劑中5種不同酸堿性成分含量的同時測定。

關(guān)鍵詞 Auto·Blend Plus技術(shù)；ACQUITY Arc系統(tǒng)；高效液相色譜法；對乙酰氨基酚；水楊酰胺；乙酰水楊酸；馬來酸氯苯那敏；鹽酸曲普利啶；含量測定

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for simultaneous contents determination of 5 kinds of acid and alkaline componentsin anti-cold compound preparation. METHODS： HPLC method was adopted. The workstation was Auto·Blend Plus software of ACQUITY Arc system. The determination was performed on Discovery? HS F5-5 column with mobile phase consisted of acid mixture-base mixture-methanol-0.3% triethylamine （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelengths were set at 270 nm （acetaminophen，salicylamide，chlorphenamine maleate，triprolidine hydrochloride） and 299 nm （aspirin）. The column temperature was 35 ℃，the sample size was 20 μL. RESULTS： The linear ranges of acetaminophen，salicylamide，acetylsalicylic acid，chlorphenamine maleate，triprolidine hydrochloride were 26-411 μg/mL（r=0.999 6）， 16-254 μg/mL（r=0.999 8）， 16-748 μg/mL（r=0.998 1）， 35-565 μg/mL（r=0.999 8） and 25-404 μg/mL（r=0.999 7），respectively. LOQ were 3.6， 3.1， 4.0， 9.6， 6.3 μg/mL； LOD were 1.9， 1.3， 1.4， 2.9， 2.3 μg/mL， respectively. RSDs of intermediate precision， stability and reproducibility tests were all lower than 2%. Average recoveries were 100.0%-102.0%（RSD=0.59%，n=9）， 95.2%-101.0%（RSD=1.55%，n=9）， 96.2%-99.9%（RSD=1.24%，n=9）， 96.2%-101.5%（RSD=1.57%，n=9）， 96.3%-98.9%（RSD=0.83%，n=9）， respectively. RSDs of durability tests were lower than 3%. CONCLUSIONS： The method is simple， accurate， precise， stable， reproducible and durable， and can be used for simultaneous contents determination of 5 kinds of acid and alkaline components in anti-cold compound preparation.

KEYWORDS Auto·Blend Plus method； ACQUITY Arc system； HPLC； Acetaminophen； Salicylamide； Acetylsalicylic acid； Chlorphenamine maleate； Triprolidine hydrochloride； Content determination

高效液相色譜法（HPLC）是針對一個或一批樣品建立的一整套完整的色譜分析方法[1]。在試驗過程中，分析人員需對一系列的色譜參數(shù)，如流動相類型、pH、緩沖液濃度以及流速、柱溫、檢測波長等條件，不斷進行優(yōu)化以篩選出最適用的條件[2-4]。當待測成分分離度依賴于流動相的pH時，需要配制系列pH緩沖液作為流動相進行篩選，其過程復(fù)雜、操作煩瑣。對乙酰氨基酚、水楊酰胺、乙酰水楊酸、馬來酸氯苯那敏、鹽酸曲普利啶都是常見的抗感冒復(fù)方制劑組成成分，其酸堿性不同，當同時含有這樣幾種性質(zhì)差異較大的成分時，很難采用相同的色譜條件將其分離并進行測定[5-6]。鑒于此，筆者應(yīng)用美國Waters公司推出的Auto·Blend Plus技術(shù)，開發(fā)出同時測定抗感冒復(fù)方制劑中多種酸堿性成分的色譜分析方法，不需手動配制系列pH緩沖液，僅需設(shè)定好每個成分的適用pH，系統(tǒng)即可自動調(diào)節(jié)流動相[7]，從而可為建立實驗室快速分析方法提供一定借鑒。

1 材料

1.1 儀器

ACQUITY Arc系統(tǒng)、Auto·Blend Plus軟件、e2695型HPLC儀（包括四元泵、光電二極管陣列檢測器、自動進樣器、Empower色譜工作站）均購自美國Waters公司；CP225D型十萬分之一電子分析天平、QUINTIX224-1CN型萬分之一電子分析天平（德國Sartorius公司）；Micro 17R型臺式冷凍離心機（美國Thermo公司）；Milli-Q型純水儀（美國Millipore公司）；DL-480A型超聲波清洗儀（上海之信儀器有限公司）；ACD Labs 12.0軟件（加拿大Advanced Chemistry Development，Inc.）。

1.2 試劑

對乙酰氨基酚對照品（批號：A1125AS，純度：>99%）、水楊酰胺對照品（批號：S1101AS，純度：>98%）、乙酰水楊酸對照品（批號：O0312AS，純度：>99%）、馬來酸氯苯那敏對照品（批號：A0703AS，純度：>98%）均購自上海賽抑生物科技有限公司；鹽酸曲普利啶對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：101063- 201001，純度：94.2%）；甲醇、三乙胺為色譜純，馬來酸、檸檬酸、琥珀酸酸、4-甲基嗎啡啉、嗎啡啉、氫氧化銨、哌啶為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

工作站：ACQUITY Arc系統(tǒng)的Auto·Blend Plus軟件；色譜柱：Discovery? HS F5-5（250 mm×4.6 mm，5 ?m）；流動相：酸混合液（馬來酸、檸檬酸、琥珀酸濃度分別為50、25、25 mmol/L）（A）-堿混合液（4-甲基嗎啡啉、嗎啡啉、氫氧化銨、哌啶濃度均為50 mmol/L）（B）-甲醇（C）-0.3%三乙胺（D），梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：270 nm（對乙酰氨基酚、水楊酰胺、馬來酸氯苯那敏、鹽酸曲普利啶），299 nm（乙酰水楊酸）；柱溫：35 ℃；進樣量：20 ?L。

2.2 樣品與溶液的制備

2.2.1 樣品 參照已上市藥品氨酚曲麻片、復(fù)方氨酚烷胺片、阿司匹林片的處方，取對乙酰氨基酚對照品0.1 g、水楊酰胺對照品0.05 g、乙酰水楊酸對照品0.1 g、馬來酸氯苯那敏對照品2 mg、鹽酸曲普利啶對照品1.2 mg，輔料為淀粉、乳糖、微晶纖維素、低取代羥丙纖維素和硬脂酸鎂，采用粉末直壓工藝得到同時包含5種待測成分的樣品，平均片質(zhì)量為1.2 g，載藥量為21%。

2.2.2 混合對照品溶液 分別取對乙酰氨基酚對照品、水楊酰胺對照品、乙酰水楊酸對照品、馬來酸氯苯那敏對照品、鹽酸曲普利啶對照品17.13、10.57、31.17、23.55、16.85 mg，精密稱定，置于20 mL量瓶中，加70%甲醇超聲（功率：480 W，頻率：40 kHz，下同）溶解并定容，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液 取樣品適量，研細，精密稱取0.6 g，置于20 mL量瓶中，加70%甲醇溶液超聲溶解并定容，搖勻，12 000 r/min離心10 min，取上清液，即得。

2.2.4 陰性對照溶液 按樣品處方和工藝制備缺對乙酰氨基酚、水楊酰胺、乙酰水楊酸、馬來酸氯苯那敏、鹽酸曲普利啶的陰性樣品，并按“2.2.3”項下方法制成陰性對照溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗

取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。結(jié)果，理論板數(shù)按對乙酰氨基酚、水楊酰胺、乙酰水楊酸、氯苯那敏、曲普利啶峰計均大于6 000；基線分離良好，分離度均大于1.9。

2.4 專屬性試驗

取“2.2”項下混合對照品溶液、陰性對照溶液各適量，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，詳見圖1。結(jié)果，陰性對照在與對乙酰氨基酚、水楊酰胺、乙酰水楊酸、氯苯那敏、曲普利啶峰保留時間相同處未見干擾峰，表明本方法專屬性良好。

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.2”項下混合對照品溶液0.3、0.5、1.0、1.2、2.4、4.8 mL，置于10 mL量瓶中，加70%甲醇定容，搖勻，制成系列混合對照品溶液。精密量取上述系列混合對照品溶液各20 μL，按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以待測成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，回歸方程與線性范圍見表2。

2.6 定量限與檢測限考察

分別精密量取“2.2.2”項下混合對照品溶液適量，倍比稀釋，并按“2.1”項下色譜條件進樣測定，以信噪比10 ∶ 1、3 ∶ 1分別計算定量限、檢測限，結(jié)果見表2。

2.7 中間精密度試驗

由2名分析員分別在不同日期精密稱取樣品適量，各6份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件在不同儀器上進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，對乙酰氨基酚、水楊酰胺、乙酰水楊酸、氯苯那敏、曲普利啶峰面積的RSD分別為0.89%、0.65%、0.92%、0.32%、0.14%（n=12），表明本方法中間精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取“2.2.3”項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置0、2、8、12、24、48 h時按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，對乙酰氨基酚、水楊酰胺、乙酰水楊酸、氯苯那敏、曲普利啶峰面積的RSD分別為0.71%、0.26%、1.51%、0.62%、0.81%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置48 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.9 重復(fù)性試驗

精密稱取同一批樣品適量，共6份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算標示量百分比。結(jié)果，對乙酰氨基酚、水楊酰胺、乙酰水楊酸、馬來酸氯苯那敏、鹽酸曲普利啶標示量百分比平均值分別為100.0%、99.8%、99.8%、100.0%、99.6%，RSD分別為0.02%、0.43%、0.02%、0.16%、0.28%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.10 加樣回收率試驗

按“2.2.2”項下方法制備混合溶液，共9份，分別加入0.4、0.5、0.6 mL的混合對照品溶液適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液[8]，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，結(jié)果見表3。

2.11 耐用性試驗

2.11.1 色譜柱考察 精密稱取樣品適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件[分別設(shè)置色譜柱為Discovery? HS F5-5（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Ultimate? XB-Phenyl（250 mm×4.6 mm，5 μm]進樣測定，記錄峰面積并計算標示量百分比，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，當色譜柱發(fā)生一定程度變化時，本方法能滿足試驗要求，耐用性良好。

2.11.2 流速考察 精密稱取樣品適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件（分別設(shè)置流速為0.9、1.0、1.1 mL/min）進樣測定，記錄峰面積并計算標示量百分比，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，當流速發(fā)生一定程度變化時，本方法能滿足試驗要求，耐用性良好。

2.11.3 柱溫考察 精密稱取樣品適量，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件（分別設(shè)置柱溫為33、35、37 ℃）進樣測定，記錄峰面積并計算標示量百分比，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，當柱溫發(fā)生一定程度變化時，本方法能滿足試驗要求，耐用性良好。

2.12 樣品標示量百分比測定

取樣品適量，分別按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，平行測定3次，記錄峰面積并計算標示量百分比，結(jié)果見表5。

3 討論

流動相pH的改變是分析過程中一個至關(guān)重要的環(huán)節(jié)，因為一些對pH敏感的成分，即使發(fā)生3/10 pH單位的細微變化，也會極大地改變其洗脫時間[9]。Auto·Blend Plus技術(shù)最初用于蛋白質(zhì)分離，本試驗采用該技術(shù)優(yōu)化對pH敏感化學(xué)成分的色譜分離，挑選出5種分別具有不同酸堿性的待測成分，在試驗設(shè)計中選擇梯度洗脫更有利于各成分的分離。從化學(xué)結(jié)構(gòu)式來看，對乙酰氨基酚、水楊酰胺具有酰胺鍵，馬來酸氯苯那敏和鹽酸曲普利啶成鹽，均比較穩(wěn)定。乙酰水楊酸有一個酯鍵，有文獻報導(dǎo)其水溶液不穩(wěn)定，極易水解生成水楊酸[10]。筆者比較了流動相pH分別為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5時5種待測成分的分離情況。結(jié)果顯示，當pH<4時，各色譜峰峰形均較好，但在該條件下無法將馬來酸氯苯那敏與鹽酸曲普利啶完全分開。當pH≥5時，乙酰水楊酸色譜峰發(fā)生改變，峰形變寬且拖尾嚴重。經(jīng)驗證，該色譜峰為乙酰水楊酸的水解產(chǎn)物水楊酸，而有文獻報道酸性體系可有效抑制乙酰水楊酸水解[11]。當pH≥5.5時，馬來酸氯苯那敏與鹽酸曲普利啶可得到較好分離，且pH越大兩者分離效果越好，但保留時間也會隨之延長。在試驗過程中發(fā)現(xiàn)，馬來酸氯苯那敏和鹽酸曲普利啶有嚴重的峰拖尾現(xiàn)象，而后期優(yōu)化過程中通過加入0.3%三乙胺能明顯改善峰拖尾現(xiàn)象。

整個試驗過程中采用全波長掃描，在后期采用分段波長處理[12]。由于乙酰水楊酸在299 nm波長處有最大吸收，在270 nm波長處吸收很弱，而其余4個成分在270 nm波長處吸收較好，因此乙酰水楊酸的出峰時間段采用299 nm波長進行掃描（13.1～13.5 min），其他成分的出峰時間段采用270 nm波長進行掃描。

本試驗建立了一種可以同時測定酸堿性不同的多成分的方法。在一個流動相體系中可以設(shè)置兩個pH值，簡化了配制不同pH流動相的過程，達到快速、簡便、準確的效果。在整個方法操作過程中，只需配制兩次流動相（A相和B相的貯備溶液），通過設(shè)置一個序列表即可實現(xiàn)連續(xù)進樣，從而快速完成各個組分的分離鑒定。與采用pH/溶劑雙梯度反相HPLC法[13]以及微乳液相色譜法[14]同時測定一種抗感冒復(fù)方制劑中多種組分的含量相比，極大地減少了方法摸索過程中的工作量。與文獻[15]報道的采用普通溶劑梯度法測定阿酚咖敏片中對乙酰氨基酚、乙酰水楊酸和馬來酸氯苯那敏的含量相比，本試驗方法檢測時間縮短了近40 min。綜上所述，本方法可同時分離酸性、堿性化學(xué)成分，有效簡化了工作流程，適用于同時測定抗感冒復(fù)方制劑中多種酸堿性不同的成分的含量。

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（收稿日期：2017-12-18 修回日期：2018-02-06）

（編輯：張 靜）