李雅靜 王豐青 謝彩俠 謝惠英 張苗 雷敬衛(wèi)

中圖分類號 R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2018）20-2747-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.20.03

摘 要 目的：建立知柏地黃丸（濃縮丸）的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并評價其質(zhì)量。方法：色譜柱為Dikma Diamonsil C18，流動相為0.1%醋酸溶液-甲醇（梯度洗脫），流速為1.0 mL/min，檢測波長為260 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 ?L。以丹皮酚為參照，分別繪制A、B、C廠有效期內(nèi)樣品和A廠有效期內(nèi)與有效期外樣品的HPLC圖譜。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004 A）對A、B、C廠有效期內(nèi)樣品及A廠有效期內(nèi)與有效期外樣品進(jìn)行相似度評價，分別確定共有峰。結(jié)果：A、B、C廠各10批有效期內(nèi)樣品的HPLC圖譜分別有24、29、32個共有峰，A、B、C廠樣品HPLC圖譜與對照指紋圖譜的相似度均大于0.94，具有較好的一致性。A廠有效期內(nèi)樣品的HPLC圖譜與有效期外樣品的HPLC圖譜具有較好的一致性。結(jié)論：本研究建立的HPLC指紋圖譜可為評價知柏地黃丸（濃縮丸）的質(zhì)量提供參考，但其并不能有效鑒別有效期外的樣品。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜法；指紋圖譜；知柏地黃丸（濃縮丸）；有效期

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the HPLC fingerprint of Zhibai dihuang pills （concentrated pills）， and to evaluate its quality. METHODS： The determination was performed on Dikma Diamonsil C18 column with mobile phase consisted of 0.1% acetic acid solution-methanol （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 260 nm， and column temperature was 30 ℃. The sample size was 10 ?L. Using paeonol as reference，HPLC chromatograms of samples from A，B， C manufacturers within validity period and samples from manufacturer A within validity period and out of validity period were drawn. The similarity of HPLC chromatogram for samples from A， B and C manufacturers and samples from A manufacturer within validity period and out of validity period was evaluated by TCM Chromatogram Fingerprint Similarity Evaluation System （2004 A）. Common peaks of HPLC chromatogram for 3 manufacturers sample within validity period were confirmed. RESULTS： There were 24， 29 and 32 common peaks in HPLC chromatograms for each 10 batches of samples from manufacturer A， B and C within validity period， respectively. The similarity of corresponding HPLC chromatograms of samples from manufacturer A， B and C compared with control HPLC chromatography were all higher than 0.94 with good agreement. HPLC chromatograms of sample from A manufacturer within validity period had good agreement with that from A manufacturer out of validity period. CONCLUSIONS： Established HPLC fingerprint analysis method can represent the quality of Zhibai dihuang pills （concentrated pills）， but cannot effectively identify the expired samples.

KEYWORDS HPLC； Fingerprint； Zhibai dihuang pills （concentrated pills）； Validity period

知柏地黃丸（濃縮丸）是在六味地黃丸的組方基礎(chǔ)上加黃柏和知母兩味藥材精制而成，可滋陰降火，臨床上廣泛用于陰虛火旺、口干咽痛、潮熱盜汗、小便短赤、耳鳴遺精等癥的治療[1]。目前，全國生產(chǎn)知柏地黃丸（濃縮丸）的廠家有273家，由于該制劑藥味較多，不同廠家在其生產(chǎn)過程中所用的藥材、輔料來源及生產(chǎn)工藝不盡相同，質(zhì)量也有所差異。中藥材中的化學(xué)成分是中藥制劑藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)，2015年版《中國藥典》（一部）僅用牡丹皮中丹皮酚和山茱萸中馬錢苷兩種成分的含量作為評價知柏地黃丸（濃縮丸）質(zhì)量的主要指標(biāo)，并沒有體現(xiàn)該制劑多組分的特征。程翼宇等[2]定義中藥制劑質(zhì)量穩(wěn)定性為在特定的一段時期（如有效期）內(nèi)，中藥制劑保持化學(xué)、物理、生物特性以及療效的能力。那么知柏地黃丸（濃縮丸）在存放及流通過程中一旦超過規(guī)定的有效期，其質(zhì)量特征與正常有效期內(nèi)的制劑有無明顯差異？如何準(zhǔn)確鑒別該制劑是否超出其有效期，以防止有效期外的藥品再次流入市場，給用藥安全帶來隱患？這些也都是令人關(guān)心的問題。本研究利用化學(xué)計(jì)量學(xué)知識，對A、B、C廠生產(chǎn)的有效期內(nèi)的知柏地黃丸（濃縮丸）樣品及A廠生產(chǎn)的有效期內(nèi)與有效期外的知柏地黃丸（濃縮丸）樣品的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜信息進(jìn)行采集和分析，以期為建立一種科學(xué)、準(zhǔn)確地控制知柏地黃丸（濃縮丸）質(zhì)量的方法提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

2695型HPLC儀，包括2998光電二極管陣列檢測器等（美國Waters公司）；ME54E型萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；TY-500型超聲波清洗儀（北京天佑恒達(dá)科技有限公司）；SZ-93型自動雙重純水蒸餾器（上海亞榮生化儀器廠）；CPA225D型十萬分之一電子分析天平（德國Sartorius公司）。

1.2 藥品與試劑

知柏地黃丸（濃縮丸）（2014年收集，來源見表1。其中，S31～S35號樣品為A廠生產(chǎn)的有效期外的樣品）；馬錢苷對照品（批號：110708-200506，純度：>98%）、丹皮酚對照品（批號：111640-201005，純度：>98%）均購自中國食品藥品檢定研究院；芒果苷對照品（批號：MUST-13110201，純度：>98%）、鹽酸黃柏堿對照品（批號：MUST-13021407，純度：>98%）、鹽酸小檗堿對照品（批號：MUST-13110201，純度：>98%）均購自成都曼思特生物科技有限公司；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為雙蒸水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Dikma Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.1%醋酸溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脫（洗脫程序見表2）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：260 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 ?L。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取丹皮酚對照品2.78 mg、芒果苷對照品1.40 mg、鹽酸黃柏堿對照品2.18 mg、鹽酸小檗堿對照品2.32 mg、馬錢苷對照品1.14 mg，分別置于5 mL量瓶中，加50%甲醇溶解并定容，搖勻，經(jīng)0.22 ?m微孔濾膜濾過，制成單一對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品粉末約1.0 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）處理40 min，放冷，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號：S3）適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，以丹皮酚峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，A、B、C廠各10批有效期內(nèi)樣品的HPLC圖譜的24、29、32個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明本方法精密度良好。

2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號：S3）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、12、24 h時按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以丹皮酚峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，A、B、C廠各10批有效期內(nèi)樣品的HPLC圖譜的24、29、32個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取樣品（編號：S3）粉末適量，共6份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以丹皮酚峰的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結(jié)果，A、B、C廠各10批有效期內(nèi)樣品的HPLC圖譜的24、29、32個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.4 A、B、C廠有效期內(nèi)樣品的HPLC指紋圖譜的生成與共有峰相關(guān)分析、相似度分析

2.4.1 HPLC指紋圖譜的生成 取30批有效期內(nèi)樣品粉末各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004 A）對30批樣品的HPLC圖譜進(jìn)行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見圖1、圖2。

2.4.2 共有峰相關(guān)分析 由圖2可知，A廠樣品標(biāo)定24個共有峰，其中峰9、14、15、16、23分別為黃柏堿、芒果苷、馬錢苷、小檗堿、丹皮酚；B廠樣品標(biāo)定29個共有峰，其中峰10、20、21、22、28分別為黃柏堿、芒果苷、馬錢苷、小檗堿、丹皮酚；C廠樣品標(biāo)定32個共有峰，其中峰12、19、20、24、31分別為黃柏堿、芒果苷、馬錢苷、小檗堿、丹皮酚。

2.4.3 相似度分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004 A），分別以樣品S1、S11、S21的HPLC圖譜作為對照，對A、B、C廠各10批有效期內(nèi)樣品進(jìn)行整體相似度評價。結(jié)果顯示，A、B、C廠樣品相似度均大于0.94，表明A、B、C廠各自樣品的批間差異較小，質(zhì)量穩(wěn)定性良好，詳見表3～表5。

2.5 A廠有效期內(nèi)與有效期外樣品的HPLC指紋圖譜的生成與相似度分析

2.5.1 HPLC指紋圖譜的生成 取A廠5批有效期內(nèi)樣品與5批有效期外樣品粉末各適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004 A）對10批樣品的HPLC圖譜進(jìn)行分析，得HPLC指紋圖譜，詳見圖3、圖4。

2.5.2 相似度分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》（2004 A），以10批樣品的共有模式作為對照，進(jìn)行整體相似度評價。結(jié)果顯示，有效期內(nèi)與有效期外樣品的相似度均大于0.96，說明有效期內(nèi)與有效期外樣品的主要成分沒有明顯差異，詳見表6。

3 討論

科學(xué)的中藥制劑質(zhì)量控制與評價方法是保證中藥制劑臨床用藥安全、有效和質(zhì)量穩(wěn)定、可控的重要前提。而中藥制劑是一種多組分相互作用的特殊藥品，具有復(fù)雜性、整體性等特征，其質(zhì)量控制及評價方法應(yīng)體現(xiàn)自身的特點(diǎn)。目前，2015年版《中國藥典》（一部）中有關(guān)中藥制劑質(zhì)量控制的方法大多采用某個或某幾個化學(xué)成分的含量來作為其質(zhì)量是否合格的評價標(biāo)準(zhǔn)，不符合其整體性特征，也不能真實(shí)反映其質(zhì)量。因此中藥制劑至今未得到國際主流藥品市場的認(rèn)可。中藥現(xiàn)代化就是根據(jù)中藥成分復(fù)雜的特點(diǎn)，將傳統(tǒng)的中醫(yī)藥理論與現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建一套符合中藥特點(diǎn)的質(zhì)量控制與評價體系，以保障其質(zhì)量的穩(wěn)定與可控。光譜及色譜指紋圖譜可以在一定程度上反映待測對象中包括物質(zhì)的多少及含量高低等信息，是一種相對綜合、整體的質(zhì)量評價方法[3-5]。本研究即利用HPLC指紋圖譜法對A、B、C廠生產(chǎn)的有效期內(nèi)樣品的化學(xué)成分進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，3個廠樣品質(zhì)量整體上具有相對一致性。

本研究還分析了A廠生產(chǎn)的有效期內(nèi)與有效期外樣品（提取溶劑為50%甲醇溶液）的HPLC指紋圖譜信息，發(fā)現(xiàn)兩者并沒有明顯差異，原因可能是：（1）兩種樣品的化學(xué)成分并沒有發(fā)生改變，而只是在物理或者生物性狀方面發(fā)生了變化；（2）兩種樣品的化學(xué)成分有差異，但50%甲醇溶液提取物的HPLC指紋圖譜信息所反映的化學(xué)成分并沒有發(fā)生改變，而這種改變來源于其他部位化學(xué)成分，但本方法無法檢測到。2015年版《中國藥典》（一部）規(guī)定丹皮酚和馬錢苷的含量為評價本樣品質(zhì)量是否合格的指標(biāo)，而提取這兩個成分所用的溶劑均為甲醇，因此，如果在樣品的市場流通和使用過程中，均以這兩個成分的含量作為評價標(biāo)準(zhǔn)的話，就有可能使大量已超出有效期的樣品流入市場，不僅影響藥物的臨床療效，而且給用藥安全帶來了極大的隱患。

藥品有效期的合理制定是保證藥品安全、有效使用的前提。中藥制劑要想走出國門，走向國際市場，必須符合國際行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[6]。中藥成分復(fù)雜，而且在放置過程中可能會產(chǎn)生許多復(fù)雜的物理、化學(xué)及生物學(xué)變化，那么中藥制劑有效期制定過程中所采用的評價方法是否能夠反映其真實(shí)質(zhì)量的變化？這種變化與中藥制劑的臨床療效及安全性之間有何關(guān)系？這一系列問題[7-8]仍有待解決。因此，當(dāng)前迫切需要建立一套科學(xué)、合理的評價中藥制劑有效期的方法。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典：一部[S]. 2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：1069.

[ 2 ] 程翼宇，錢忠直，張伯禮. 創(chuàng)建以過程管控為核心的中藥質(zhì)量控制技術(shù)體系[J]. 中國中藥雜志，2017，42（1）：1-4.

[ 3 ] 謝彩俠，王麗娜，劉蕊，等. NIRS與HPLC指紋圖譜技術(shù)在玉米須質(zhì)量分析中的應(yīng)用[J]. 藥物分析雜志，2017，36（2）：356-358.

[ 4 ] 劉清茹，譚偉民，文詩泳，等. 枳殼藥材揮發(fā)油的GC-MS指紋圖譜研究[J]. 中國藥房，2018，29（4）：461-464.

[ 5 ] 鄭丁丁，張小梅，楊怡火，等. 火把花根片中間體的HPLC指紋圖譜研究[J]. 中國藥房，2017，28（33）：4714-4717.

[ 6 ] 宋廣大，袁燕芳，孫玉雯. 淺談制定中藥有效期的重要性及策略[J]. 內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2015，24（11）：111-112.

[ 7 ] 王金梅，姚 辰，李昌勤，等. 經(jīng)典恒溫法預(yù)測紅花的有效期[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2017，29（2）：273-277.

[ 8 ] 黃勤挽，蘇娟，范潤勇，等. 不同包裝和貯藏條件對熟地黃小包裝飲片有效期的影響[J]. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2017，23（7）：31-34.

（收稿日期：2018-01-03 修回日期：2018-03-21）

（編輯：張 靜）