石鵬 夏薇 肖勇 王永 曹紅星 李東霞 雷新濤

摘 要： 油棕屬棕櫚科多年生木本油料作物，果實(shí)含油量高達(dá)50%，且單位面積產(chǎn)油量高，享有“世界油王”美譽(yù)。油棕果實(shí)由外果皮、中果皮、內(nèi)果皮（種殼）、種子四個部分組成，產(chǎn)油部分主要是中果皮和種子，其中種殼厚度是影響果實(shí)含油量的重要因素。SHELL基因控制種殼厚度，是一類MADS-box同源基因，SHELL基因在厚殼種和無殼種中的變異主要是第一個外顯子上的兩個SNP位點(diǎn)。該研究根據(jù)兩個SNP位點(diǎn)進(jìn)行特異標(biāo)記開發(fā)，根據(jù)已知的油棕SHELL基因的序列，設(shè)計了4對SNP引物。4對SNP引物以2個SNP位點(diǎn)設(shè)計，每個SNP位點(diǎn)設(shè)計2對SNP標(biāo)記，并均在引物3′端第二位引入強(qiáng)錯配堿基。以2份薄殼種油棕材料和2份厚殼種油棕材料DNA為模板，擴(kuò)增篩選油棕SHELL基因SNP引物。通過PCR擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)，設(shè)計的SHELL基因特異SNP標(biāo)記EgSh（N）-f/EgSh（SNP）-2r能夠鑒別油棕厚殼種和薄殼種。再用24株油棕樹進(jìn)行特異性驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記能較準(zhǔn)確地判斷油棕的厚薄殼。該研究結(jié)果表明SNP標(biāo)記EgSh（N）-f/EgSh（SNP）-2r可用來進(jìn)行油棕種質(zhì)資源早期分子鑒定，為高產(chǎn)油棕品種選育提供了技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞： 油棕， 種殼厚度， SHELL基因， 錯配堿基， SNP標(biāo)記

中圖分類號： Q949.9， S59

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

文章編號： 1000-3142（2018）02-0195-07

SNP markers development of SHELL controlling shell thickness in oil palm （Elaesis guineensis）

SHI Peng1， 2， XIA Wei3， XIAO Yong1， 2， WANG Yong1， 2， CAO Hongxing1， 2， LI Dongxia1， 2， LEI Xintao1， 2*

（ 1. Coconut Research Institute， Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Wenchang 571339， Hainan， China； 2. Hainan Key Biological Laboratory of Tropical Oil Crops， Wenchang 571339， Hainan， China； 3. Hainan University， Haikou 570228， China ）

Abstract： Oil palm （Elaeis guineensis ） belongs to palmae perennial woody oil crop， known as “oil king of the world”， and its fruit oil content is up to 50%. Fruit of oil palm consists of exocarp， mesocarp， endocarp （shell） and seed， mesocap and seed is the resource of oil， and shell thicknees play an important role in fruit oil content. SHELL gene controls the shell thickness， which is a kind of MADS-box homologous gene. Moreover， variation of SHELL between dura and pisifera is mainly two SNP loci in the first exon. Specific markers were developed according to two SNP loci， in order to evaluate germplasm resources of oil palm early. Four SNP markers were designed according to SHELL gene sequence. Four pairs of SNP primers were designed with two SNP loci， which existed strong mismatch base in the second position from 3′-end respectively. Four pairs of SNP primers were amplified in two tenera palms and two dura palms to screen effective primers. PCR result showed that SNP marker EgSh（N）-f/EgSh（SNP）-2r was able to identify dura and tenera palms effectively. Verification experiment using 24 plants revealed that this marker could accurately determine the shell thickness of oil palm. In this study， results showed that SNP marker EgSh（N）-f/EgSh（SNP）-2r might be used for early molecular identification， which would provide technical support for high yield breeding of oil palm.

Key words： oil palm， shell thickness， SHELL gene， mismatch bases， SNP markers

油棕（Elaeis guineensis）是棕櫚科油料作物，其生產(chǎn)的棕櫚油和棕櫚仁油應(yīng)用廣泛（Cornelius，1977；李瑞等，2009）。近年來，受益于全球食用油需求的迅猛增長和油棕種植面積的快速擴(kuò)張，棕櫚油和棕櫚仁油產(chǎn)量達(dá)到4 500萬t，占世界食用植物油產(chǎn)量的32%（Murphy，2009）。在2006年，就超越大豆，成為全球最重要的油料作物。然而，隨著油棕種植面積的快速擴(kuò)大，造成熱帶雨林生物多樣性降低等生態(tài)危機(jī)也越來越嚴(yán)重（Wilcove & Koh，2010；Foster et al，2011；Koh & Wilcove，2008；Koh et al，2011）。在全球食用植物油需求繼續(xù)增加，油棕種植面積不能繼續(xù)擴(kuò)大的前提下，提高油棕單位面積產(chǎn)油量是實(shí)現(xiàn)這些目標(biāo)的唯一途徑。油棕產(chǎn)油部分主要是果實(shí)，所以果實(shí)的含油量是影響單位面積含油量的重要因素。

在非洲油棕進(jìn)化和育種過程中一個關(guān)鍵的事件就是包裹種仁的厚種殼消失?，F(xiàn)在的非洲油棕有三種果實(shí)類型，厚殼型（dura），無殼型（pisifera）和薄殼型（tenera），其中薄殼種是厚殼種和無殼種的雜交種（Corley & Tinker，2007）。薄殼種油棕產(chǎn)油量高于厚殼種，是東南亞地區(qū)商業(yè)棕櫚油生產(chǎn)的主要來源。Singh et al（2013a）通過測序進(jìn)行同源定位，確定了控制油棕種殼厚度的基因是擬南芥中控制子房形成和種子發(fā)育的MADS-box基因STK的同源基因SHELL。這個基因控制著油棕最重要的經(jīng)濟(jì)性狀，用其選育的薄殼種油棕也對全球食用油生產(chǎn)，生物能源和熱帶雨林保護(hù)產(chǎn)生有利影響。

油棕果實(shí)由四部分組成：外果皮、中果皮、內(nèi)果皮（種殼）和種仁。內(nèi)果皮發(fā)育成熟后形成類似椰子殼的纖維環(huán)，薄殼種油棕正是因?yàn)槠浞N殼薄而獲得更高的產(chǎn)油量。控制這種性狀的SHELL基因是共顯性單基因遺傳。利用厚殼種與無殼種培育優(yōu)良的薄殼雜交種顯然是進(jìn)行油棕常規(guī)育種的重要途徑，然而僅僅依靠人工去鑒別育種親本的類型顯得費(fèi)時費(fèi)力，延長了育種周期，而且還不準(zhǔn)確（Mathews et al，2008）。因此利用分子標(biāo)記輔助育種成為了培育高產(chǎn)薄殼油棕的新途徑。

單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms， SNP）是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。SNP大多是雙等位基因，共顯性遺傳（Krawczak， 1999；Xing et al， 2005）。目前它已經(jīng)作為新一代分子標(biāo)記，在分子遺傳學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用（Liu et al，2012）。在植物分子生物學(xué)研究中，SNP標(biāo)記已經(jīng)受到各國學(xué)者的高度重視，目前在水稻、番茄、土豆、玉米、油菜和棉花等糧食和經(jīng)濟(jì)作物中開展了SNP研究（楊廣闊等，2014；Hayashi et al，2004；姚祝平等，2015；Sattarzadeh et al，2006；樂素菊等，2012；孫妍妍等，2015；匡猛等，2016）?；谄胀≒CR技術(shù)的SNP標(biāo)記開發(fā)具有低成本和便捷的優(yōu)勢，利用SNP標(biāo)記對油棕進(jìn)行輔助育種培育薄殼雜交種油棕開辟了一條新途徑。本研究以2份薄殼種油棕和2份厚殼種油棕為實(shí)驗(yàn)材料，以SHELL基因?yàn)槟０彘_發(fā)了4對SNP標(biāo)記，為油棕種殼厚度基因SHELL的分子標(biāo)記輔助育種奠定了良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)材料取自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所椰子大觀園，薄殼種油棕材料編號：B1、B2；厚殼種油棕材料編號：H4、H5。來自?？谌妥鼗氐?4株油棕單株為隨機(jī)選取，編號為1-24。

1.2 方法

1.2.1 油棕種殼類型鑒定 取油棕單株上所結(jié)成熟油棕果實(shí)，用園藝專用剪刀剪開果實(shí)，用游標(biāo)卡尺測量種殼厚薄，小于1 mm并且大于0 mm的認(rèn)定為薄殼種，大于3 mm認(rèn)定為厚殼種。

1.2.2 DNA的提取 取實(shí)驗(yàn)材料各單株油棕葉片1～2片，將其裝入取樣袋中，寫明編號，用液氮速凍后備用。采用CTAB小樣提取法（周麗霞等，2013）對油棕材料進(jìn)行DNA提取。用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA是否降解，用Nano Drop 2000測定DNA的濃度，其后將所有材料的DNA用滅菌ddH2O稀釋到50 ng·μL-1備用。

1.2.3 引物設(shè)計 利用Primer primer 5和在線引物設(shè)計軟件Primer 3（http：//bioinfo.ut.ee/primer3/），以SHELL基因序列設(shè)計了4對SNP引物，本實(shí)驗(yàn)針對86 bp處的T-C轉(zhuǎn)換和93 bp處的A-T顛換設(shè)計引物（表1）。其中，EgSh（L）-f和EgSh（P）-f為T-C轉(zhuǎn)換處的正向引物；EgSh（K）-f和EgSh（N）-f為A-T顛換處的正向引物，EgSh（SNP）-2r為這4個引物的通用反向引物。

1.2.4 PCR擴(kuò)增和電泳檢測 PCR反應(yīng)體系（20 μL）：5 μL模板DNA，2 μL 10×Taq Buffer，1.6 μL Mg2+，0.4 μL dNTP，0.3 μL Taq DNA聚合酶，8.7 μL ddH2O，1 μL正向引物，1 μL反向引物。PCR程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠成像系統(tǒng)下檢測拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 油棕種殼類型及SHELL基因變異

油棕種殼共有3種類型，厚殼、薄殼和無殼，本研究中利用收集到的厚殼種與薄殼種油棕種質(zhì)資源來設(shè)計和鑒定引物。SHELL基因已經(jīng)測序（Singh et al， 2013a），分析表明在SHELL基因第一個外顯子86 bp和93 bp處各有一個SNP位點(diǎn)。其中86 bp處為C/T堿基轉(zhuǎn)換，93 bp處為A/T堿基顛換（圖1）。

2.2 等位基因PCR引物設(shè)計與篩選

為了提高引物特異性，該實(shí)驗(yàn)中分別在4條正向引物3′端的第二個堿基位置引入強(qiáng)錯配堿基，并檢測它們的擴(kuò)增情況。實(shí)驗(yàn)中以B1、B2、H4和H5為材料進(jìn)行引物篩選，通過篩選來確定這4對引物是否為等位基因的特異引物。引物EgSh（L）-f和EgSh（P）-f為針對86 bp處SNP位點(diǎn)設(shè)計的正向引物，EgSh（L）-f為與厚殼基因型相匹配的正向引物，EgSh（P）-f為與薄殼基因型相匹配的正向引物，同時在EgSh（L）-f和EgSh（P）-f的3′端第二位均引入C/T堿基錯配；引物EgSh（K）-f和EgSh（N）-f為針對93 bp處SNP位點(diǎn)設(shè)計的正向引物， EgSh （K）-f為與厚殼基因型相匹配的正向引物，

EgSh（N）-f為與薄殼基因型相匹配的正向引物，同時在EgSh（K）-f和EgSh（N）-f的3′端第二位也均引入A/G強(qiáng)錯配堿基。

四對引物分別在兩個薄殼種油棕B1和B2，兩個厚殼種油棕H4和H5中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測。結(jié)果顯示，標(biāo)記EgSh（N）-f/EgSh（SNP）-2r在薄殼種中條帶亮，而在厚殼種中沒有檢測到PCR產(chǎn)物，說明該標(biāo)記能夠區(qū)分開厚殼種和薄殼種（圖2）。而其它三對標(biāo)記均不能區(qū)分薄殼種和厚殼種，所以只有標(biāo)記EgSh（N）-f/EgSh（SNP）-2r可以用于進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.3 SNP標(biāo)記驗(yàn)證

取?？谌妥鼗?4株油棕單株的葉片，同時對這些單株上的成熟果實(shí)進(jìn)行種殼厚度測量并記錄。之后提取葉片DNA，用特異引物EgSh（N）-f和EgSh（SNP）-2r做PCR擴(kuò)增。在瓊脂糖凝膠上電泳，結(jié)果顯示所有已知為薄殼種油棕的單株，能夠擴(kuò)增出亮或較亮的目標(biāo)條帶，而已知為厚殼種油棕的單株則無亮條帶或較弱（圖3）。結(jié)果表明，EgSh（N）-f和EgSh（SNP）-2r標(biāo)記基本可以用于油棕種殼類型前期分子鑒定。

3 討論與結(jié)論

根據(jù)公布的SHELL基因序列和SNP變異位點(diǎn)，增加引物3′端第二位錯配堿基，設(shè)計了4對SNP標(biāo)記。在已知種殼厚薄的4份油棕葉片DNA中進(jìn)行篩選，初步發(fā)現(xiàn)標(biāo)記EgSh（N）-f/EgSh（SNP）-2r可以區(qū)分厚殼種和薄殼種。隨后用該標(biāo)記在24份油棕種質(zhì)資源中擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)該標(biāo)記鑒定結(jié)果與實(shí)際種殼厚薄情況基本一致，標(biāo)記EgSh（N）-f/EgSh（SNP）-2r可以用于油棕種殼厚薄早期分子鑒定。

油棕種殼厚度與果實(shí)含油量關(guān)系密切，受母本基因型控制。在油棕雜交育種過程中，如果能對雜交后代進(jìn)行早期鑒定，將會極大減少優(yōu)良子代篩選的工作量和時間。早期有人尋找與油棕種殼厚度連鎖的SSR等分子標(biāo)記，但是準(zhǔn)確度有限。隨著油棕基因組測序完成，控制種殼厚度的SHELL基因序列被公布，使得開發(fā)更精確的SNP標(biāo)記成為可能。本研究結(jié)合前人研究成果，在引物3′端引入強(qiáng)錯配堿基的方法，獲得較好的特異性擴(kuò)增結(jié)果。理論上，引物3′末端堿基與模板互補(bǔ)才會在適合的條件下發(fā)生延伸，但是在實(shí)際PCR擴(kuò)增過程中，3′末端單個堿基的錯配不能阻止擴(kuò)增延伸，因此在特異引物3′端第二位引入錯配堿基就可以提高引物的特異性（Ye et al，2001；張育垚等，2012；黃代新等，2005）。強(qiáng)堿基錯配類型為C/T和G/A；中等堿基錯配類型為A/A、C/C、G/G、T/T；弱堿基錯配類型為C/A和G/T。因此，該實(shí)驗(yàn)中為了獲得較好的特異擴(kuò)增效果，在引物3′端第二位上引入了C/T和A/G強(qiáng)錯配堿基。

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，該標(biāo)記能夠初步用于油棕厚殼種和薄殼種的分子鑒定。目前，分子標(biāo)記輔助選擇已經(jīng)在包括橡膠和木薯等熱帶作物得到應(yīng)用，相比之下，油棕分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)的應(yīng)用還比較滯后（鄭燕梅等，2013；周龍華和蔣立希，2016）。多態(tài)性豐富，遺傳穩(wěn)定性高的SNP標(biāo)記作為第三代分子標(biāo)記，便于應(yīng)用普通PCR技術(shù)進(jìn)行檢測，在油棕等木本作物中應(yīng)用前景廣闊。國外很早就有油棕種殼厚度控制基因SHELL的相關(guān)研究報道，但直到2013年，隨著油棕全基因組序列測序完成，SHELL基因的全部序列才得以公布，為本研究中SNP標(biāo)記開發(fā)奠定了基礎(chǔ)（Singh et al，2013b）。本研究利用最新公布的SHELL基因序列設(shè)計分子標(biāo)記，所開發(fā)的SNP標(biāo)記具有一定的穩(wěn)定性和可靠性，這將為油棕種殼厚度控制基因SHELL的分子標(biāo)記輔助育種提供有效的工具。下一步將收集無殼種油棕資源，設(shè)計能同時鑒定無殼種、厚殼種和薄殼種油棕的SNP分子標(biāo)記。

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