陳鐵樓， 江一峰， 張新海， 陳 駿， 黃傳梅， 王曉熙

(1. 海軍軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院全軍口腔中心牙周科,上海 200081； 2. 海軍軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院精準醫(yī)學中心,上海 200081；3. 海軍軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院病理科,上海 200081)

富血小板纖維蛋白(platelet rich fibrin, PRF)為第二代血小板濃縮物，與第一代的富血小板血漿(platelet-rich plasma, PRP)相比，其制備方法簡單，不需要添加抗凝劑，只需一次離心即可得到，離心后介于上清液與紅細胞之間的纖維蛋白凝膠即為PRF[1]。Dohan等[2]發(fā)現(xiàn)，PRF中含大量血小板，激活后可釋放生長因子發(fā)揮生物學作用，這些生長因子包括血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)、血小板源性生長因子(platelet derived growth factor, PDGF)等。研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，PRF可促進骨再生，對骨缺損修復和軟組織愈合有一定作用。PRF來源于自體血液，避免了移植時交叉感染的發(fā)生。但目前對PRF形態(tài)學超微結(jié)構(gòu)及其意義未見報道，因此本研究對此進行了深入探討，為PRF在骨缺損修復中的基礎(chǔ)研究和臨床應用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗對象

取10名健康志愿者(男性6名，女性4名，海軍軍醫(yī)大學附屬長海醫(yī)院職工和實習生)，年齡22～50歲，平均年齡(30.20±1.22)歲，靜脈血血小板計數(shù)>100×109/L。采血前1周不吸煙、不喝酒，采血前3個月未服用任何影響血小板功能和調(diào)節(jié)免疫的藥物，所有志愿者知情并同意采血用于本試驗。

1.2 主要材料和儀器

無抗凝劑真空采血管購自中國武漢致遠醫(yī)療科技有限公司；湘儀L500醫(yī)用離心機購自中國長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機儀器有限公司；BC-5380 Mindray全自動血液細胞分析儀購自中國深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司；Olympus CX31光學顯微鏡購自日本Olympus公司；S3400N掃描電鏡購自日本HITACHA公司；JEM-1230透射電鏡購自日本電子株式會社。

1.3 PRF制備方法

用真空玻璃管抽靜脈全血5mL，立即放于離心機中離心(離心半徑10cm，3000r/min，離心10min)，靜置3～5min[1]，此時離心管內(nèi)分為3層，最上層為上清液，最下層為紅細胞，中間為淡黃色凝膠層即為PRF。用無菌鑷子取出保留紅色末端的PRF凝膠分別用10%甲醛固定和4%多聚甲醛固定用于實驗。另采集2mL靜脈血置于含肝素抗凝管中，用全自動血細胞分析儀測定血常規(guī)。因PRF制備中不含抗凝劑，血液一旦接觸離心管即開始凝集，要求快速采血并立即離心[5]。

1.4 PRF光學顯微鏡觀察

用10%甲醛固定PRF,乙醇梯度脫水，沿組織長軸方向用石蠟包埋后切成厚約5μm切片，常規(guī)H-E染色和瑞士-吉姆薩染色，光學顯微鏡下觀察PRF結(jié)構(gòu)并拍照。

1.5 PRF掃描電子顯微鏡觀察

4%多聚甲醛固定PRF 2h，浸泡0.1mol/L PBS中24h，用PBS漂洗PRF 6min，共5次(pH=7.2)；30%、50%、70%、90%的丙酮各脫水30min,再用100%丙酮脫水10min，共3次，CO2臨界點干燥，金離子濺射法鍍膜，S-3400N掃描電子顯微鏡觀察并采集圖像。

1.6 PRF透射電子顯微鏡觀察

4%多聚甲醛固定PRF 2h；浸泡于0.1mol/L PBS中24h，以0.1mol/L的PBS漂洗6min共5次，加入1%鋨酸固定2h，用PBS漂洗6min共5次，分別用30%、50%、70%、90%的丙酮梯度脫水30min,用100%丙酮10min 3次，用環(huán)氧丙烷和EPON以3∶7比例滲透2h,以7∶3比例滲透過夜，用100%的EPON滲透2h,用EPON包埋液在60℃聚合48h，用德國LKB8870超薄切片機切片，厚度500nm,醋酸鈾染10min，鉛染8min, JEM-1230透射電子顯微鏡觀察并拍照[6]。

2 結(jié) 果

2.1 所選志愿者個人特征和主要血液指標

在10名志愿者中，年齡<35歲者占80%，>50歲1名，三酰甘油高；本科以上占70%，吸煙者占20%。所選人群白細胞平均值為(6.29±0.54)×109/L,紅細胞為(4.78±0.22)×1012/L，血小板為(201.7±5.16)×109/L，見表1。

表1 10例志愿者主要血液指標Tab.1 Main blood indexes of donors

2.2 大體觀察

PRF為淡黃色半透明纖維蛋白凝膠，5mL血液得到PRF約1.5cm×0.8cm×0.8cm,有彈性且質(zhì)韌，表面光滑，見圖1。

圖1 PRF的制備Fig.1 Platelet rich fibrin productionA： 全血離心分為3 層，中間淡黃色層為PRF凝膠；B： 取出的PRF

2.3 光鏡觀察 H-E和吉姆薩染色結(jié)果

PRF含大量紅細胞和藍染細胞核的白細胞鑲嵌在膠原纖維之中，膠原纖維為均一淡紅色，見圖2A。油鏡見在近細胞端纖維排列較致密，含大量血小板，見圖2B；在遠離細胞一端淡紅的纖維排列為較疏松網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，血小板較少，見圖2C。

吉姆薩染色見膠原纖維排列為淡藍色的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，近細胞端見深藍色的白細胞；遠離細胞區(qū)為無細胞網(wǎng)狀膠原纖維,見圖3。

2.4 SEM觀察結(jié)果

PRF中膠原纖維聚集成疏松多孔立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，含大量血小板，部分血小板伸出多個偽足，見白細胞散在分布；遠端膠原纖維排列成網(wǎng)狀立體支架結(jié)構(gòu)中血小板和白細胞少，見圖4。

圖2 PRF的H-E染色結(jié)果Fig.2 H-E staining results of PRFA： 在紅細胞上部為藍染核的白細胞，再上部為膠原纖維(×400);B： 在網(wǎng)狀排列的纖維中有血小板(×1000)；C： 排列稀疏的纖維中血小板少(×1000)

圖3 PRF的吉姆薩染色結(jié)果Fig.3 Gimsa staining results of PRFA： 近細胞端在墨綠色的紅細胞上部為白細胞，淡藍的為膠原纖維；B： 遠離細胞端為藍色無細胞網(wǎng)狀膠原纖維(×400)

圖4 PRF的SEM觀察Fig.4 PRF observation by SEMA： 網(wǎng)狀纖維之間大量血小板(×3000)；B： 大量血小板位于膠原纖維之間，左下角見激活血小板(×5000)

2.5 TEM觀察結(jié)果

PRF中血小板處于靜止或激活狀態(tài)，使α-顆粒釋放于細胞間隙或纖維之間，在細胞之間有高密度的顆粒樣物為血小板釋放的顆粒，見圖5。

圖5 PRF的TEM觀察Fig.5 PRF observation by TEMA： 白細胞周圍可見血小板及顆粒樣物質(zhì)(×10000)；B： 血小板部分激活，部分靜止，顆粒樣物位于血小板內(nèi)或細胞之間(×6000)

3 討 論

近年來，對自體血液成分處理對手術(shù)中血液保護作用及與再生醫(yī)學關(guān)系有許多研究報道[1-5，7]。2010年，Dohan等[8]報道，PRF中血小板釋放生長因子可促進細胞增殖和分化，對血管再生和骨缺損修復有一定作用。而血小板釋放生長因子需要血小板活化來完成，血小板活化是細胞膜受外界刺激，膜受體活化胞內(nèi)鈣釋放，引起構(gòu)型改變。PRF移植后血小板激活主要靠機體自身使血小板碎裂完成對生長因子釋放。PRF在離心時自體凝血酶使纖維蛋白原凝結(jié)為疏松纖維蛋白，并聚集了大量白細胞和血小板[1-3]。對PRF提取方法，程亞楠等[9]發(fā)現(xiàn)在2500r/min與3000r/min 離心時，可制備出理想的PRF。本研究用3000r/min離心成功制備了PRF，對其形態(tài)學研究發(fā)現(xiàn)，PRF的纖維蛋白排列成疏松立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，并聚集了大量血小板，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)血小板激活伸出突起，活化的血小板內(nèi)α-顆粒釋放到細胞和纖維之間形成密集區(qū)，與Dohan等[2]報道一致。

本研究通過光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，PRF含有大量白細胞，使其有抗感染和免疫功能。Dohan等[3]報道，PRF析出液中有5種免疫因子，分別為IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-4和VEGF，PRF中白細胞可通過分泌細胞因子發(fā)揮止血和炎癥反應。電鏡證實PRF的多孔疏松纖維網(wǎng)狀支架結(jié)構(gòu)與人的天然組織結(jié)構(gòu)相似，在組織再生中發(fā)揮支架作用，有利于新生細胞遷移長入和增殖[1]。從本研究可知，PRF兩端結(jié)構(gòu)有一定差異，在行PRF移植時選取上端無細胞區(qū)域時，其作用來自于纖維支架結(jié)構(gòu)；若選取下端富含細胞區(qū)域移植時其作用來自于PRF的網(wǎng)狀支架及其中血小板釋放生長因子的聯(lián)合作用。Tayapongsak等[10]在下頜骨重建時發(fā)現(xiàn)，在骨移植初期移植物內(nèi)細胞營養(yǎng)物質(zhì)的攝入主要靠彌散完成。因此在PRF移植時纖維蛋白網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)可使營養(yǎng)成分及氧氣彌散至細胞周圍，利于骨髓干細胞分化為成骨細胞形成新骨,加速組織再生[11]。

對PRF形態(tài)學超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，PRF中血小板伸出多個突起的過程就是血小板激活的過程，α-顆粒性物質(zhì)釋放其實就是生長因子分泌的過程，細胞因子分泌后位于立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中對新生細胞遷延有重要意義。研究[12-13]發(fā)現(xiàn)，PRP聯(lián)合生物活性玻璃可促進牙周骨缺損修復，PRP聯(lián)合多孔礦化骨對下頜雙皮質(zhì)骨缺損修復有明顯促進作用，且主要發(fā)生在PRP移植的早期階段。PRP作用的發(fā)揮與實驗中所用的凝血酶有關(guān)，血小板中α-顆粒內(nèi)生長因子短時間內(nèi)大量釋放，引起骨髓干細胞數(shù)量短期內(nèi)迅速上升而發(fā)揮作用。Marx等[14]發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷部位血小板可存活5d，后期作用主要依賴于新生骨髓干細胞通過刺激機體自身繼續(xù)產(chǎn)生生長因子發(fā)揮作用。Lundquist等[15]發(fā)現(xiàn)，用胰蛋白酶處理PRF可持續(xù)釋放生長因子和抵抗內(nèi)源性纖維蛋白酶的蛋白降解作用，可見PRF緩慢釋放生長因子與其纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中血小板逐漸激活有關(guān)。PRF中與纖維蛋白緊密接觸的血小板外膜結(jié)構(gòu)部分消失，可能與PRF中未加抗凝劑，纖維蛋白原與血小板表面受體結(jié)合產(chǎn)生生物學效應有關(guān)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，PRF中血小板有的α-顆粒未被釋放，被網(wǎng)狀纖維緊緊包裹，這些纖維對血小板激活起保護作用，隨著纖維蛋白逐漸降解，血小板激活釋放生長因子于纖維蛋白支架中，受膠原纖維保護抵抗蛋白降解，延長了生長因子效應時間。

綜上所述，PRF為獨特三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，富含血小板和生長因子，為種子細胞提供天然支架和生長環(huán)境，且制備簡單，是組織再生良好的支架材料，可作為支架材料單獨或聯(lián)合用于骨缺損修復。但PRF生物學作用尚需進一步研究。