葛菲菲，李 鑫，劉 健，鞠厚斌，楊德全，王 建，周錦萍

（上海市動物疫病預防控制中心，上海 201103）

豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）是圓環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬的重要成員之一。該病毒包括2個基因型：1型和2型，即PCV1和PCV2[1]。PCV1是從豬腎上皮細胞（PK15）中分離出來的非致病性病毒粒子[2]，而PCV2則是目前對全世界養(yǎng)豬業(yè)危害極大的病原體之一，給全球養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失[3]。2015年6月，美國北卡羅來納州一個商品豬場母豬群暴發(fā)皮炎腎病綜合征（porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS）。發(fā)病期間，該場母豬死亡率較歷史平均水平增加了10.2%，受胎率減少了0.6%，窩均木乃伊胎相比歷史平均水平增加1.19%，流產(chǎn)出的木伊胎大小不一。針對樣本采用宏基因組測序后，發(fā)現(xiàn)1種基因型不同以往的圓環(huán)病毒，命名為PCV3[4]。何啟蓋等[5]開展我國PCV3臨床調(diào)查，發(fā)現(xiàn)PCV3與母豬繁殖障礙疾病相關(guān)聯(lián)，在我國8個省及1個直轄市均有分布。對PCV3全基因組及部分基因組序列進化分析表明，我國PCV3包括2個亞群：3a及3b，其中3a和美國參考PCV3/USA/MO2015（GenBank登錄號：KX778720.1）毒株處于同一分支，具有很近的同源進化關(guān)系。本研究選取了2016年3月～2017年3月在上海市規(guī)?；B(yǎng)殖場采集的商品肉豬20份病料，進行豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV）、豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）、豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）、豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）、豬細小病毒（Porcine parvovirus，PPV）、豬乙腦病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）和豬圓環(huán)病毒3型（Porcine circovirus type 3，PCV3）等病原體檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 2016年3月～2017年3月年采集自上海市規(guī)?；B(yǎng)殖場的商品肉豬病料20份。

1.1.2 試劑 核酸提取試劑盒為MagPure Viral RNA KIT；豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬圓環(huán)病毒2 型、豬偽狂犬病毒、豬瘟病毒熒光PCR試劑由北京生科尚儀科技有限公司提供；豬細小病毒、豬乙腦病毒熒光PCR試劑由廣州維伯鑫生物科技有限公司提供。

1.2 病料核酸的提取 稱取25 mg病料組織，加入1 mL無菌PBS研磨，5000×g離心1 min，棄掉上清。總核酸的分離純化按照磁珠法病毒RNA抽提試劑盒操作手冊進行。

1.3 熒光PCR檢測 PRRSV、PCV2、PRV、CSFV、PPV、JEV熒光PCR檢測方法均按照試劑盒說明書進行。

1.4 PCV 3的檢測 引物設(shè)計參考文獻[5]。

1.5 病毒分離 對PCV3檢測陽性樣品進行病毒分離。將樣品接種于長成單層的PK15細胞，吸附1～2 h，棄去液體，加入10 mL病毒維持液（DMEM+2%FBS），于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)4～5 d，每天觀察細胞變化。如無病變則于培養(yǎng)后的4～5 d收取上清，傳代至第3代仍無病變判為陰性；如出現(xiàn)病變則凍融3次細胞收毒，-30℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 基因cDNA核苷酸序列分析比較 借助DNA Star4.0分析軟件，通過Jotun Hein方法分析比較所得序列的同源性。

1.7 繪制系統(tǒng)發(fā)育樹 借助MEGA3.1分析軟件，確定獲得毒株基因的遺傳進化情況。

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測結(jié)果 20份病料中只有1份病料PCR檢測出PRRSV陽性，PCV2、PRV、CSFV、PPV、JEV均為陰性；2份病料呈PCV3陽性，其中1份為PCV3和PRRSV混合感染。這2份病料均為2016年7月采集，PCR檢測結(jié)果見圖1，產(chǎn)物大小與參考文獻[3]報道一致，約為649 bp。全基因PCR擴增結(jié)果詳見圖2，產(chǎn)物大小與參考文獻[5]報道一致，分別為1075 bp和1257 bp。

2.2 病毒分離 對PCV3陽性樣品在PK15細胞上進行了病毒分離，在PK15細胞上盲傳至第3代后，經(jīng)PCR鑒定未分離到PCV3。

圖1 PCV3 PCR檢測結(jié)果Fig.1 Detection result of PCV3 by PCR

圖2 PCV3全基因PCR擴增結(jié)果Fig.2 Amplification of PCV3 whole genome by PCR

1: nt1120～2195 PCR擴增產(chǎn)物; 2: nt1～1257 PCR擴增產(chǎn)物; M:DNA 分子量標準(DL2000)1: nt1120-2195 PCR products; 2: nt1-1257 PCR products; M:DNA Marker(DL2000)

2.3 基因同源性以及進化關(guān)系分析 將2份PCV3陽性樣品分別命名為PCV3/CHN/Shanghai/0706/2016（GenBank登錄號：KY865242）和PCV3/CHN/Shanghai/0708/2016（GenBank登錄號：KY865243），他們與中國來源的PCV3分離株（全基因GenBank登錄號：KY075986.1～KY075994.1、囊膜蛋白GenBank登錄號：KY075995.1 ～KY076027.1）以及美國PCV3/USA/MO2015株（GenBank登錄號：KX778720.1）的全基因以及囊膜蛋白的核苷酸同源性分別為98.8%～99.1%和97.5%～98.9%；本研究中的PCV3/CHN/Shanghai/0706/2016、PCV3/CHN/Shanghai/0708/2016株與中國來源的PCV3分離株全基因以及囊膜蛋白的核苷酸同源性分別為98.8%～100%和97.7%～100%。在全基因進化樹中，中國來源的PCV3毒株和美國PCV3/USA/MO2015株在同一群中（圖3A），在囊膜蛋白基因的進化樹中，本研究中的PCV3/CHN/Shanghai/0706/2016和PCV3/CHN/Shanghai/0708/2016株屬于PCV3a（圖3B）。

3 討論

本研究對2016年3月～2017年3月采集自上海市豬場20份病料進行病原體檢測，在2016年7月采集的2份流產(chǎn)胎兒中檢測到PCV3，這2份陽性樣本來源于不同的規(guī)?；i場。調(diào)查顯示，這2個豬場的流產(chǎn)比例在3%左右，木乃伊比例從2016年2月份的1.9%上升到3.5%，其他生產(chǎn)情況無明顯變化。說明PCV3可以發(fā)生垂直傳播，即病毒可以通過胎盤感染孕期胎豬[6]。其中1份陽性樣品為PCV3和PRRSV的混合感染。此外我們也嘗試了使用PK15細胞進行了PCV3的分離，結(jié)果未成功分離到PCV3，這和Palinski等[7]報道一致，在第1代細胞中PCV3 PCR檢測即為陰性，可能與樣品前處理過程有關(guān)。研磨病料時，加含抗菌素的PBS制成體積分數(shù)為20%的組織懸液，離心取上清后，再用0.2μm濾器過濾，最后感作PK15細胞，加入維持液培養(yǎng)，這樣的操作會導致病毒的稀釋。

根據(jù)部分囊膜蛋白基因序列進行基因進化分析，本研究中的PCV3/CHN/Shanghai/0706/2016和PCV3/CHN/Shanghai/0708/2016株屬于PCV3a?；蚪M全序列分析發(fā)現(xiàn)，PCV3基因組包含2 kb核苷酸，具有與PCV1和PCV2相似的基因組結(jié)構(gòu)，主要編碼Cap和Rep 2個蛋白。在cap和rep基因5'端包含有一個由9個堿基（TAGTATTAC）組成的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，其堿基組成與PCV1的莖環(huán)結(jié)構(gòu)上的序列完全一致。PCV3 Cap有214個氨基酸殘基，較PCV2 Cap少19～20個，此外，與PCV2和鴨圓環(huán)病毒相比，PCV3 cap基因相似性僅為36%～37%。PCV3 rep基因編碼297個氨基酸殘基，與GenBank數(shù)據(jù)庫其他毒株比較發(fā)現(xiàn)，該Rep氨基酸與先前在美國報道的1株P(guān)CV毒株（GenBank登錄號：ADU77001）具有較高的相似性（69.4%）；與我國分離到的蝙蝠圓環(huán)病毒的Rep相似性為54%。目前我們對于PCV3 的認識仍極為有限。展望未來，我們需要從以下幾個方面加強對PCV3的研究和探索：分離到PCV3 毒株并建立起細胞培養(yǎng)體系；開展動物回歸試驗；對PCV3 進行基礎(chǔ)的病原學研究。目前對PCV3 Cap結(jié)構(gòu)及抗原性分析發(fā)現(xiàn)，PCV2和PCV3表現(xiàn)出很大的差異[8]，推測PCV2和PCV3不具有交叉免疫保護的特性。因此，針對PCV3進行新的疫苗研究和開發(fā)，對于將來控制PCV3流行是十分必要的。

圖3 不同中國PCV3分離株全基因（A）和部分囊膜蛋白基因（B）的遺傳進化分析Fig.3 Phylogenetic trees of the whole genomes (A)and partial capsid genes (B) of PCV3