齊新永，鞠厚斌，葛菲菲，劉 健，楊德全，周錦萍，王 建

（上海市動物疫病預(yù)防控制中心，上海 201103）

偽狂犬病病毒（Psudorabies virus，PRV）屬于皰疹病毒科，但與其他皰疹病毒不同，其宿主范圍廣，包括牛、山羊、綿羊、豬、貓、狗等家畜和經(jīng)濟(jì)動物如狐、貂等35種動物。豬是偽狂犬病病毒的自然宿主和最常見的易感動物，仔豬主要以嘔吐、腹瀉、體溫升高、呼吸困難、神經(jīng)癥狀為特征，成年豬以流產(chǎn)、死胎、繁殖障礙為特征。除豬以外，其他動物都表現(xiàn)發(fā)熱、奇癢及腦脊髓炎的典型癥狀。目前偽狂犬病已經(jīng)發(fā)展成為一種世界范圍內(nèi)的疫病，每年給養(yǎng)豬業(yè)所造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)幾十億美元。2011 年以來，我國部分地區(qū)爆發(fā)豬偽狂犬病疫情，許多豬場免疫 Bartha-K61 疫苗后仍頻繁爆發(fā)此病[1-3]。對此次疫情的流行株研究發(fā)現(xiàn)，病毒的抗原性已發(fā)生了較大變異，流行株的主要保護(hù)性抗原基因 gB、gC、gD 和 gE 基因與以前報(bào)道的毒株相比發(fā)生了基因插入、缺失或點(diǎn)突變，被認(rèn)為是 PRV 變異株，并被劃分為基因 II 型譜系[4-6]。與傳統(tǒng)毒株相比，變異株對豬的致病力和在豬群中的傳播能力明顯增強(qiáng)[7]。其中g(shù)D糖蛋白為病毒增值所必需，介導(dǎo)病毒與靶細(xì)胞的穩(wěn)定結(jié)合，參與病毒感染的吸附和穿入過程[8]，同時(shí)gD糖蛋白也是 PRV 主要的免疫原性蛋白，能刺激動物機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，gD基因序列的變化可能會導(dǎo)致其功能結(jié)構(gòu)上的變化。本研究以上海市郊區(qū)某羊場發(fā)現(xiàn)的1例疑似綿羊偽狂犬病病例，對該疑似病例進(jìn)行了病毒分離鑒定，并對分離株gD基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序和核苷酸序列分析，旨在了解上海市綿羊偽狂犬病病毒的毒株來源和分子生物學(xué)特性，為羊偽狂犬病的防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病料樣品采集與處理 采集上海市郊區(qū)某羊場的病死羊腦組織，用滅菌剪刀剪碎，按1∶5的比例加入滅菌PBS，研磨后反復(fù)凍融3次，5000×g離心15 min，上清液保存在 -70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要細(xì)胞和試劑 BHK-21細(xì)胞株由上海市動物疫病預(yù)防控制中心保存；豬偽狂犬病病毒單抗由中國動物疫病預(yù)防控制中心饋贈；FITC-兔抗鼠IgG購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司；豬偽狂犬病病毒熒光定量PCR檢測試劑盒購自北京生科尚科技有限公司；pMD18-T Vector載體和感受體 E.coli JM109由本中心保存；Taq DNA 聚合酶購自大連TaKaRa公司；DNA Marker 和 DNA 提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司公司。

1.3 病毒分離與傳代 將保存的上清液解凍后加青霉素、鏈霉素各1000IU，37℃作用1 h后，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌。取1 mL 濾液接種于單層的 BHK-21細(xì)胞，盲傳3代，觀察細(xì)胞病變（cytopathic effect，CPE）。

1.4 病毒形態(tài)觀察 用移液器吸取解凍的第3代病毒細(xì)胞培養(yǎng)液滴在覆蓋有Formvar膜的銅網(wǎng)上，靜置1 min 左右，用濾紙從銅網(wǎng)的邊緣吸去液體。當(dāng)銅網(wǎng)上的樣品尚未完全干燥時(shí)即行染色，吸取 2% 磷鎢酸水溶液滴在銅網(wǎng)上，約3～5 min。用濾紙吸取染液，干燥后用 JEM-2100電鏡觀察病毒粒子的形態(tài)。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測 將出現(xiàn)細(xì)胞病變效應(yīng)（cytopathic effect，CPE）的BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)液反復(fù)凍融3次，再將細(xì)胞培養(yǎng)液分裝保存至-70℃?zhèn)溆?，采用PRV熒光定量PCR試劑盒對收獲的細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行PRV檢測。

1.6 間接免疫熒光抗體試驗(yàn)indirect（immunofluorescence assay，IFA） 取BHK-21細(xì)胞懸浮液2 mL加入腔式載玻片，于37℃、5%CO2溫箱中培養(yǎng)24 h；棄掉原細(xì)胞培養(yǎng)液，無菌PBS洗3次，再加入1 mL PCR檢測陽性的病毒液，37℃、5%CO2溫箱中作用1 h；吸掉病毒液，加入細(xì)胞維持液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄掉維持液，再用PBS洗3次，然后用預(yù)冷丙酮固定腔式載玻片上的細(xì)胞培養(yǎng)物，PBS洗滌3次，加入500 μL以1∶100稀釋的豬偽狂犬病病毒單抗，濕盒內(nèi)37℃孵育1 h，再用PBS洗滌3次后同F(xiàn)ITC標(biāo)記的兔抗鼠IgG抗體在37℃ 孵育30 min，最后用PBS洗滌3次，熒光顯微鏡下觀察。同時(shí)設(shè)置加入PBS的細(xì)胞培養(yǎng)物做陰性對照。

1.7 家兔接種試驗(yàn) 將盲傳3代的病毒細(xì)胞液稀釋至5×103.0TCID50/ mL，用于家兔攻毒試驗(yàn)。將家兔分為3組：頸部皮下注射組（3只）、滴鼻組（2只）、對照組（2只）。頸部皮下注射組和滴鼻組接種劑量均為0.2 mL，對照組注射生理鹽水 0.2 mL。攻毒后觀察家兔的發(fā)病情況并做好記錄。

1.8 基因引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù) GenBank 收錄的PRV Kaplan 株（GenBank登錄號：AJ271966.1），利用引物分析軟件Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)1對的特異性引物擴(kuò)增gD基因。P1：5'-ATTTGAATT CCCCAGGTTCCCATAC-3'；P2：5'-CTTGAAGC TTGGCAGAGGTCGTAC-3'。在上下游引物中分別引入 EcoRⅠ和Hind Ⅲ 酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為1579 bp。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。

1. 9 病毒DNA的提取及PCR擴(kuò)增 將分離株接種到BHK-21單層細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞病變達(dá)到約50%時(shí)收集細(xì)胞，參照 QIAGEN 公司病毒核酸提取試劑盒說明提取病毒核酸。利用上述引物擴(kuò)增gD基因片段。反應(yīng)總體積（50μL）：P1、P2引物各2 μL，2×GC Buffer25 μL，dNTP12.5 μL，DNA模板7.5 μL，Taq DNA 聚合酶1 μL。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min；95℃預(yù)變性50 s，58℃退火1 min，72℃延伸1.5 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.10 gD基因的克隆和測序 回收純化后的 DNA 片段，按照 pMD18-T Vector 載體系統(tǒng)操作手冊的方法連接到載體上，并轉(zhuǎn)化到 E.coli JM109 的感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，然后按常規(guī)方法涂含有Amp、IPTG 瓊脂平板上，挑取白色菌落，提取質(zhì)粒。用 EcoRⅠ和 HindⅢ酶切，電泳鑒定陽性重組質(zhì)粒。陽性重組質(zhì)粒送上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行序列測定。

1.11 gD基因的序列分析 應(yīng)用Lasergene v7.1 DNAStar 軟件對分離株的gD基因序列進(jìn)行分析。根據(jù) GenBank收錄的國內(nèi)外經(jīng)典的PRV毒株gD基因的核苷酸序列，以及上海市動物疫病預(yù)防控制中心2010～2015年間分離的PRV毒株gD基因的核苷酸序列構(gòu)建gD基因進(jìn)化樹。本地區(qū)參考毒株上海市動物疫病預(yù)防控制中心2010年以來從臨床病例中陸續(xù)分離鑒定并保存，毒株如下：SH-03-2010、SH-04-2010、SH-13-2012、SH-14-2012、SH-01-2013、SH-04-2013、SH-03-2014、SH-05-2014、SH-01-2015；GenBank 收錄的國內(nèi)外經(jīng)典的PRV毒株：FZ（中國/2005/FJ477296）、Ea（中國/1990/KU315430）、La（中國/年代不詳/ AY174090）、Hubei（中國/1998/AF092447）、Min-A（中國/2002/AY169694）、BJ/RD（中國/2013/KF017274）、HLJ8（中國/2013/KT824771）、HN1201（中國/2012/KP722022）、HNB（中國/2012/KP722022）、ZJ01（中國/2012/KM061380）、JS2012（中國/2012/KP257591）、Becker（USA/年代不詳/JF797219）、Kaplan（Hungary/年代不詳/KJ717942）、Bartha（Hungary/年代不詳/JF797217）、NIA3（United Kingdom/年代不詳/KU900059）、Hercules（Greece/2010/KT983810）、Namyangju（South Korea/1987/GQ325660）、Kolchis（Greece/2010/ KT983811）、Dul34gfp（Germany/年代不詳/JQ809329）、Dul34pass（Germany/年代不詳/ JQ809330）。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞病變觀察 BHK-21細(xì)胞接種病料12 h后出現(xiàn)空洞，細(xì)胞變圓，24 h出現(xiàn)明顯的拉網(wǎng)病變，48 h細(xì)胞脫落（圖1A）。陰性對照的BHK-21細(xì)胞界限明顯, 大小均一，呈均勻致密的單層（圖1B）。

圖1 BHK-21 細(xì)胞接種病料后出現(xiàn)的細(xì)胞病變（200×）Fig.1 Cytopathic effect of BHK-21 cells inoculated with tissue samples（200×）

2.2 電鏡觀察結(jié)果 將分離株細(xì)胞培養(yǎng)液滴在Formvar膜的銅網(wǎng)上負(fù)染后，在電鏡下觀察到大小約150 nm左右、圓形有囊膜的病毒顆粒（圖2），囊膜表面有呈放射狀排列的纖突，其長度約6 nm 左右。

2.3 間接免疫熒光抗體試驗(yàn)結(jié)果 病料接種BHK-21細(xì)胞，IFA 檢測結(jié)果顯示，細(xì)胞的胞漿和胞核呈現(xiàn)明顯的特異熒光（圖3A），證明病毒液接種細(xì)胞能與 PRV 單抗特異性結(jié)合，進(jìn)一步證實(shí)所分離的病毒為偽狂犬病病毒，并將其命名為SH1311毒株；未接種的BHK-21 細(xì)胞未見綠色熒光（圖3B）。

圖2 病毒粒子的電鏡觀察（Bar=50 nm）Fig.2 The morphology of virus particles under electron microscope（Bar=50 nm）

圖3 接種病料的BHK-21細(xì)胞的IFA檢測（200×）Fig.3 IFA result of BHK-21 cells inoculated with tissue samples（200×）

2.4 熒光定量PCR檢測結(jié)果 對2份BHK-21細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行偽狂犬病病毒熒光定量PCR檢測，均呈現(xiàn)陽性信號，見圖4。

圖4 細(xì)胞培養(yǎng)物熒光定量PCR檢測結(jié)果Fig.4 qPCR results of BHK-21 cell cultures

2.5 家兔接種試驗(yàn)結(jié)果 將盲傳 3 代的病毒細(xì)胞液通過頸部皮下注射和滴鼻接種家兔。48 h后均發(fā)病，表現(xiàn)為精神沉郁、食欲減退、呼吸加快，并出現(xiàn)局部奇癢癥狀，用力撕咬接種點(diǎn)，引起局部脫毛、皮膚破損出血。嚴(yán)重者出現(xiàn)角弓反張，4～6 h后病兔衰竭死亡。對照組家兔無任何異常表現(xiàn)。

2.6 SH1311 分離株gD基因的擴(kuò)增 以在BHK-21細(xì)胞上培養(yǎng)的SH1311分離株細(xì)胞液所提取的基因組 DNA為模板，進(jìn)行g(shù)D基因PCR鑒定。擴(kuò)增產(chǎn)物大小與預(yù)期片段1579 bp相符（圖5）。

圖5 SH1311分離株gD基因的PCR鑒定Fig.5 PCR amplification for gD gene of SH1311 strain

2.7 gD基因的DNA克隆測序 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物克隆至pMD18-T Vector 載體，對重組質(zhì)粒進(jìn)行EcoRⅠ和Hind Ⅲ 雙酶切鑒定，證明載體插入了目的基因。對重組質(zhì)粒雙向測序結(jié)果顯示，該序列全長1579 bp，包含一個(gè)完整的開放閱讀框，為1209 bp，G+C含量為74.77%，編碼402個(gè)氨基酸組成的多肽。

2.8 gD基因核苷酸序列分析 應(yīng)用Lasergene7.0軟件中的MegAlign將 SH1311分離株和上海市2010～2015年分離的9株 PRV毒株gD核苷酸序列以及 GenBank上已登錄的國內(nèi)外其他21株P(guān)RV的相應(yīng)序列進(jìn)行比對分析。結(jié)果顯示，SH1311分離株與上海市2012～2015年分離的7株 PRV gD 核苷酸序列均為1209 bp，編碼402 個(gè)氨基酸殘基，同源性為99.8%～100%，其中與SH-01-2013株、SH-05-2014株P(guān)RV親緣關(guān)系最近，同源性為100%，但與上海市2010 年分離的2株 PRV相比，在815～821nt的位置插入6個(gè)堿基（2個(gè)氨基酸），同源性只有80.5%（圖6）。與國內(nèi)其他省市分離的毒株如 ZJ01、BJ/RD、Fa、HLJ8、HN1201、HNB、JS-2012、La、Min-A、Hubei、FZ株以及國外的 Becker、NIA3株親緣關(guān)系較近，同源性為 99%～99.9%。除此之外，和其他毒株的親緣關(guān)系都比較遠(yuǎn)，同源性為79.9%～80.8%。

圖6 SH1311分離株與參考毒株間 gD 基因的同源性比較Fig.6 Sequence homology of gD gene of SH1311 and other reference strains

2.9 gD基因進(jìn)化樹分析 為進(jìn)一步了解 SH1311分離株 gD 基因的遺傳特性和相互的親緣關(guān)系，利用MEGA7.1對gD基因構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖7）。結(jié)果顯示，SH1311 分離株與上海市2012～2015年間分離的7株豬偽狂犬病毒以及國內(nèi)JS-2012、HNB、HN1201、HLJ8、BJ/RD、ZJ01毒株屬于同一個(gè)進(jìn)化分支。

3 討論

PRV 是危害豬、羊、牛以及很多野生動物的一種重要病原體，豬是該病毒的主要宿主。多年來，歐美許多國家的養(yǎng)豬業(yè)通過豬場凈化措施已根除了PR，但在我國許多養(yǎng)豬場，PR一直散發(fā)或流行。特別是2011年以來，新發(fā)的PR流行毒株在基因和蛋白水平上發(fā)生了變異，進(jìn)而導(dǎo)致現(xiàn)有疫苗保護(hù)率降低，疫病難以防控。除了豬感染發(fā)病以外，羊偽狂犬病的報(bào)道也逐漸增多[9-12]。本研究對發(fā)病羊的腦組織進(jìn)行病毒分離，分離株通過家兔攻毒試驗(yàn)、IFA和熒光定量 PCR 檢測證實(shí)是偽狂犬病毒，將其命名為SH1311毒株。將該毒株細(xì)胞培養(yǎng)液負(fù)染后在透射電鏡下觀察，病毒粒子符合偽狂犬病病毒的形態(tài)學(xué)特征。對SH1311分離株的gD 基因進(jìn)行測序和序列分析，結(jié)果表明該分離株與上海市2012年以來分離的豬 PRV 毒株的gD基因的同源性最高，為99.8%～100%，其中與SH-01-2013株、SH-05-2014株同源性為100%。而與 2010 年上海市流行毒株相比，同源性只有80.5%。gD 基因進(jìn)化樹顯示，SH1311 分離株與上海市2012～2015年間分離的7株豬偽狂犬病毒以及國內(nèi) JS-2012、HNB、HN1201、HLJ8、BJ/RD毒株屬于同一個(gè)進(jìn)化分支，親緣關(guān)系最近，而與歐美分離的毒株以及韓國的流行毒株都處在不同的分支上。這與gD基因變異具有一定的地域性有關(guān)[13]，即距離較遠(yuǎn)的地區(qū)分離到的毒株，核苷酸同源性較低，反之則同源性較高，這也是SH1311 分離株與上海市最近幾年分離的毒株同源性最高的原因之一。

圖7 PRV gD基因進(jìn)化樹分析Fig.7 Phylogenetic analysis of PRV gD gene

利用DNAStar軟件對從上海市2010年以來收集的 PRV 毒株以及GenBank上已登錄的國內(nèi)外其他22個(gè) PRV 毒株gD基因核苷酸序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，gD基因內(nèi)部在802～837 nt 處有一個(gè)C(A)GGCCC重復(fù)高變區(qū)，這一區(qū)域被稱為 gD 基因重復(fù)高變區(qū)[14]，正是這一重復(fù)高變區(qū)的核苷酸缺失或插入使得PRV gD基因在1194～1215 nt間出現(xiàn)變化，導(dǎo)致編碼的氨基酸為399～405 個(gè)不等。而SH1311 分離株及上海市2012～2015年間分離的7株豬偽狂犬病病毒，與2010年的上海市流行毒株相比，正是在gD 基因重復(fù)高變區(qū)插入了C(A)GGCCC六個(gè)堿基，使它們之間的同源性只有80.5%。研究結(jié)果表明，SH1311 分離株很可能是最近幾年在上海市豬場流行的豬偽狂犬病病毒株。為了進(jìn)一步證實(shí)上述觀點(diǎn)，筆者到現(xiàn)場進(jìn)行了流行情況調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該羊場與一家豬場相鄰，僅一墻之隔。據(jù)調(diào)查，在綿羊發(fā)病前，相鄰的豬場曾經(jīng)發(fā)生過疫病，目前來看，這種疫病可能是豬偽狂犬病毒傳染給附近的綿羊，引起綿羊發(fā)病。

羊偽狂犬病毒對羊是高度致死性，發(fā)病羊死亡率高達(dá)100%，本研究對 SH1311 分離株的核苷酸序列分析為羊偽狂犬病的防控提供了參考。雖然該病不像豬偽狂犬病危害那樣嚴(yán)重，但因?yàn)榘l(fā)病羊病死率很高，因此獸醫(yī)界需要高度重視并加強(qiáng)對該病的研究，防止野毒在家畜和野生動物之間的傳播。