王遵寶，李俊輝，豆智華，鄭 侃，李森江，寇 春，賀 筍

（天康生物股份有限公司，烏魯木齊 830032）

豬瘟（classical swine fever，CSF）是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的豬的高度致死性、接觸性傳染病，是OIE規(guī)定的必須通報(bào)的A類動(dòng)物傳染病之一，在我國列為一類傳染病，常給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，歷來是各國研究的熱點(diǎn)。

目前我國使用豬瘟兔化弱毒疫苗來預(yù)防豬瘟病毒，其免疫效力是毋庸置疑的。然而，在使用過程中會(huì)因?yàn)槟冈纯贵w的干擾而影響仔豬免疫效果。此外，活疫苗無法通過抗體檢測(cè)區(qū)分免疫與野毒產(chǎn)生的抗體，是豬瘟的凈化瓶頸之一。

豬瘟病毒E2糖蛋白是豬瘟病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白之一，是誘導(dǎo)中和抗體及激發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答的主要抗原蛋白，其免疫原性依賴于正確的蛋白空間構(gòu)象（或糖基化）。桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)不僅可以高效表達(dá)外源蛋白，而且進(jìn)行糖基化、磷酸化、酰基化、正確的信號(hào)肽切割、蛋白水解以及適當(dāng)?shù)恼郫B等真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄后加工作用，將重組蛋白聚集定位在同一細(xì)胞器上，經(jīng)適當(dāng)?shù)墓丫刍b配，使表達(dá)產(chǎn)物在結(jié)構(gòu)及功能上接近天然蛋白。

因此，前期工作將豬瘟病毒E2全基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化和修飾，重組于桿狀病毒內(nèi)，在昆蟲細(xì)胞上培養(yǎng)重組桿狀病毒，分泌表達(dá)了豬瘟病毒E2重組蛋白，與進(jìn)口佐劑乳化制成新型亞單位疫苗。免疫該疫苗豬可使用商品化豬瘟E2、E0抗體檢測(cè)試劑盒區(qū)分野毒感染與疫苗免疫產(chǎn)生的抗體，為規(guī)模化豬場(chǎng)凈化豬瘟帶來可能。

本試驗(yàn)用不同疫苗免疫豬瘟抗體陰性豬，二免后14 d用強(qiáng)毒人工感染，根據(jù)攻毒后各組動(dòng)物的臨床癥狀及體溫變化、血樣及組織器官中的病毒載量，結(jié)合病理解剖結(jié)果比較分析了不同疫苗的保護(hù)力，結(jié)果證實(shí)豬瘟E2亞單位疫苗能可靠的免疫保護(hù)效力。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)豬 4～5 w健康仔豬（豬瘟病毒抗體為陰性），購自新疆天康畜牧有限公司。

1.1.2 疫苗 豬瘟E2亞單位疫苗、豬瘟兔化弱毒活疫苗（傳代細(xì)胞源）由天康生物股份有限公司提供。

1.1.3 攻豬瘟強(qiáng)毒株 豬瘟石門系血毒購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.1.4 主要試劑 血液RNA提取試劑盒購自天根生化科技，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Premix ExTaqTM購自TaKaRa公司，Plasmid Plus Midi Kit購自QIAGEN公司，豬瘟抗體檢測(cè)試劑盒購自IDEXX公司。

1.1.5 引物 根據(jù)參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)熒光定量CSFV引物。CSFV-F：5'-TACAGGACAGTCGTCAG TAGTTCGA-3'；CSFV-R：5'-CCGCTAGGGTT AAGGTGTGTCT-3'；CSFV-P：5'-CCCACCTCGA GATGCTATGTGGACGA-3'；目的片段長(zhǎng)121 bp，退火溫度55.7℃。

1.2 方法

1.2.1 陰性豬篩選方法 用豬瘟病毒抗體檢測(cè)試劑盒（IDEXX）篩選豬瘟抗體陰性豬。

1.2.2 免疫及攻毒方法 用豬瘟病毒抗體檢測(cè)試劑盒（IDEXX）篩選獲得的豬瘟抗體陰性豬15頭，5頭豬頸部肌肉注射豬瘟E2亞單位疫苗，2 mL/頭份（每頭份含50 ug重組E2蛋白）；5頭豬頸部肌肉注射豬瘟兔化弱毒疫苗，2 mL/頭份（每頭份含7500個(gè)RID50病毒）；剩下的5頭豬不注射疫苗作為對(duì)照，在同條件下隔離飼養(yǎng)。21 d后均加強(qiáng)免疫1次，二免后14 d，連同對(duì)照豬各耳后頸部肌肉注射豬瘟病毒石門系血毒1 mL（含106.0MLD），連續(xù)測(cè)溫并觀察16 d。

1.2.3 采樣方法 攻毒后每2 d采集各組試驗(yàn)豬全血600 μL，置于含100 μL EDTA-Na 抗凝劑的1.5 mL離心管中，-70℃以下保存；試驗(yàn)結(jié)束后對(duì)存活動(dòng)物處以安樂死后剖檢，采集扁桃體、下頜淋巴結(jié)、脾臟、腎臟、肺臟、腦、肛拭子，-70℃以下保存。

1.2.4 核酸提取及RT-PCR 采用血液RNA提取試劑盒提取豬全血RNA。稱取1 g組織于1.5 mL離心管中，加入1 mL無菌PBS中，用組織均漿機(jī)均漿，離心取上清，用病毒核酸提取試劑盒提取樣品RNA。選用PrimeScript? RT reagent Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于PCR模板。

1.2.5 病毒含量測(cè)定 以cDNA為模板進(jìn)行熒光qPCR，其反應(yīng)體系：Premix ExTaq酶混合液12.5 μL，上、下游引物各0.5 μL，熒光探針0.5 μL，cDNA模板2 μL，補(bǔ)ddH2O至終體積為25 μL；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，55.7℃退火30 s，收集熒光信號(hào)，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。以E2基因構(gòu)建重組質(zhì)粒，用已知濃度的質(zhì)粒DNA10倍梯度稀釋，作為熒光定量PCR的標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算未知樣品的基因含量，分析相對(duì)表達(dá)量。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算的未知樣的基因含量，利用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析，比較各試驗(yàn)組病毒載量差異。

2 結(jié)果

2.1 抗體測(cè)定結(jié)果 用豬瘟病毒抗體檢測(cè)試劑盒篩選出豬瘟病毒抗體陰性且阻斷率相近的15頭豬作為試驗(yàn)豬。免疫后監(jiān)測(cè)豬只抗體阻斷率變化，統(tǒng)計(jì)分析了每個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)陽性率、平均阻斷率及離散度。結(jié)果表明：豬瘟E2亞單位疫苗組在二次免疫時(shí)抗體5/5轉(zhuǎn)陽，兔化弱毒組在二免后14 d 5/5轉(zhuǎn)陽，對(duì)照組5/5保持陰性；E2亞單位疫苗組免疫后各監(jiān)測(cè)點(diǎn)平均抗體阻斷率均高于兔化弱毒疫苗組，離散度小于豬瘟兔化弱毒疫苗組，詳見圖1。

圖1 免疫豬CSFV特異性抗體動(dòng)態(tài)變化Fig.1 CSFV specific antibody responses in piglets of different groups after immunization

2.2 臨床癥狀觀察及體溫測(cè)定結(jié)果 在攻毒后3 d，對(duì)照組豬精神沉郁，胃寒怕冷，食欲明顯下降，便秘與腹瀉交替發(fā)生，部分豬出現(xiàn)結(jié)膜炎癥狀，并有膿性分泌物，體溫升高，可至41.5℃以上，攻毒后11 d內(nèi)對(duì)照豬5/5死亡；免疫組僅部分豬體溫稍有升高，平均體溫測(cè)定結(jié)果如圖2所示，免疫組均無異常臨床反應(yīng)，見圖3。

圖2 攻毒前后豬只體溫變化曲線Fig.2 Body temperature changes of experimentally infected piglets

圖3 攻毒后各組豬不同時(shí)間的存活情況Fig.3 Survival of piglets challenged with CSFV

2.3 病理變化 對(duì)照組豬剖檢發(fā)現(xiàn)，扁桃體有出血、潰瘍甚至化膿；下頜、腹股溝、腸系膜等淋巴結(jié)嚴(yán)重腫大、出血，切面呈大理石樣花紋；體表、喉頭、膀胱、有出血點(diǎn)或出血斑；脾臟邊緣梗死；腎臟表面有大量出血點(diǎn)，呈現(xiàn)典型“雀斑腎”病理變化；E2亞單位疫苗組剖檢未見異常病理狀況，兔化弱毒疫苗組部分豬只淋巴結(jié)腫大，但未見出血，剖檢結(jié)果見圖4及表1。組織器官病理切片結(jié)果表明，E2亞單位疫苗組豬淋巴結(jié)、腎臟無明顯病變，脾臟結(jié)構(gòu)正常，淋巴濾泡完整；對(duì)照組豬淋巴結(jié)反應(yīng)性增生，紅細(xì)胞進(jìn)入淋巴結(jié)被吞噬后形成棕黃色顆粒，腎臟可見較大區(qū)域與大量單核細(xì)胞浸潤(rùn)于腎小管間質(zhì)中，呈現(xiàn)較大區(qū)域間質(zhì)性腎炎，脾臟淋巴細(xì)胞流失，并有大量網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞浸潤(rùn)。

圖4 內(nèi)臟器官病理變化Fig.4 The autopsy lesions of experimentally infected piglets

2.4 病毒含量測(cè)定結(jié)果 用標(biāo)準(zhǔn)曲線法對(duì)采集的組織器官進(jìn)行了豬瘟病毒含量測(cè)定。結(jié)果表明，對(duì)照組所采樣中均可檢出豬瘟病毒，其中脾臟中病毒含量最高，為9190.2±121.44 copies/μL，肺臟病毒含量最少，為1823±75.69 copies/μL，肛拭子中檢出較高病毒含量，表明機(jī)體向外排毒；在免疫組的扁桃體、下頜淋巴結(jié)、脾臟中檢出微量病毒，肛拭子中未檢測(cè)到病毒，提示病毒未被排出體外；在所檢組織樣品中，對(duì)照組與免疫組的病毒載量均差異極顯著（P＜0.01），E2亞單位疫苗和豬瘟兔化弱毒疫苗組僅在下頜淋巴結(jié)中的病毒載量有顯著性差異（P＜0.05），詳見表2。

由表3可以看出，對(duì)照組豬在攻毒后血液中的病毒含量隨感染天數(shù)逐漸升高，至頻死期達(dá)到最高，可達(dá)1.7×107copies/mL。免疫豬瘟E2亞單位疫苗的豬只僅在攻毒后6 d內(nèi)檢測(cè)到微量病毒（不高于150 copies/mL），之后的監(jiān)測(cè)點(diǎn)均未檢出病毒；豬瘟兔化弱毒疫苗組豬只血液病毒載量在攻毒后6 d達(dá)到最高，可達(dá)1453 copies/mL，但整個(gè)攻毒過程病毒含量始終較低，但均高于豬瘟E2亞單位疫苗組。

3 討論

國內(nèi)外研究結(jié)果表明，人工感染強(qiáng)毒的抗體陰性豬在攻毒后1 d即可從扁桃體、淋巴結(jié)、脾臟等中檢測(cè)出豬瘟病毒，感染后3～8 d相繼在腎臟、回腸、肺臟、肝臟、腦等組織中檢出較高病毒，提示豬感染病毒3 d后開始通過呼吸道和消化道向外排毒。豬瘟病毒最早在宿主扁桃體、淋巴結(jié)等組織進(jìn)行復(fù)制，隨后通過淋巴、血液循環(huán)系統(tǒng)向其他組織、器官擴(kuò)散，最終導(dǎo)致全身病毒血癥[2-5]。

Rachel等[6]用昆蟲細(xì)胞表達(dá)的重組E2蛋白及水包油佐劑配制的KNB-E2疫苗免疫豬，對(duì)照豬注射生理鹽水溶液。二免后2 w，用豬瘟強(qiáng)毒攻擊試驗(yàn)豬，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)感染CSFV的對(duì)照豬停止生長(zhǎng)，發(fā)生高熱，血液和鼻拭子中含有大量豬瘟病毒核酸，白細(xì)胞嚴(yán)重減少；免疫豬生長(zhǎng)不受影響，未見任何異常，血液和鼻液中僅可檢測(cè)到微量病毒核酸。研究結(jié)果表明，KNB-E2疫苗免疫豬可產(chǎn)生高水平的E2特異性抗體，可中和病毒，保護(hù)靶動(dòng)物。

Xia等[7]用rAdV-SFV-E2疫苗免疫了不同母源抗體水平的仔豬，并用CSFV石門株人工感染。試驗(yàn)結(jié)果顯示，免疫組未見任何異常，未免疫仔豬出現(xiàn)了典型的CSF臨床癥狀、病毒血癥及病理、組織病理學(xué)變化，攻毒期間全部發(fā)病死亡。其研究表明，rAdV-SFV-E2或C株的母源抗體不影響rAdVSFV-E2的免疫效果，突出了疫苗控制和根除CSF的巨大潛力。

表1 人工感染豬解剖病變統(tǒng)計(jì)結(jié)果Table 1 Statistics on autopsy lesions of experimentally infected piglets

表2 組織器官中的豬瘟病毒含量（copies/μL）Table 2 Copies of CSFV RNA in the internal organs of experimentally infected piglets（copies/μL）

表3 人工感染豬全血中豬瘟病毒含量（copies/mL）Table 3 Copies of CSFV RNA in the whole blood samples of experimentally infected piglets（copies/mL）

Hua等[8]用BHK-21細(xì)胞產(chǎn)生的豬瘟病毒E2重組蛋白乳化配苗（ME2疫苗），免疫豬體首免后32 w，采用豬瘟強(qiáng)毒進(jìn)行攻擊，攻毒后2 w，所有免疫豬存活，無明顯豬瘟癥狀，而未免疫豬體攻毒后4 d表現(xiàn)出豬瘟癥狀，攻毒后7～9 d豬體頻死時(shí)處以安樂死，進(jìn)行剖檢，可見典型的病理、組織病理學(xué)變化。結(jié)果表明，ME2疫苗是一種安全有效的豬瘟亞單位疫苗。

Wang等[9]用rPRVTJ-E2嵌合體疫苗免疫豬，攻毒后免疫組沒有觀察到豬瘟臨床癥狀；對(duì)照豬攻毒后體溫持續(xù)升高，陸續(xù)出現(xiàn)精神沉郁、食欲不振、畏寒怕冷、共濟(jì)失調(diào)、便秘及腹瀉等癥狀，9 d內(nèi)全部發(fā)病死亡。攻毒后14 d，將所有存活豬安樂死并進(jìn)行病理剖檢，對(duì)照組中的豬均顯示出嚴(yán)重的病理變化，包括扁桃體出血、有壞死灶，淋巴結(jié)腫大、出血，脾臟梗死，腎臟和膀胱中有廣泛的針尖狀出血點(diǎn)，以及回盲部的紐扣狀潰瘍結(jié)節(jié)。熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組中豬的組織、器官含有7.2×104～6.3×107個(gè)拷貝的CSFV RNA，免疫豬未檢測(cè)到病毒核酸，表明該嵌合體疫苗對(duì)靶動(dòng)物有很好的免疫保護(hù)力。

本研究首次免疫E2亞單位疫苗21 d后，抗體全部轉(zhuǎn)陽，較豬瘟兔化弱毒疫苗早，免疫后每個(gè)監(jiān)測(cè)點(diǎn)抗體阻斷率均高于豬瘟兔化弱毒疫苗組。攻毒前免疫組抗體全部轉(zhuǎn)陽，對(duì)照豬抗體始終為陰性，對(duì)照組中的豬試驗(yàn)在攻毒11 d內(nèi)全部死亡，免疫組個(gè)別試驗(yàn)豬體溫稍有升高，但均無異常臨床反應(yīng)。組織、器官病毒含量分析結(jié)果表明，免疫組在腦、肺臟、腎臟、肛拭子中均未檢測(cè)到病毒，在脾臟、扁桃體和下頜淋巴結(jié)中檢出較低的病毒拷貝數(shù)；而對(duì)照組所采集的樣品中均可檢出大量病毒核酸，其中脾臟病毒含量最高。以上結(jié)果表明，用豬瘟石門系血毒攻毒后，免疫豬瘟病毒E2亞單位疫苗與豬瘟兔化弱毒疫苗均可為試驗(yàn)豬提供可靠的免疫保護(hù)效力。