宿 鑫，任超超，周潔文，閆麗萍,2，李澤君

（1.中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；2.南京農(nóng)業(yè)大學，南京210095）

流行性感冒病毒（Influenza virus）簡稱流感病毒，是一種人畜共患傳染病的病原[1,2]。流感病毒在分類學上屬于正粘病毒科，為單股、負鏈、分節(jié)段的RNA病毒。流感病毒根據(jù)其蛋白的抗原性被分為4個型：A型、B型、C型和D型；根據(jù)感染對象的不同，流感病毒還可分為人流感病毒、禽流感病毒、豬流感病毒等類群[3,4]。據(jù)美國科學技術委員會調(diào)查表明，近年來美國每年死于流感的人數(shù)為2～4萬，并且每年用于治療流感的費用及流感引起的勞動力損失超過了1.2億美元。即使在非流感大流行期間，全球季節(jié)性流感每年也會引起300萬～500萬的嚴重病例，并導致30萬～50萬人死亡[5,6]。流感病毒的不斷變異與傳播嚴重危害著人們的生命財產(chǎn)安全，面對流感病毒的威脅我們必須時刻提高警惕，做好預防措施。目前應對流感病毒感染的主要措施為疫苗接種和藥物治療[6,7]，雖然預防流感病毒的疫苗不斷更新，但是因為生產(chǎn)條件和技術的限制，疫苗的生產(chǎn)往往需要耗費幾個月的時間，在應用上具有明顯的滯后性；而抗流感病毒藥物的使用對于疫情的控制雖然起到非常重要的作用。但長時間使用同種抗流感病毒藥物，可使流感病毒對藥物產(chǎn)生抗藥性，因此新型抗流感藥物的篩選顯得極為重要[8]?，F(xiàn)有的抗流感藥物篩選方法耗時長，工作量大，因此建立新的篩選方法極為迫切。

本研究構建了1株可以表達Renilla Luciferase的重組流感病毒[9]，并利用Luciferase報告基因系統(tǒng)[10]對其生物學特性進行了研究，檢測到的Luciferase的表達量與病毒復制生長情況是一致的，因此本研究構建的病毒可以用于抗流感藥物的高通量篩選。

1 材料方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與細胞 HA-Renilla-HA質(zhì)粒和表達HA蛋白的MDCK-HA2細胞系由上海獸醫(yī)研究所動物流感病原生態(tài)學創(chuàng)新團隊構建；PR8病毒反向操作系統(tǒng)和MDCK細胞由上海獸醫(yī)研究所動物流感病原生態(tài)學創(chuàng)新團隊保存。

1.1.2 主要試劑 Renilla Luciferase Assay System試劑盒購自TaKaRa 公司；SFM（serum free medium，無血清培養(yǎng)基）購自賽默飛世爾生物化學制品有限公司；胎牛血清購自上海玉博生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 重組流感病毒的拯救 將293T細胞傳代培養(yǎng)在直徑3.5 cm的無菌小平皿中，待細胞長至70%～80%時，進行轉(zhuǎn)染。具體步驟如下：向2個無菌的1.5 mL的EP管中分別加入250 μL的Opti-MEM培養(yǎng)液。HARenilla-HA質(zhì)粒與PR8病毒株PB1、PB2、PA、NP、NA、NS和M基因的7種質(zhì)粒，分別以1.0 μg的量加入其中1個EP管中，混勻。向另1含有250μL Opti-MEM EP管中加入24 μL TransIT-293轉(zhuǎn)染試劑，混合并作用5 min。將2個EP管中液體輕柔混合，靜置30 min，靜置期間用opti-MEM洗細胞2次，動作要輕柔。靜置完畢將混合液輕輕加入到293T細胞并補加溶液至2 mL。轉(zhuǎn)染完的平皿置于37℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，然后向細胞上清加入2 μL的TPCK胰酶，作用2 h后將細胞吹散混勻，將細胞懸液接種9～11日齡SPF雞胚（0.5 mL/枚），37℃孵化器孵育48 h后測定血凝效價。

1.2.2 重組病毒半數(shù)組織感染量（tissue culture infective dose，TCID50）的測定 首先將MDCK-HA2細胞按照104/孔鋪至96孔板。等細胞長至80%左右時，用無菌PBS洗2次；將毒株用SFM進行10倍系列稀釋，稀釋好的病毒按照0.1 mL/孔接種細胞，37℃孵育2 h；棄去上清，用無菌PBS洗3遍，加入DMEM細胞維持液500 μL；將96孔板放置在37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱，48 h后觀察細胞病變，根據(jù)Reed-Muench方法計算TCID50。

1.2.3 Luciferase報告基因系統(tǒng)穩(wěn)定性的研究 為了評估Luciferase報告基因系統(tǒng)的穩(wěn)定性，將重組流感病毒在MDCK-HA2細胞上進行連續(xù)傳代，在傳代過程中，用Luciferase報告基因系統(tǒng)檢測Renilla Luciferase的表達量。Renilla Luciferase的測定方法：用無菌PBS將5×裂解液稀釋成1×裂解液，稀釋完畢后4℃保存?zhèn)溆谩Ｔ谑占毎锨搴蟮目變?nèi)加入無菌PBS洗3遍，每次0.3 mL。洗完后每孔加入65 μL 1×裂解液，覆蓋所有細胞，放置搖床上搖動15 min。在細胞裂解的過程中配制1×Renilla Luciferase Assay Reagent，每個樣本的上樣量為0.1 mL，根據(jù)需要量進行配制，震蕩混勻后分裝，每管0.1 mL。最后在化學發(fā)光檢測儀上測定Luciferase的活性值。

1.2.4 不同滴度的重組流感病毒生長特性的研究 首先將生長狀況良好的MDCK-HA2細胞傳至48孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，待細胞長至80%左右時，棄去培養(yǎng)液，用無菌PBS洗2遍，洗完后在每個細胞孔內(nèi)加入0.1 mL SFM。將重組流感病毒按照0.1、0.01、0.001、0.0001 MOl的量接種MDCK-HA2細胞，接種量為100 μL/孔。將接種病毒后的細胞放至37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育2 h，然后棄掉細胞上清，用無菌PBS洗2遍，加入250 μL SFM。在接種病毒后的12、24、36、48 h分別進行Luciferase的活性值的測定。

1.2.5 重組流感病毒在MDCK細胞與MDCK-HA2細胞上生長能力差異的研究 將MDCK與MDCK-HA2細胞傳至48孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)，待細胞長至80%左右時，棄去培養(yǎng)液，用無菌PBS洗2遍；將含有0.01 MOI的病毒接種MDCK、MDCK-HA2細胞，接毒量為100 μL/孔。接種后將細胞放至37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育2 h，然后將上清棄掉，用無菌PBS洗細胞2遍，洗完后加入250 μL SFM。在接毒后的12、24、36、48、60、72 h進行Luciferase的活性值的測定。

1.2.6 不同病毒滴度對磷酸奧司他韋敏感性的研究將磷酸奧司他韋用無菌PBS溶解，溶解后的磷酸奧司他韋用SFM稀釋至500 μ mol/L備用。將MDCKHA2細胞鋪至48孔板內(nèi)并分為A、B兩組，待細胞長至80%左右時棄去培養(yǎng)液，用無菌PBS洗2遍。A組MDCK-HA2中每孔加入0.1 mL含500 μmol/L 磷酸奧司他韋的SFM，B組細胞內(nèi)加入等量的SFM，每個濃度作2個重復，37℃孵育15 min。

將病毒液按照1、0.1、0.01、0.001、0.0001、0.000 01 MOI的量接種A組細胞，每個濃度重復2個孔；B組細胞加入等量的SFM，做2個重復孔。37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，孵育后將兩組細胞上清棄掉，用無菌PBS洗2遍，洗完后A組加入250 μL含有500 μmol/L磷酸奧司他韋的SFM，B組加入等量不含磷酸奧司他韋的SFM。將細胞放至37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，分別在8 h和24 h進行Luciferase的活性值的測定。

1.2.7 重組流感病毒對不同濃度的磷酸奧司他韋的敏感性的研究 將磷酸奧司他韋用無菌PBS溶解，溶解后的磷酸奧司他韋用SFM稀釋成5000、1000、500、100、50、25、12.5、6.25、3.125 μmol/L，每種濃度配成1 mL溶液備用。待MDCK-HA2細胞長至80%時，棄去培養(yǎng)液，用無菌PBS洗2遍，洗完后加入100 μL含有不同磷酸奧司他韋濃度的SFM，每個濃度做2個重復孔。37℃孵育15 min。對照組分為A、B兩組，先分別加入等量的不含磷酸奧司他韋的SFM，37℃孵育15 min；將病毒按照0.01 MOI接種MDCK-HA2細胞（每孔100 μL），A對照組按照0.01 MOI的感染量接種100 μL，B對照組加入等量的SFM，37℃孵育2 h。孵育完畢后，將細胞上清棄掉，并用無菌PBS洗2遍，洗完后每孔加入250 μL含有對應濃度的磷酸奧司他韋，A、B對照組加入等量的不含磷酸奧司他韋的SFM，在接種病毒12 h后進行Luciferase的活性值的測定。

2 結果

2.1 重組流感病毒的拯救 經(jīng)血凝試驗測定，重組病毒的血凝效價為24。

2.2 Luciferase報告基因系統(tǒng)的穩(wěn)定性 在連續(xù)傳代過程中運用Luciferase報告基因系統(tǒng)檢測到的Luciferase的活性值相對一致，這說明重組病毒可穩(wěn)定表達Renilla Luciferase，可通過檢測Renilla Luciferase活性值來確定病毒復制，結果見圖1。

圖1 Luciferase報告基因表達穩(wěn)定性檢測Fig.1 Luciferase reporter gene expression stability assay

2.3 重組流感病毒的TCID50的測定 為在后續(xù)的實驗中能夠確定重組病毒的感染量，對該病毒的TCID50進行了測定。將10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀釋的重組病毒，按照0.1 mL/孔接種48孔板上的MDCK-HA2細胞，每日觀察并記錄細胞病變。根據(jù)記錄結果，按照Reed-Muench法計算病毒的TCID50。經(jīng)測定該病毒滴度為105.61TCID50/100 μL。

2.4 重組病毒對MDCK-HA2不同感染量生長曲線的測定 將重組流感病毒按照0.1、0.01、0.001、0.0001 MOI的量接種MDCK-HA2細胞，每孔100 μL。在接毒后的12、24、36、48 h進行Renilla值的測定，將測得的Renilla Luciferase值繪制成生長曲線，結果見圖2。

圖2 重組流感生長曲線Fig.2 Growth curve of recombinant inf l uenza virus

感染劑量為0.1 MOI時病毒增殖最快復制能力最強，在第6 h測得的Renilla值已經(jīng)明顯高于其他組。感染劑量為0.001、0.0001 MOI時病毒復制能力較弱，而感染劑量為0.01 MOI時病毒生長速度較為適中。因為后續(xù)的實驗中要進行藥物敏感性的檢測，病毒的復制能力太強或者太弱對實驗結果都有一定的影響，因此將病毒感染量定為0.01 MOI。

2.5 重組流感病毒在MDCK與MDCK-HA2細胞生長曲線的比較 將重組流感病毒以0.01 MOI接種生長狀況良好的MDCK、MDCK-HA2細胞，每孔100 μL。在接毒后的12、24、36、48、60、72 h進行Renilla活性值的測定，繪制成生長曲線，結果見圖3。

圖3 重組流感在MDCK與MDCK-HA2細胞上生長曲線Fig.3 Growth curve of recombinant inf l uenza virus on MDCK and MDCK-HA2 cells

從結果中可以看出重組病毒在MDCK與MDCK-HA2上均能表達Renilla Luciferase，在接種病毒后24 h內(nèi)表達量基本相同，但接毒后24～60 h，病毒在MDCK-HA2上的表達量明顯高于在MDCK細胞。接毒60～72 h Renilla Luciferase表達量開始下降，且在MDCK上的下降速率明顯高于在MDCK-HA2。結果表明重組流感病毒利用MDCK-HA2細胞提供的HA基因進行包裝、復制，因此MDCK-HA2細胞更適合用于后續(xù)研究。

2.6 不同滴度的重組流感病毒對磷酸奧斯他韋敏感性的研究 將磷酸奧司他韋用無菌PBS溶解，用SFM將其稀釋成500 μmol/L，按照0.1 mL/孔的量加到細胞孔內(nèi)，37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育15 min，在用藥濃度為500 μmol/L的前提下選取不同的病毒滴度進行研究。接毒后8 h和24 h進行Renilla值的測定，結果見圖4、5。

圖4 不同滴度的重組流感病毒對500 μmol/L磷酸奧司他韋的敏感性（接毒后8 h）Fig.4 Renilla values of the different titers recombinant inf l uenza virus inhibited by 500 μmol/L oseltamivir phosphate for 8 h

圖5 不同滴度的重組流感病毒對500 μmol/L磷酸奧司他韋敏感性研究（接毒后24h）Fig.5 Renilla values of the different titers recombinant inf l uenza virus inhibited by oseltamivir phosphate for 24 h for 500 μmol/L

從Luciferase報告基因系統(tǒng)測得的Renilla活性值可以看出，500 μmol/L的磷酸奧斯他韋抑制流感病毒復制后，也同步明顯的抑制了重組流感毒株對Renilla Luciferase表達，當感染劑量為0.01 MOI時抑制作用最明顯。

2.7 不同濃度磷酸奧司他韋對病毒生長的影響 將磷酸奧司他韋用SFM稀釋成5000、1000、500、100、50、25、12.5、6.25、3.125 μmol/L。待MDCKHA2長至80%時，用無菌PBS洗2遍，按照100 μL/孔加入稀釋好的磷酸奧斯他韋，每個稀釋度作2個重復。37℃、5%CO2培養(yǎng)孵育15 min后，按照0.01 MOI接種病毒100 μL，接毒后12 h測定Renilla值，結果見圖6。

圖6 重組流感病毒對不同濃度磷酸奧司他韋敏感性的研究Fig.6 Sensitivity of the recombinant inf l uenza virus to different concentrations of oseltamivir phosphate

從 Luciferase報告基因系統(tǒng)測得的Renilla值可以看出，不同濃度的磷酸奧司他韋對重組流感病毒Renilla Luciferase的表達量影響不同；磷酸奧司他韋濃度越大，Renilla Luciferase表達量越低，測得的Renilla值越低，當濃度達到一定值時測得的Renilla值與陰性對照組基本一致；當磷酸奧司他韋濃度低至一定程度時測得的Renilla值與不含磷酸奧司他韋的接毒組基本一致。

結果顯示，Luciferase報告基因系統(tǒng)可以十分靈敏檢測到病毒的復制情況，當病毒復制能力強時測得的Renilla值高，當復制能力降低時測得的Renilla值低。

3 討論

流感病毒不僅給養(yǎng)殖業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失，也在一定程度上威脅到人類的健康。目前抗流感藥物和接種疫苗是預防流感的最主要的手段，但因疫苗研制周期長，疫苗株需要及時更新，所以當流感大流行暴發(fā)的早期，抗流感病毒藥物的使用對于控制疫情的蔓延可起到非常重要的作用。但長時間使用同種抗流感病毒藥物，又使得流感病毒對藥物產(chǎn)生了抗藥性，因此新型抗流感藥物的篩選及應用就顯得極為重要。

2006年， Garcia-Perez等[9]運用重組病毒NL0641Ren研究了人類免疫缺陷病毒I型的藥物敏感性；2010年，Huang等[10]運用Renilla Luciferase檢測系統(tǒng)對線粒體融合的速率進行了測定。受此啟發(fā)，我們成功構建了1株表達Renilla Luciferase的重組流感病毒，并運用Luciferase報告基因系統(tǒng)進行了該株病毒生物學特性的研究。研究發(fā)現(xiàn)重組流感病毒Renilla Luciferase的表達量能直接反應病毒的復制情況，而Luciferase檢測試劑盒可以快速而且靈敏地檢測到該基因的表達。當重組病毒與抗流感藥物磷酸奧司他韋作用后測得的Renilla值明顯低于無磷酸奧司他韋的病毒感染組，當用藥濃度提高到一定值時測得的Renilla值與陰性對照組基本一致；而用藥濃度降低時對病毒的抑制作用降低，測得的Renilla值較高。

本研究中對表達Renilla Luciferase的重組流感病毒生物學特性研究的方法為新型抗流感藥物的篩選提供了一種新的思路，這種方法不僅快速靈敏，而且耗時短、工作量小，能極大地加快抗流感藥物篩選的進程，加快新的抗流感藥物的出現(xiàn)，為人們的生命健康提供保障。