呂其壯，劉 娟，陳 艷，劉 暢，顏 秋，曹偉偉，李佩倫，莫昭展

（1.玉林師范學院生物與制藥學院，玉林 537000；2.廣西農產資源化學與生物技術重點實驗，玉林 537000；3.玉林師范學院商學院，玉林 537000；4.河南省動物疫病預防控制中心，鄭州450000；5.玉林市動物疫病預防控制中心，玉林537000）

豬圓環(huán)病毒?。╬orcine circovirus associated disease，PCVAD）是由豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）引起的一種豬傳染病或豬相關疾病的綜合征，主要包括斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、仔豬先天性震顫、成年豬皮炎腎炎綜合征、增生性壞死性肺炎、腸炎、繁殖障礙和呼吸道疾病綜合征[1]。該病于1991年首次發(fā)現(xiàn)于加拿大，現(xiàn)已呈全世界流行，死亡率介于10%～30%，個別豬場在暴發(fā)本病時死淘率高達40%左右[2]。我國于2000年首次報道該病的發(fā)生，迄今已經在我國豬群中普遍存在，嚴重阻礙了我國養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[3,4]。

PCV2屬于圓環(huán)病毒科（Circoviridae）圓環(huán)病毒屬（Circovirus），其基因組是一條共價結合形成的閉合環(huán)狀的單鏈DNA，大小為1766～1768 bp，編碼11個潛在開放閱讀框（open reading frame，ORF）[3]。PCV2各毒株的核苷酸序列同源性都在90%以上，分為PCV2a、PCV2b、PCV2c、PCV2d和PCV2e 5種基因亞型，其中PCV2b是目前PCV2最主要的流行毒株[5]。PCV2 ORF2 基因序列較短且擁有較少的labor-extensive序列，其編碼的Cap蛋白不僅是病毒主要結構蛋白或衣殼蛋白，而且是PCV2全基因組中變異程度最高的蛋白，Cap的多態(tài)性既在病毒吸附過程中起重要作用，又影響病毒裝配動力學和結構穩(wěn)定性，因此ORF2基因經常被認為是引起PCV2整個基因組變異的主要靶基因[3,6]。

本研究采用PCR方法對2016年采自廣西北部灣地區(qū)疑似PCV2感染的豬病料樣品進行PCV2檢測并對分離株的ORF2基因進行擴增、克隆、測序和序列進化分析，以探討該區(qū)域近期PCV2的分子流行病學變異趨勢和變異規(guī)律，進而為PCVAD的分子診斷和免疫預防等研究提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 病料采集 采自2016年廣西玉林（興業(yè)、陸川、博白、北流）、北海（鐵山港、合浦）、欽州（浦北、靈山）、防城港（港口、東興、上思）、崇左（憑祥、龍州、大新、天等）、南寧（青秀、賓陽、馬山、上林、橫縣）等地區(qū)疑似PCV2感染的豬血液、脾臟、肺臟和淋巴結等樣品，保存于-40℃冰箱備用。

1.2 主要試劑 病毒基因組RNA/DNA提取試劑盒（MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver.5.0）、內切酶EcoRI和XhoI、T4連接酶、DNA Marker DL2000、pGEX-6p-1載體均購自TaKaRa公司；2×Taq PCR MasterMix和膠回收試劑盒均購自康為世紀生物科技有限公司；Trans 2K plus DNA Marker購自全式金生物技術有限公司；DH5α購自天根生化科技有限公司。

1.3 病毒核酸的提取 無菌條件下，取疑似感染PCV2豬的脾臟、肺臟和淋巴結等樣品10 mg置于陶瓷研缽中并加入適量液氮研磨，然后向研磨后的組織中加入200 μL RNase-free ddH2O混勻并按試劑盒說明書進行病毒DNA的抽提。其中，陰性對照用RNasefree ddH2O代替病毒核酸，陽性對照pSK-W質粒由西北農林科技大學動物醫(yī)學院饋贈。

1.4 引物設計與合成 利用湯智慧等[7]設計的P1/P2引物對病料樣品進行PCV2檢測，并根據GenBank中登錄的PCV2 杭州分離株（GenBank登錄號：AY188355）的全基因組序列進行ORF2基因擴增引物的設計與合成P3/P4，并在上、下游引物兩端分別添EcoRI和XhoI。P3：5'-CGGGATCCATGACGTA TCCAAGGAGGC-3'和P4：5'- CCGCTCGAGTTA AGGGTTAAGTGGGGGGTC-3'，由華大基因公司合成。

1.5 樣品PCR檢測 用上述提取的病毒DNA作為模板，以P1/P2為引物，采用 PCR方法檢測樣品中PCV2。反應體系：上游引物1.0 μL、下游引物1.0 μL、2×Taq PCR MasterMix 10.0 μL、樣品DNA模板1.0 μL、補足ddH2O 至20 μL。反應條件參照湯智慧等[7]方法進行，最后12℃ 終止反應。

1.6 ORF2基因的擴增、克隆及測序 對于PCV2陽性的病料，隨機選取其中4份DNA作為模板，用P3/P4作為擴增引物，擴增樣品中PCV2 ORF2基因，反應體系同上，反應條件：95℃預變性5 min；94℃變性30 s，53℃退火40 s，72℃延伸40 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min；12℃ 終止反應。

1.7 ORF2基因序列分析 利用生物軟件Lasergene將測序的4株PCV2 ORF2基因與GenBank 中登錄的 34 株國內外 PCV2 參考株ORF2序列進行核苷酸和氨基酸序列的比對分析，并對已比對的序列使用MEGA 7.0軟件構建Neighbor-joining系統(tǒng)進化樹，以分析廣西北部灣地區(qū)PCV2 ORF2基因的遺傳變異情況。

2 結果

2.1 樣品中PCV2的檢測 采集的306份病料經P1/P2特異性引物擴增后，129份樣品得到332 bp的特異性條帶，條帶大小與預期結果相符（圖1），說明樣品中PCV2檢出陽性率為42.16% （129/306）。

2.2 ORF2基因擴增與測序 利用P3/P4引物，擴增陽性病料中的PCV2 ORF2基因，獲得4個大小約為702 bp的目的片段，與預期結果相符（圖2）。將上述目的片段純化，經雙酶切、膠回收、連接和再次雙酶切驗證后，送至華大基因公司測序，測序無誤的4個ORF2基因序列所對應的PCV2分離株分別命名為BBW-1（玉林）、BBW-2（北海）、BBW-3（防城港）和BBW-4（南寧）。

圖1 部分樣品中PCV2的PCR檢測結果Fig.1 The PCR products of PCV2 in partial samples

2.3 ORF2基因的序列分析 應用生物軟件Lasergene，對獲得的4個PCV2分離株的ORF2基因序列與國內外已發(fā)表的34株參考毒株的ORF2基因序列進行核苷酸和氨基酸序列的同源性分析，參考毒株的信息見表1。結果表明4株PCV2 ORF2基因的核苷酸同源性為98.9%～99.5%，其相對應的氨基酸同源性為93.9%～95.4%。其中BBW-1和BBW-2分離株與歐洲Fd3株（AY321984）同源性最高，分別達到99.4%和99.7%；BBW-3與歐洲Fd3株（AY321984）、375株（AY256460）和NL_PMWS_3株（AY484415）同源性最高，達到99.7%；BBW-4分離株與歐洲NL_PMWS_3株（AY484415）同源性最高，達到99.0%。

表1 PCV2遺傳進化分析的參考毒株Table 1 Representative PCV2 isolates used in the genetic variation and phylogenetic analyses

2.4 PCV2各分離株ORF2基因的遺傳進化樹分析 應用生物軟件MEGA 7.0對獲得的4株PCV2分離株ORF2基因的核苷酸序列進行分析，繪制了遺傳進化樹（圖3）。結果表明，4株PCV2分離株均屬于Group 1（PCV2b），因其序列的差異可分為2個基因亞型，即1A和1B[8-17]。其中BBW-1和BBW-2分離株的ORF2基因與法國流行毒株Fd3株的親緣關系較近，屬于1A分支；BBW-3和BBW-4分離株的ORF2基因與國內流行毒株BJW株的親緣關系較近，屬于1B分支。

2.5 PCV2各分離株ORF2基因編碼氨基酸序列的遺傳變異分析 應用生物軟件Lasergene將測定的4株PCV2分離株的ORF2基因的核苷酸序列推導出相應的Cap蛋白氨基酸序列，并與國內外已發(fā)表的34株參考毒株的Cap蛋白氨基酸序列進行了比對分析（圖4）。結果表明，分離的4株PCV2分離株的Cap蛋白氨基酸序列存在多處突變，尤其存在1個變異度較高的主要區(qū)域，即57～63 aa。其中BBW-1 分離株與Fd3株（AY321984/France）同源性最高，BBW-2 分離株與NL_PMWS_3株（AY484415/Netherlands）同源性最高，BBW-4 分離株與HuZhou0301株（AY536756/Zhejiang-China）和NL_Control_1株（AY484407/Netherlands）同源性最高，然而卻并未發(fā)現(xiàn)與BBW-3分離株一致的參考毒株，只是BBW-3與BBW-2、BBW-4分離株都比較相似。

圖3 PCV2 ORF2基因系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic evolutionary tree of ORF2 gene of PCV2 isolates

3 討論

北部灣經濟區(qū)地處廣西西南部，是中國與東盟國家之間貿易往來的窗口，更是海上絲綢之路的起點。由于氣候適宜，地域優(yōu)勢明顯，適合發(fā)展養(yǎng)豬業(yè)，儼然成為全國生豬養(yǎng)殖優(yōu)勢區(qū)域。然而，隨著養(yǎng)豬產業(yè)的大力發(fā)展和外來種豬（如加系、美系和皮特蘭種豬等）的廣泛引入，越來越多的傳染病在地區(qū)暴發(fā)或流行，并在一定程度上阻礙了北部灣地區(qū)養(yǎng)豬業(yè)的進一步發(fā)展。PCV2是危害世界養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染病之一，目前已呈全球性流行，盡管疫苗的使用和采用捕殺等方式在豬圓環(huán)病毒病的控制中發(fā)揮了巨大作用，但豬圓環(huán)病毒病時有發(fā)生，而且多數豬廣泛帶毒，尤其是PCV2隱性感染和繼發(fā)感染現(xiàn)象嚴重，再加上PCV2遺傳變異頻率居高不下，PCV2感染所帶來的危害和造成的重大經濟損失已引起世界動物衛(wèi)生組織（OIE）的高度重視[3]。

鑒于此，本研究著重對廣西北部灣地區(qū)規(guī)模豬場和農村散養(yǎng)戶的疑似PCV2感染豬的肺臟、脾臟、淋巴結和血液等樣品進行了PCV2病原體的檢測，同時基于PCV2分離株ORF2基因的核苷酸和氨基酸序列對該區(qū)域PCV2流行毒株的分子流行病學特點和遺傳變異情況進行了分析。結果顯示：目前廣西北部灣地區(qū)豬群中普遍存在PCV2感染，PCV2陽性率高達42.16%，這一結果略高于劉翠權等[18]針對2007～2009年廣西規(guī)模場豬群中PCV2的調查結果（34.52%），但是顯著高于胡帥等[19]與針對2013～2014年廣西部分地區(qū)豬群中PCV2的調查結果（18.54%），說明幾年來PCV2感染有顯著上升的趨勢，尤其是在“一帶一路”大背景下的頻繁貿易往來可能會加速PCV2的遺傳漂變和傳播。通過對獲得的4株PCV2分離株的ORF2基因序列分析表明，4株PCV2分離株均屬于PCV2b基因亞型，且彼此之間的核苷酸序列同源性也都在90%以上，其中BBW-1和BBW-2分離株與歐洲代表株Fd3的同源性較高，而且在進化樹上的關系也比較接近，因此把它們劃歸為1A分支。同樣的情況，我們把BBW-3和BBW-4分離株劃歸為1B分支。通過對4株PCV2分離株與東盟各國PCV2代表毒株的比對分析顯示，廣西北部灣地區(qū)PCV2流行毒株與馬來西亞株Mal001/11-Melaka（JF690923）和Farm X （EU391637）、越南株178-HnDfu （KM042405）和新加坡株US 9315551（HL781461）親緣關系較近（圖4），由此推斷，本研究獲得的4株PCV2分離株很可能來自東盟國家，進一步反映了當前廣西北部灣地區(qū)PCV2疫情防控的復雜性。

圖4 PCV2毒株間的Cap序列的比對分析Fig.4 Comparison analysis of Cap amino acid sequence of PCV2 isolates

PCV2 ORF2基因較短，而且相對PCV2全長基因組而言又擁有較少的labor-extensive序列，因此學者在對PCV2進行分子流行病學調查或者遺傳進化分析時常把ORF2基因作為主要靶基因[3,6]。ORF2基因編碼的Cap蛋白是PCV2的主要抗原，其所擁有的3個主要抗原位點（分別位于47～63 aa、165～200 aa和230～233 aa）也是最容易發(fā)生變異的區(qū)域，因此也就成為了PCV2遺傳變異分析的結構之一。本研究結果表明，雖然獲得的4株PCV2分離株的Cap蛋白之間的氨基酸同源性較高，但是仍然存在多處氨基酸突變，尤其是在57～63 aa區(qū)域變異更為明顯，而該區(qū)域剛好位于Cap蛋白的高突變區(qū)域之一，即47～63 aa，因此其結果可能影響中和抗體與相應抗原位點的結合，導致現(xiàn)行PCV2疫苗免疫失敗。因此，為有效防控PCV2，今后應加強對該區(qū)域PCV2的分子流行病學調查和遺傳進化分析。