高 堃 華營(yíng)鵬 宋海星 官春云 張振華 周 婷,*

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甘藍(lán)型油菜PIN家族基因的鑒定與生物信息學(xué)分析

高 堃1,2華營(yíng)鵬1,2宋海星1,2官春云3張振華1,2周 婷1,2,*

1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院, 湖南長(zhǎng)沙 410128;2南方糧油作物協(xié)同創(chuàng)新中心, 湖南長(zhǎng)沙 410128;3國(guó)家油料作物改良中心湖南分中心, 湖南長(zhǎng)沙 410128

PIN家族基因是一類調(diào)控植物生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸?shù)闹匾d體元件, PIN基因編碼生長(zhǎng)素輸出蛋白, 介導(dǎo)生長(zhǎng)素在植物體的運(yùn)輸, 然而在基因組較復(fù)雜的甘藍(lán)型油菜中缺乏系統(tǒng)研究。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)方法在甘藍(lán)型油菜全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)篩選甘藍(lán)型油菜PIN家族基因, 對(duì)鑒定出的29個(gè)基因開(kāi)展拷貝數(shù)變異、分子特征、跨膜結(jié)構(gòu)域、保守基序、染色體定位、系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建、PIN蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)等研究, 結(jié)合高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序進(jìn)行低氮脅迫下的轉(zhuǎn)錄水平分析。結(jié)果表明, 甘藍(lán)型油菜PIN家族基因拷貝數(shù)明顯多于擬南芥、甘藍(lán)和白菜所具有的PIN家族基因數(shù)量; BnPINs蛋白多屬于由堿性氨基酸組成的穩(wěn)定蛋白, 含有保守的N末端結(jié)構(gòu)域, 二級(jí)結(jié)構(gòu)與擬南芥PIN蛋白相似; 系統(tǒng)進(jìn)化選擇能力分析表明,基因與甘藍(lán)和白菜PIN家族基因進(jìn)化關(guān)系相近。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序表明,、、基因主要在甘藍(lán)型油菜根部表達(dá)且受長(zhǎng)期低氮(72 h)誘導(dǎo),和基因主要在地上部表達(dá), 低氮會(huì)抑制表達(dá)。本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究甘藍(lán)型油菜PIN家族基因生物學(xué)功能尤其是在響應(yīng)低氮脅迫中的功能奠定基礎(chǔ), 為已知大量數(shù)據(jù)的其他物種家族基因生物信息學(xué)研究提供參考。

甘藍(lán)型油菜; 生長(zhǎng)素;; 家族基因; 生物信息學(xué)

生長(zhǎng)素是具有極性運(yùn)輸特點(diǎn)的植物激素, 主要在植物葉原基、幼葉、根和發(fā)育的種子中合成, 通過(guò)極性運(yùn)輸?shù)桨屑?xì)胞調(diào)節(jié)作物一系列生理反應(yīng)和生長(zhǎng)發(fā)育[1]。生長(zhǎng)素在細(xì)胞間的運(yùn)輸依賴于細(xì)胞膜上定位的AUXIN RESISTANT1/LIKE AUX1(AUX/ LAX)和PIN-FORMED(PIN)以及ATP-Binding Cassette subfamily B/P-glycoprotein (PGP/ABCB)生長(zhǎng)素運(yùn)輸載體, AUX/LAX屬于生長(zhǎng)素內(nèi)向型運(yùn)輸?shù)鞍? 在擬南芥中有AUXIN1(AUX1)、LIKE AUX1 (LAX1)、LAX2和LAX3共4個(gè)成員; 而PIN/ PGP/ABCB屬于生長(zhǎng)素外向型運(yùn)輸?shù)鞍譡2]?；蚓幋a的蛋白是最重要的生長(zhǎng)素外輸載體, 幾乎存在于所有單子葉和雙子葉植物中[3]。植物基因最早在擬南芥中被發(fā)現(xiàn)[4], AtPIN1蛋白在細(xì)胞膜上呈極性分布, 負(fù)責(zé)將生長(zhǎng)素從胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)桨鈁5]。隨后發(fā)現(xiàn)擬南芥PIN家族蛋白共有8個(gè)成員, 命名為PIN1~PIN8[6]。PIN1蛋白在植物發(fā)育中具有重要作用, 主要參與胚的發(fā)育、葉序和葉脈的形成及維管組織分化, 負(fù)責(zé)生長(zhǎng)素在莖尖分生組織環(huán)流及從地上部到根的運(yùn)輸[7]; PIN2蛋白主要參與根的向重力生長(zhǎng),突變體表型為向重力生長(zhǎng)缺陷[8];基因主要參與植物的向性生長(zhǎng), 組織化學(xué)染色表明其主要在維管組織和黃化苗頂端彎鉤表達(dá)[9]; PIN4蛋白極性定位在內(nèi)皮層、皮層和維管組織細(xì)胞膜上, 參與生長(zhǎng)素向根尖靜止中心運(yùn)輸[10]; PIN5蛋白定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上, 主要負(fù)責(zé)生長(zhǎng)素從胞質(zhì)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔的運(yùn)輸[11]; Benková等[12]研究發(fā)現(xiàn),基因在整個(gè)側(cè)根發(fā)育過(guò)程中均有表達(dá);基因在胚發(fā)育早期就有表達(dá), 根尖柱狀細(xì)胞定位的PIN7蛋白主要參與根的向重力生長(zhǎng)[13];基因在花藥中特異表達(dá), 調(diào)控花粉發(fā)育, PIN8蛋白與PIN5蛋白都定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上, 二者在調(diào)控配子體、孢子體發(fā)育和植物體內(nèi)生長(zhǎng)素平衡等方面具有拮抗作用[14]; PIN1、PIN2和PIN7蛋白在異源表達(dá)系統(tǒng)被證明有向胞外運(yùn)輸生長(zhǎng)素的活性, 且該過(guò)程不需要其他因子參與[15]。生長(zhǎng)素在植物根部有2種運(yùn)輸方式, 一是通過(guò)中柱向根尖的向頂運(yùn)輸, 二是根尖生長(zhǎng)素經(jīng)表皮和皮層細(xì)胞回運(yùn)的向基運(yùn)輸[16], PIN1和PIN4蛋白共同調(diào)控向頂運(yùn)輸, PIN2和PIN3蛋白參與向基運(yùn)輸[17]。除PIN家族蛋白外, 藥物抗性糖蛋白(multidrug-resistance- p-glycoproteins, MDR/PGPs)家族成員MDR1、PGP1、PGP2、PGP4和PGP19也有向胞外輸出生長(zhǎng)素的功能[18]。

迄今為止, 在玉米、水稻、大豆、小麥等作物上克隆了許多同源基因, 但在甘藍(lán)型油菜中尚未報(bào)道。油菜是世界上重要的油料作物, 提供人類所需的主要植物油, 其在保證食用油供給、改善食物結(jié)構(gòu)、促進(jìn)養(yǎng)殖業(yè)和輕紡工業(yè)發(fā)展等方面具有重要作用[19]。甘藍(lán)型油菜(, AnAnCnCn, ~ 1345 Mb, 2=4x=38)屬于十字花科蕓薹屬油料作物[20], 是白菜(, ArAr, ~485 Mb, 2=2x=20)和甘藍(lán)(, CoCo, ~630 Mb, 2=2x=18)2個(gè)二倍體基本種在7500年前通過(guò)天然遠(yuǎn)緣雜交形成的異源四倍體作物, 全基因組包含約十萬(wàn)多個(gè)蛋白編碼基因[21], 進(jìn)化、遺傳的復(fù)雜性在一定程度上影響了各種功能基因在甘藍(lán)型油菜生長(zhǎng)發(fā)育中的作用。氮是植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的大量營(yíng)養(yǎng)元素, 被譽(yù)為“生命元素”, 同時(shí), 油菜對(duì)氮缺乏極其敏感[22]。已有研究表明, 生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸在植物的氮脅迫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[23-24]。目前并不清楚PIN家族基因是如何響應(yīng)氮素缺乏的?；谏鲜鲅芯勘尘? 本研究也開(kāi)展了甘藍(lán)型油菜PIN家族基因?qū)Σ煌毓?yīng)水平的轉(zhuǎn)錄響應(yīng)研究。

本研究以擬南芥PIN家族基因?yàn)閰⒖夹蛄? 在甘藍(lán)型油菜全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行了BnPINs家族基因的鑒定, 借助生物信息學(xué)方法研究了甘藍(lán)型油菜PIN家族基因的序列信息、分子特征、保守基序特征、染色體定位、系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及低氮脅迫下的表達(dá), 旨在了解甘藍(lán)型油菜PIN家族基因的遺傳信息和編碼的BnPINs蛋白結(jié)構(gòu), 為進(jìn)一步揭示該家族基因的生物學(xué)功能奠定研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究水培試驗(yàn)所用甘藍(lán)型油菜品種為“湘油15”。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 甘藍(lán)型油菜PIN家族基因的鑒定 本研究中擬南芥PIN家族蛋白信息參考Paponov[3]分析結(jié)果。首先利用AtPINs為原始序列, 使用在線工具Pfam[25](http://pfam.xfam.org/)和SMART[26](http:// smart.emblheidelberg.de/)分析AtPINs序列, 分析結(jié)果顯示AtPINs具有跨膜結(jié)構(gòu)域。其次下載甘藍(lán)型油菜全基因組數(shù)據(jù)(http://brassicadb.org/brad/), 并利用Bio Edit軟件構(gòu)建本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù), 用含有跨膜結(jié)構(gòu)域的AtPINs序列進(jìn)行本地?cái)?shù)據(jù)庫(kù)BLAST檢索, 設(shè)定檢索參數(shù)E值

1.2.2 甘藍(lán)型油菜PIN家族基因生物信息學(xué)分析

使用ExPASy (http://www.expasy.org/tools)[27]中Prot-Param和Prot Scale工具分析BnPINs蛋白的氨基酸組分和理化性質(zhì), 應(yīng)用TMHMM (http://www. cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)[28]預(yù)測(cè)BnPINs蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)。

1.2.3 保守結(jié)構(gòu)域和保守殘基的鑒定 使用SMART (http://smart.emblheidelberg.de/)[26]鑒定保守結(jié)構(gòu)域, 并使用Pfam (http://pfam.xfam.org/)注釋[25]。使用Vector NTI對(duì)保守殘基進(jìn)行多重比對(duì)分析。

1.2.4 甘藍(lán)型油菜PIN蛋白保守基序分布信息獲取

運(yùn)用MEME Version 4.9.1 (http://meme.nbcr.net/ meme/cgi-bin/meme.cgi)[29]在線工具分析BnPINs蛋白的保守基序信息, 設(shè)置最大基序檢索值為10。

1.2.5 甘藍(lán)型油菜PIN家族基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

運(yùn)用Clustal X version 2.1[30]對(duì)擬南芥、甘藍(lán)、白菜PIN家族蛋白的氨基酸序列和本研究鑒定的BnPINs蛋白氨基酸序列進(jìn)行多重比對(duì), 使用MEGA6.0[31]分析比對(duì)結(jié)果并采用鄰接法(neighbor- joining, NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù), 設(shè)定泊松校正法計(jì)算進(jìn)化距離和重復(fù)1000次的自展法(bootstrap)檢驗(yàn)。

1.2.6 甘藍(lán)型油菜PIN家族基因染色體定位分析

利用Pfam[25](http://pfam.xfam.org/)對(duì)本研究篩選到的基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)域判定, 去除冗余基因,確定位置信息, 利用Circos 0.6[32]構(gòu)建PIN家族基因染色體分布圖譜。

1.2.7 甘藍(lán)型油菜PIN蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 使用2種不同的工具進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析: GOR4 (https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/page=npsagor4. html/)[33]和PSIPRED (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/ PSIPRED/)[34-35]。使用Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic. ac.uk/phyre2/html)[36]預(yù)測(cè)BnPINs蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.8 低氮脅迫下甘藍(lán)型油菜PIN家族基因時(shí)空表達(dá)和共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

1.2.8.1 營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)試驗(yàn) 培養(yǎng)試驗(yàn)在湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物營(yíng)養(yǎng)與養(yǎng)分高效利用課題組光照培養(yǎng)室進(jìn)行, 溫度設(shè)置為22oC, 光照周期為14 h (光照)/10 h (黑暗), 光照強(qiáng)度為300~320 μmol m–2s–1, 濕度為60%~75%。選取大小一致的油菜種子, 用1%的NaClO滅菌10 min, 將種子表面沖洗干凈后, 4oC下用滅菌超純水(>18.25 MΩ)浸泡24 h, 然后將種子播種到塑料育苗盤(pán)固定的紗布上, 育苗盤(pán)中加適量超純水。1周后將長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗移栽至盛有10 L營(yíng)養(yǎng)液的黑色塑料盆中, 營(yíng)養(yǎng)液采用Hoagland配方[37]。試驗(yàn)設(shè)置2個(gè)氮水平: 正常氮(9 mmol L–1NO3–)和低氮(0.3 mmol L–1NO3–)。

1.2.8.2 高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 油菜幼苗先在正常氮水平培養(yǎng)10 d, 然后將其移至低氮處理, 地上部(S)和根(R)在0、3和72 h取樣, 每個(gè)處理準(zhǔn)備3個(gè)獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)。測(cè)序平臺(tái)為Illumina Hiseq 2000[38], 每個(gè)樣品產(chǎn)生6.0-Gb測(cè)序數(shù)據(jù), 測(cè)序方式為雙末端(PE)測(cè)序, 讀長(zhǎng)為150 bp。使用Multiple Experiment Viewer (http://www.tm4.org/mev.html)[39]繪制基因表達(dá)譜的熱圖, 使用錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)≤0.05和倍數(shù)變化(log2)≥1作為鑒定差異表達(dá)基因的閾值。

1.2.8.3 基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析 構(gòu)建基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)鑒定BnPINs家族基因相互作用的強(qiáng)弱并定位低氮脅迫下連接最相鄰的核心基因, 相關(guān)值閾值設(shè)置為默認(rèn)參數(shù)(http://plantgrn.noble.org/DeGNServer/ Analysis.jsp), 然后用Cytoscapev.3.2.1 (http://www. cytoscape.org/)[40]進(jìn)行基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖譜的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 十字花科作物PIN家族基因拷貝數(shù)變異

以AtPINs的氨基酸序列為查詢對(duì)象, 對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST搜索, 在異源四倍體甘藍(lán)型油菜中鑒定了29個(gè), 明顯多于擬南芥、甘藍(lán)和白菜具有的PIN家族基因數(shù)量。然而甘藍(lán)型油菜中基因數(shù)量遠(yuǎn)少于甘藍(lán)和白菜中的總數(shù), 表明在異源多倍體過(guò)程中遭受嚴(yán)重的基因損失。29個(gè)BnPINs家族基因包括2個(gè)、6個(gè)、4個(gè)、4個(gè)、4個(gè)、2個(gè)、5個(gè)和2個(gè)(圖1)。

圖1 甘藍(lán)型油菜、擬南芥、甘藍(lán)、白菜PIN家族基因拷貝數(shù)變異

柱狀圖頂部數(shù)值為該物種拷貝的基因數(shù)目。

The number at the top of the histogram is the number of genes copied for that species.

2.2 甘藍(lán)型油菜PIN家族基因分子特征

利用AtPINs數(shù)據(jù)在甘藍(lán)型油菜全基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中共檢索到29條基因序列, 鑒定結(jié)果和序列分析表明, 29個(gè)基因編碼的蛋白質(zhì)平均含有527個(gè)氨基酸。氨基酸數(shù)目最多的是BnPIN2e蛋白, 長(zhǎng)度為643個(gè)氨基酸, 預(yù)測(cè)分子量是69.44 kDa, 理論等電點(diǎn)(pI)為9.24; 氨基酸數(shù)目最少的是BnPIN5a蛋白, 長(zhǎng)度為348個(gè)氨基酸, 預(yù)測(cè)分子量是38.25 kDa, 理論等電點(diǎn)(pI)為5.96; 29條編碼的蛋白質(zhì)等電點(diǎn)變化范圍為5.96 (BnPIN5a)~9.38 (BnPIN2f), 大部分編碼氨基酸為堿性氨基酸, 僅有BnPIN4d、BnPIN5a、BnPIN5b、BnPIN5c和BnPIN5d蛋白主要由酸性氨基酸組成; BnPIN2e蛋白的外顯子/內(nèi)含子數(shù)量最多, 含有13個(gè)外顯子/12個(gè)內(nèi)含子; 根據(jù)親水性指數(shù)介于-0.5~ +0.5為兩性蛋白(GRAVY為負(fù)值表示親水性, 正值表示疏水性)的原則[41], 發(fā)現(xiàn)僅有BnPIN5a、BnPIN5b、BnPIN5c、BnPIN5d和BnPIN8a、BnPIN8b是疏水性蛋白, 其余均為兩性蛋白(表1)。

2.3 甘藍(lán)型油菜PIN家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域和氨基酸系列比對(duì)分析

使用SMART分析BnPINs蛋白保守結(jié)構(gòu)域, 由圖2可以看出, 即使BnPIN蛋白保守結(jié)構(gòu)域在同一個(gè)類別, 其位置也有差異。29個(gè)BnPINs蛋白都具有跨膜結(jié)構(gòu)域, 都在第7~641位的氨基酸殘基片段上, BnPIN1a蛋白具有最少的跨膜結(jié)構(gòu)域(5個(gè)); BnPIN5dBnPIN7bBnPIN7cBnPIN8b蛋白具有最多的跨膜結(jié)構(gòu)域(均含10個(gè)); 絕大部分BnPINs蛋白還有1~2個(gè)位于第132~453位氨基酸殘基片段的低容量跨膜結(jié)構(gòu)域(除了BnPIN7a蛋白位于第76~88位殘基片段上外), 但BnPIN2d、BnPIN3b、BnPIN5a、BnPIN5b、BnPIN5c、BnPIN7c、BnPIN8b蛋白均不含有。通過(guò)PIN家族蛋白氨基酸系列比對(duì), 鑒定出BnPINs蛋白高度保守的氨基酸殘基, Phe-49、Pro-52、Pro-64、Val-159、Gln-161、Trp-165、Leu-170、Phe-171、Glu-174、Lys-538、Asn-542、Pro-543、Asn-544、Tyr-546、Gly-551、Trp-554、Phe-567、Ser-573、Ser-578、Gly-581、Gly-583、Met-586、Phe-587、Phe-643, 這24個(gè)氨基酸殘基在所有BnPINs蛋白系列中均高度保守(圖3)。這些結(jié)果表明, BnPINs蛋白具有參與生長(zhǎng)素外向型運(yùn)輸?shù)目缒そY(jié)構(gòu)域。

2.4 甘藍(lán)型油菜PIN家族基因染色體的位置

染色體定位發(fā)現(xiàn),基因并不是均勻分布在甘藍(lán)型油菜基因組中, 29個(gè)分布于A/C亞基因組, 13個(gè)基因分別位于A亞基因組的A2、A3、A7、A8、A10染色體, 10個(gè)基因分別位于C亞基因組的C2、C3、C6、C7、C8、C9染色體。、、、位于A2染色體,、位于A3染色體,、、、位于A7染色體,位于A8染色體,、位于A10染色體, 而、位于C2染色體,、位于C3染色體,、、位于C6染色體,位于C7染色體,位于C8染色體,位于C9染色體, 其余6個(gè)基因由于基因組拼接及注釋不完整具體物理位置尚未確定(圖4)。

2.5 甘藍(lán)型油菜PIN家族蛋白保守基序分布

保守基序分析發(fā)現(xiàn), BnPINs蛋白N末端具有保守1 (motif 1)基序。甘藍(lán)型油菜PIN家族蛋白保守基序數(shù)量變化具有一定規(guī)律, 數(shù)量為1~10, 除了BnaC02g20430D、BnaCnng76990D外, 其他序列都含有10個(gè)保守基序。BnaCnng54140D、BnaA10g 17940D、BnaC03907830D、BnaA03g06090D、Bna Cnng51580D和BnaA02g02480D缺失8 (Motif 8)基序(圖5)。

2.6 甘藍(lán)型油菜PIN家族基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用鄰接法構(gòu)建甘藍(lán)型油菜、擬南芥、甘藍(lán)和白菜PIN家族基因系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。由圖6可知: (1)整個(gè)進(jìn)化樹(shù)可分為兩大組, 第一組是~和基因, 第二組為、和基因, 該結(jié)果與Cazzonelli等[42]將擬南芥PIN蛋白分為PIN1組(AtPIN1~AtPIN4和AtPIN7)和PIN5組(AtPIN5、AtPIN6和AtPIN8)結(jié)果一致。(2) BnPINs家族基因與甘藍(lán)和白菜基因進(jìn)化關(guān)系較近,和、和、和、和均位于同一個(gè)進(jìn)化分支,和進(jìn)化關(guān)系也相近。、和分別與、和基因進(jìn)化關(guān)系密切。

藍(lán)色代表跨膜結(jié)構(gòu)域, 粉色代表低復(fù)雜度結(jié)構(gòu)。

Transmembrane regions are in blue and low complexities are in pink.

2.7 甘藍(lán)型油菜PIN蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

使用GOR4和SPIPRED進(jìn)行BnPINs蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)分析, GOR4和SPIPRED預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)類似(圖7)。運(yùn)用Phyre2數(shù)據(jù)庫(kù)、分析的保守氨基酸殘基和PIN蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)對(duì)BnPINs蛋白進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(圖8)。由BnPIN5b蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)和BnPIN2a蛋白三級(jí)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)可知, α螺旋是BnPINs蛋白的主要結(jié)構(gòu), BnPIN5b蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)特征為, α螺旋>延伸鏈>無(wú)規(guī)則卷曲>β轉(zhuǎn)角, 這些結(jié)果與PIN蛋白向胞外運(yùn)輸生長(zhǎng)素的功能緊密聯(lián)系。

圖3 甘藍(lán)型油菜PIN家族蛋白氨基酸序列比對(duì)和保守結(jié)構(gòu)域分析

黃色區(qū)域?yàn)楦叨缺Ｊ氐陌被嵛稽c(diǎn)。

The yellow area is a highly conserved amino acid site.

圖4 23個(gè)甘藍(lán)型油菜PIN基因染色體分布

圖5 甘藍(lán)型油菜PIN家族蛋白保守基序分布

左側(cè)為蛋白系列名稱, 右側(cè)不同顏色分別對(duì)應(yīng)不同的保守基序在系列上的位置。

The different colors on the right correspond to the positions of different conserved motifs on the series, respectively.

2.8 甘藍(lán)型油菜PIN家族基因在低氮脅迫下時(shí)空表達(dá)和基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

由圖9可以看出,、、基因主要在甘藍(lán)型油菜根部表達(dá)且受長(zhǎng)期低氮(72 h)誘導(dǎo);和基因主要在地上部表達(dá), 低氮會(huì)抑制表達(dá)。為了進(jìn)一步確定29個(gè)中哪一個(gè)是核心基因, 又構(gòu)建了基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò),被鑒定為核心基因, 在低氮脅迫下, 29個(gè)基因在地上部的表達(dá)有一定規(guī)律(圖10-A); 基因表達(dá)量幾乎都隨著低氮脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而先下降后上升, 且在3 h出現(xiàn)最低值, 但在根部未出現(xiàn)這一規(guī)律(圖10-B)。

3 討論

生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸與植物生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān), 如植物的向光性、向地性、頂端優(yōu)勢(shì)、根形成、花發(fā)育、胚胎形態(tài)建成、維管組織形成等[43]。隨著分子生物學(xué)和遺傳學(xué)發(fā)展, 在生長(zhǎng)素結(jié)合蛋白、外輸載體和相關(guān)基因克隆等領(lǐng)域已取得一系列進(jìn)展。鑒定了多種擬南芥生長(zhǎng)素運(yùn)輸載體, 對(duì)其功能和運(yùn)輸機(jī)制進(jìn)行了研究, 而在其他作物中的此類研究十分有限。本研究發(fā)現(xiàn)BnPINs家族基因與甘藍(lán)和白菜基因進(jìn)化關(guān)系相近, 但在遺傳和進(jìn)化過(guò)程中基因遭受嚴(yán)重?fù)p失,基因拷貝數(shù)丟失。BnPINs蛋白多為堿性氨基酸組成的穩(wěn)定蛋白, 定位在細(xì)胞質(zhì)膜上, 具有保守的N末端結(jié)構(gòu)域和5~6次跨膜折疊, 二級(jí)結(jié)構(gòu)與AtPIN蛋白相似, 這些結(jié)構(gòu)與BnPINs蛋白向胞外運(yùn)輸生長(zhǎng)素的功能緊密相關(guān)。因此, 鑒定并獲得不同物種PIN家族基因的遺傳和進(jìn)化信息, 了解其編碼的PIN蛋白結(jié)構(gòu), 對(duì)于進(jìn)一步研究PIN家族基因生物學(xué)功能和探索生長(zhǎng)素外向型運(yùn)輸載體(PIN蛋白)定位機(jī)制、影響定位的因素和運(yùn)輸載體之間的相互作用具有重要意義。

圖6 甘藍(lán)型油菜PIN家族基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

不同顏色代表不同的進(jìn)化分支, I、II代表家族2個(gè)亞組。

Different clades are in different colors, I and II above clades indicate the two subgroups offamily.

圖7 甘藍(lán)型油菜BnPIN5b蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分析

GOR4和PSIPRED分別是進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析的2種不同的工具。

GOR4 and PSIPRED are two tools for the secondary structure analysis.

圖8 甘藍(lán)型油菜BnPIN2a蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)該晶體為轉(zhuǎn)運(yùn)子。

The three-dimensional structure predicts that the crystal is a transporter.

近年來(lái), PIN蛋白通過(guò)調(diào)控生長(zhǎng)素調(diào)控植物逆境脅迫的研究層出不窮, 且在植物響應(yīng)營(yíng)養(yǎng)元素缺乏或毒害中也有報(bào)道。缺硼時(shí), 擬南芥通過(guò)調(diào)控基因的表達(dá)調(diào)控生長(zhǎng)素在根系的分布從而影響根系生長(zhǎng)[44]; 磷鎂互作時(shí)可能通過(guò)介導(dǎo)、和基因在根中的表達(dá)調(diào)控根系構(gòu)型[45]; 超表達(dá)水稻基因緩解了水稻根系鋁毒[46], 延遲了體內(nèi)磷素由營(yíng)養(yǎng)器官向生殖器官的轉(zhuǎn)移[47]。

油菜對(duì)氮素養(yǎng)分具有較高的營(yíng)養(yǎng)需求, 但其氮素利用率很低, 缺氮會(huì)嚴(yán)重抑制油菜產(chǎn)量和品質(zhì)的提高[22]。已有研究表明, 缺氮會(huì)增加擬南芥主莖中生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸水平, 從而增強(qiáng)頂端優(yōu)勢(shì), 造成地上部分枝數(shù)減少[23]。氮素缺乏可能通過(guò)改變生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸基因的表達(dá), 從而影響植株的生長(zhǎng)表型, 最終影響產(chǎn)量。由此可見(jiàn),基因與氮素營(yíng)養(yǎng)的互作在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序發(fā)現(xiàn),基因的表達(dá)具有較強(qiáng)組織特異性,、、基因主要在油菜根部表達(dá)且受長(zhǎng)期低氮(72 h)誘導(dǎo),和基因主要在地上部表達(dá), 低氮會(huì)抑制表達(dá), 反映了PIN家族基因時(shí)空表達(dá)的特性[48]。上述研究結(jié)果為進(jìn)一步揭示甘藍(lán)型油菜PIN家族基因在低氮脅迫下調(diào)控生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸作用奠定了研究基礎(chǔ), 為發(fā)展氮高效油菜新品種選育提供了新方向。

圖9 低氮脅迫下甘藍(lán)型油菜PIN家族基因轉(zhuǎn)錄組分析

S: 地上部; R: 根; 0、3、72 (h)代表缺氮脅迫的時(shí)間。圖中結(jié)果表示3次生物學(xué)重復(fù)的平均值。

S: shoot; R: root; 0, 3, and 72 (h) represent the time course of nitrogen deficiency. The results represent the average of three biological replicates.

圖10 低氮脅迫下甘藍(lán)型油菜PIN家族基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析和表達(dá)量分析

A: 共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析; B: 基因表達(dá)量分析; 圓圈節(jié)點(diǎn)代表基因, 節(jié)點(diǎn)的大小代表節(jié)點(diǎn)之間相互作用的能力, 兩個(gè)節(jié)點(diǎn)之間的連線代表基因之間的相互作用; S: 地上部; R: 根; 0、3、72 (h)代表缺氮脅迫的時(shí)間。圖中結(jié)果表示3次生物學(xué)重復(fù)的平均值。

A: co-expression network analysis; B: expression of PIN family genes; cycle nodes represent genes, and the size of the nodes represents the power of the interrelation among the nodes by degree value, edges between two nodes represent interactions between genes; S: shoot; R: root; 0, 3, and 72 (h) represents the time course of nitrogen deficiency. The results represent the average of three biological replicates.

4 結(jié)論

十字花科作物PIN家族基因拷貝數(shù)存在差異, 甘藍(lán)型油菜比與它進(jìn)化關(guān)系相近的甘藍(lán)和白菜具有更多同源基因,基因分別位于A/C亞基因組的A2、A3、A7、A8、A10、C2、C3、C6、C7、C8、C9染色體。BnPINs蛋白定位在細(xì)胞質(zhì)膜上, 主要是α螺旋結(jié)構(gòu), 多為兩性蛋白, 具有高度保守的氨基酸殘基位點(diǎn)、N端保守基序和多個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域, 表明BnPINs蛋白可作為細(xì)胞質(zhì)膜上的運(yùn)輸載體參與生長(zhǎng)素向胞外運(yùn)輸?；虮磉_(dá)具有組織特異性, 低氮脅迫顯著改變了一些基因的表達(dá)豐度, 進(jìn)而可能影響生長(zhǎng)素在作物體內(nèi)的分配, 最終影響作物生長(zhǎng)發(fā)育。

[1] 劉士平, 王璐, 王繼榮, 薛艷紅, 壽惠霞. 高等植物的基因家族. 植物生理學(xué)通訊, 2009, 45: 833–841 Liu S P, Wang L, Wang J R, Xue Y H, Shou H X.gene family in higher plants., 2009, 45: 833–841 (in Chinese)

[2] Petrá?ek J, Friml J. Auxin transport routes in plant development., 2009, 136: 2675–2688

[3] Paponov I A, Teale W D, Trebar M, Blilou I, Palme K. The PIN auxin efflux facilitators: evolutionary and functional perspectives., 2005, 10: 170–177

[4] Abas L, Benjamins R, Malenica N, Paciorek T, Wi?niewska J, Anzola J M, Sieberer T, Friml J, Luschnig C. Intracellular tra-fficking and proteolysis of the Arabidopsis auxin efflux facilitator PIN2 are involved in root gravitropism., 2006, 8: 249–256

[5] Schnabel E L, Frugoli J. Theandfamilies of auxin transport genes in., 2004, 272: 420–432

[6] Krecek P, Skupa P, Libus J, Naramoto S, Tejos R, Friml J, Za?ímalová E. The PIN-FORMED(PIN) protein family of auxin transporters., 2009, 10: 249–254

[7] G?lweiler L, Guan C, Müller A, Wisman E, Mendgen K, Yephremov A, Palme K. Regulation of polar auxin transport by AtPIN1 in Arabidopsis vascular tissue., 1998, 282: 2226–2230

[8] Blilou I, Xu J, Wildwater M, Willemsen V, Paponov I, Friml J, Heidstra R, Aida M, Palme K, Scheres B. The PIN auxin efflux facilitator network controls growth and patterning in Arabidopsisroots., 2005, 433: 39–44

[9] Ding Z, Galván-Ampudia C S, Demarsy E, ?angowski L, Kleine-Vehn J, Fan Y, Morita M T, Tasaka M, Fankhauser C, Offringa R. Light-mediated polarization of the PIN3 auxin transporter for the phototropic response in., 2011, 13: 447–452

[10] Friml J, Benková E, Blilou I, Wisniewska J, Hamann T, Ljung K, Woody S, Sandberg G, Scheres B, Jürgens G. AtPIN4 mediates sink-driven auxin gradients and root patterning in Arabidopsis., 2002, 108: 661–673

[11] Mravec J, Skupa P, Bailly A, Hoyerová K, Krecek P, Bielach A, Petrásek J, Zhang J, Gaykova V, Stierhof Y D, Dobrev P, Schwarzerová K, Rolcík J, Seifertová D, Luschnig C, Benková E, Zazimalová E, Geisler M, Friml J. Subcellular homeostasis of phytohormone auxin is mediated by the ER-localized PIN5 transporter., 2009, 459: 1133–1140

[12] Benková E, Michniewicz M, Sauer M, Teichmann T, Seifertová D, Jürgens G, Friml J. Local, efflux-dependent auxin gradients as a common module for plant organ formation., 2003, 115: 591–602

[13] Kleine-Vehn J, Ding Z, Jones A R, Tasaka M, Morita M T, Friml J. Gravity-induced PIN transcytosis for polarization of auxin fluxes in gravity-sensing root cells., 2010, 107: 22344–22349

[14] Ding Z, Wang B, Moreno I, Dupláková N, Simon S, Carraro N, Reemmer J, Pěn?ík A, Chen X, Tejos R, Skupa P, Pollmann S, Mravec J, Petrá?ek J, Za?ímalová E, Honys D, Rol?ík J, Murphy A, Orellana A, Geisler M, Friml J. ER-localized auxin transporter PIN8 regulates auxin homeostasis and male gametophyte deve-lopment in Arabidopsis., 2012, 3: 941

[15] Chen R, Hilson P, Sedbrook J, Rosen E, Caspar T, Masson P H. Thegene encodes a component of the polar-auxin-transport ef?ux carrier., 1998, 95: 15112–15117

[16] 李俊華, 種康. 植物生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸調(diào)控機(jī)理的研究進(jìn)展. 植物學(xué)通報(bào), 2006, 23: 466–477 Li J H, Chong K. Current research advances on polar auxin transport in plant., 2006, 23: 466–477 (in Chinese with English abstract)

[17] 劉進(jìn)平. 生長(zhǎng)素運(yùn)輸機(jī)制研究進(jìn)展. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2007, 23(5): 432–433Liu J P. Research advances on auxin transport mechanism., 2007, 23(5): 432–433 (in Chinese with English abstract)

[18] 李運(yùn)合, 孫光明, 吳蓓. 植物生長(zhǎng)素的極性運(yùn)輸載體研究進(jìn)展. 西北植物學(xué)報(bào), 2009, 29: 1714–1722 Li Y H, Sun G M, Wu B. Advances on carriers of plant polar auxin transport.-,2009, 29: 1714–1722(in Chinese with English abstract)

[19] 朱德進(jìn), 張輝, 黃卉, 寧運(yùn)旺, 張永春. 不同施肥處理對(duì)不同地力水平油菜產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益的影響. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 41(10): 73–76 Zhu D J, Zhang H, Huang H, Ning Y W, Zhang Y C. Different fertilization treatments on rape yield at different soil fertility levels and the impact of economic benefits.,2013, 41(10): 73–76(in Chinese with English abstract)

[20] Wang X, Wang H, Wang J, Sun R, Wu J, Liu S, Bai Y, Mun J H, Bancroft I, Cheng F. The genome of the mesopolyploid crop species., 2011, 43: 1035–1039

[21] Bayer P E, Hurgobin B, Golicz A, Chan C K, Yuan Y, Lee H T, Renton M, Meng J, Li R, Long Y, Zou J, Bancroft I, Chalhoub B, King G J, Batley J, Edwards D. Assembly and comparison of two closely relatedgenomes., 2017, 10: 1–9

[22] Rathke G W, Christen O, Diepenbrock W. Effects of nitrogen source and rate on productivity and quality of winter oilseed rape (L.) grown in different crop rotations., 2005, 94: 103–113

[23] de Jong M, George G, Ongaro V, Williamson L, Willetts B, Ljung K, Leyser O. Auxin and strigolactone signaling are required for modulation of Arabidopsis shoot branching by nitrogen supply., 2014, 166: 384–395

[24] Liu J X, An X, Cheng L, Chen F J, Bao J, Yuan L X, Zhang F S, Mi G H. Auxin transport in maize roots in response to localized nitrate supply., 2010, 106: 1019–1026

[25] Finn R D, Bateman A, Clements J, Coggill P, Eberhardt R Y, Eddy S R, Heger A, Hetherington K, Holm L, Mistry J, Sonnhammer E L L, Tate J, Punta M. Pfam: the protein families database., 2013, 27: 1–9

[26] Letunic I, Doerks T, Bork P. SMART: recent updates, new deve-lopments and status in 2015., 2015, 43: D257–D260

[27] Gasteiger E, Hoogland C, Gattiker A, Hoogland C, Ivanyi I, Appel R D, Bairoch A. ExPASy: the proteomics server for in-depth., 2003, 31: 3784–3788

[28] Hofmann K, Stoffel W. TM base-A database of membrane spanning protein segments., 1993, 374: 1-6

[29] Bailey T L, Elkan C. Fitting a mixture model by expectation maximization to discover motifs in biopolymers., 1994, 2: 28–36

[30] Larkin M A, Blackshields G, Brown N P, Chenna R, McGettigan P A, McWilliam H, Valentin F, Wallace I M, Wilm A, Lopez R, Thompson J D, GibsonT J, Higgins D G. Clustal W and Clustal X version 2.0., 2007, 23: 2947–2948

[31] Kumar S, Nei M, Dudley J, Tamura K. MEGA: a biologist centric software for evolutionary analysis of DNA and protein sequences., 2008, 9: 299–306

[32] Krzywinski M, Schein J, Birol I, Connors J, Gascoyne R, Horsman D, Jones S J, Marra M A. Circos an information aesthetic for comparative genomics., 2009, 19: 1639–1645

[33] Combet C, Blanchet C, Geourjon C, Deléage G. Network protein sequence analysis., 2000, 25: 147–150

[34] Jones D T. Protein secondary structure prediction based on position-specific scoring matrices., 1999, 292: 195–202

[35] Buchan D W A, Minneci F, Nugent T C O, Bryson K, Jones D T. Scalable web services for the PSIPRED protein analysis workbench., 2013, 41: W340–W348

[36] Mezulis S, Sternberg M J E, Kelley L A. Phyre Storm: a web server for fast structural searches against the PDB., 2016, 428: 702–708

[37] Hoagland D R, Arnon D I. The water culture method for growing plants without soil., 1950, 347: 32

[38] Morin D, Bainbridge M, Fejes A, Hirst M, Krzywinski M, Pugh T J, McDonald H, Varhol R, Jones S J M, Marra M A. Profiling the He La S3 transcriptome using randomly primed cDNA and massively parallel short-read sequencing., 2008, 45: 81–94

[39] Eisen M B, Spellman P T, Brown P O, Botstein D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns., 1998, 95: 14863–14868

[40] Kohl M, Wiese S, Warscheid B. Cytoscape: software for visualization and analysis of biological networks., 2011, 696: 291–303

[41] 王占軍, 金倫, 徐忠東, 歐祖蘭. 麻風(fēng)樹(shù)基因的生物信息學(xué)分析. 生物學(xué)雜志, 2014, 31(4): 68–72 Wang Z J, Jin L, Xu Z D, Ou Z L. Bioinformatics analysis of genefrom., 2014, 31(4): 68–72(in Chinese with English abstract)

[42] Cazzonelli1 C I, Vanstraelen M, Simon S, Yin K, Carron-Arthur A, Nisar N, Tarle G, Cuttriss A J, Searle I R, Benkova E, Mathesius U, Masle J, Friml J, Pogson B J. Role of thePIN6 auxin transporter in auxin homeostasis and auxin-mediated development., 2013, 8: 1–14

[43] 倪迪安, 許智宏. 生長(zhǎng)素的生物合成、代謝、受體和極性運(yùn)輸. 植物生理學(xué)通訊, 2001, 37: 346–352 Ni D A, Xu Z H. Auxin biosynthesis, metabolism, receptor and polar transport., 2001, 37: 346–352 (in Chinese)

[44] Li K, Kamiya T, Fujiwara T. Differential roles of PIN1 and PIN2 in root meristem maintenance under low-B conditions in., 2015, 56: 1205–1214

[45] Niu Y F, Jin G L, Li X, Tang C X, Zhang Y S, Liang Y C, Yu J Q.Phosphorus and magnesium interactively modulate the elongation and directional growth of primary roots in(L.) Heynh., 2015, 66: 3–14

[46] Wu D, Shen H, Yokawa K, Balu?ka F. Alleviation of aluminium-induced cell rigidity by overexpression ofin rice roots., 2014, 65: 5305–5315

[47] 陳贏男. 生長(zhǎng)素轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)水稻株型、根系生長(zhǎng)和磷素營(yíng)養(yǎng)的調(diào)控作用. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文, 江蘇南京, 2012Chen Y N. Regulation of Auxin Transporter on Plant Type, Root Growth and Phosphorus Nutrition in Rice. PhD Dissertation of Nanjing Agricultural University, Nanjing, Jiangsu, China, 2012(in Chinese with English abstract)

[48] Peer W N, Bandyopadhyay A, Blakeslee J J, Makam S N, Chen R J, Masson P H, Murphy A S. Variation in expression and protein localization of the PIN family of auxin efflux facilitator proteins in flavonoid mutants with altered auxin transport in., 2004, 16: 1898–1911

Identification and Bioinformatics Analysis of thePIN Family Gene in

GAO Kun1,2, HUA Ying-Peng1,2, SONG Hai-Xing1,2, GUAN Chun-Yun3, ZHANG Zhen-Hua1,2, and ZHOU Ting1,2,*

1College of Resource and Environment, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, Hunan, China;2Southern Regional Collaborative Innovation Center for Grain and Oil Crops in China, Changsha 410128, Hunan, China;3Hunan Branch, National Oil Crops Improvement Center, Changsha 410128, Hunan, China

The PIN family is a type of important carrier elements that regulate the polar transportation of auxin. Thegenes encode auxin efflux carriers with multiple transmembrane domains that mediate auxin transport in plants. However, there is a lack of systematic research in the genome of complexity. In this study, thegenes were screened from theDatabase using bioinformatics, and study on molecular characteristics of BnPIN proteins, such as copy number variations, transmembrane domains, conserved motifs, chromosomal locations, phylogenetic relationships, secondary and three-dimensional structures, and high-throughput transcriptome sequencing was used to analyze the transcriptional level under low nitrate stress. The results showed that most of the BnPIN proteins which is belonged to the stable protein consisting of basic amino acids. TheBnPIN family proteins contained secondary structures similar to those of Arabidopsis PINs accompanied by conserved N-terminal domains. The phylogenetic analysis showed thatgenes were similar to the corresponding homologs ofand. High-throughput transcriptome analysis showed that the,, andgenes were mainly expressed in roots ofunder long-term (72 h) low nitrate (NO3–) stress. Theandgenes were mainly expressed in the shoot and limited NO3–repressed theexpression. This study is valuable for the research that the roles of thefamily in the regulation of auxin transport. Our results also provide reference for the integrated genomic and transcriptomic studies of gene family in plant species with complex genomes.

; auxin;; gene family; bioinformatics

2018-01-30;

2018-06-12;

2018-06-29.

10.3724/SP.J.1006.2018.01334

周婷, E-mail: zhoutingplant@foxmail.com

E-mail: gaokun0874@foxmail.com

本研究由國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2017YFD0200103), 國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31101596, 31372130), 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)新進(jìn)教師科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(30555|550100100021), 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)校青年基金項(xiàng)目(17QN40)和國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資助。

This study was supported by the National Key R&D Program of China (2017YFD0200103), the National Natural Science Foundation of China (31101596, 31372130), the Research Starting Foundation for New Teachers of Hunan Agricultural University (30555|550100100021), the Youth Foundation of Hunan Agricultural University (17QN40), and the China Agriculture Research System.

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180628.1740.004.html