柯丹霞 彭昆鵬 張孟珂 賈 妍 王凈凈

?

大豆基因的克隆及抗鹽功能鑒定

柯丹霞*彭昆鵬 張孟珂 賈 妍 王凈凈

信陽師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 / 大別山農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用研究院, 河南信陽 464000

HD-Zip I類轉(zhuǎn)錄因子在植物抵御非生物脅迫過程中發(fā)揮重要功能, 本研究克隆得到1個(gè)大豆HD-Zip I類基因(homeodomain-leucine zipper protein 57)。序列分析表明,基因包含1個(gè)1038 bp的開放讀碼框, 編碼345個(gè)氨基酸, 具有HD-Zip類家族蛋白典型的保守結(jié)構(gòu)域?；驎r(shí)空表達(dá)分析表明, 大豆基因在大豆植株的各個(gè)不同時(shí)期及不同器官中均有表達(dá), 在花中表達(dá)量最高。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析了4種非生物脅迫(脫落酸、NaCl、PEG、冷)對(duì)幼苗期大豆根中基因表達(dá)的影響。結(jié)果表明, 該基因表達(dá)量受高鹽脅迫誘導(dǎo)顯著升高, 在脫落酸及干旱脅迫下上升幅度較小, 但在冷脅迫下呈下降趨勢(shì)。鹽脅迫前后基因在根中的表達(dá)量明顯高于莖和葉, 在鹽脅迫48 h時(shí)達(dá)到峰值, 72 h和96 h時(shí)表達(dá)量緩慢下降。此外, 構(gòu)建基因的植物超表達(dá)載體, 利用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法獲得轉(zhuǎn)基因百脈根, 200 mmol L–1NaCl處理?xiàng)l件下, 轉(zhuǎn)基因百脈根的株高、根長(zhǎng)、葉綠素含量、根系活力以及陽離子K+、Ca2+含量顯著高于野生型, 而丙二醛含量、相對(duì)質(zhì)膜透性以及Na+的含量明顯低于野生型。以上研究結(jié)果表明,基因參與了大豆對(duì)非生物脅迫的應(yīng)答過程, 過量表達(dá)基因能夠顯著提高百脈根的抗鹽能力。

大豆;基因; 非生物脅迫; 抗鹽性

大豆是世界上重要的油料、糧食和經(jīng)濟(jì)作物, 高鹽、干旱、低溫等非生物脅迫嚴(yán)重影響了大豆的生長(zhǎng)和產(chǎn)量。植物轉(zhuǎn)錄因子是一類重要的調(diào)控蛋白, 通過與靶基因互作以及不同轉(zhuǎn)錄因子之間形成復(fù)合物, 從而激活或抑制下游特定的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。研究表明, 轉(zhuǎn)錄因子在作物抵抗非生物脅迫信號(hào)途徑中發(fā)揮重要作用[1]。因此, 利用生物技術(shù)手段超量表達(dá)某一特定抗逆轉(zhuǎn)錄因子, 是培育大豆耐逆新品種, 提高大豆產(chǎn)量和品質(zhì)的一條行之有效的途徑。

同源異型域亮氨酸拉鏈蛋白HD-Zip (homeodomain leucine-zipper)是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子, 包含一個(gè)由60個(gè)或61個(gè)氨基酸組成的同源異型結(jié)構(gòu)域HD和一個(gè)亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域LZ[2]。參與非生物脅迫應(yīng)答的主要是HD-Zip I類蛋白[3]。擬南芥中有17個(gè)HD-Zip I類蛋白[4], 其中,和受干旱和外源ABA誘導(dǎo)表達(dá), 鹽脅迫和滲透脅迫能夠誘導(dǎo)的表達(dá)[5-6]。煙草HD-Zip I類基因受失水脅迫誘導(dǎo), 正調(diào)控ABA在葉片中的積累[7]。蒺藜苜蓿受NaCl脅迫誘導(dǎo), 在根中表達(dá)量呈上調(diào)趨勢(shì)[8]。紫花苜蓿受NaCl和ABA誘導(dǎo), 負(fù)調(diào)控植株對(duì)鹽脅迫的應(yīng)答反應(yīng)[9]。野生大豆HD-Zip I類基因受堿脅迫誘導(dǎo)在葉片和根中高表達(dá), 超量表達(dá)提高了轉(zhuǎn)基因擬南芥對(duì)碳酸鹽的耐受性, 這一新發(fā)現(xiàn)為揭示野生大豆耐鹽堿脅迫機(jī)制提供了線索[10]。

目前, 在大豆中鑒定到35個(gè)HD-Zip I類轉(zhuǎn)錄因子[11-12], 但是有關(guān)該類轉(zhuǎn)錄因子參與抗逆生理方面的研究報(bào)道甚少。早期研究發(fā)現(xiàn)1個(gè)大豆HD-Zip I類轉(zhuǎn)錄因子GmHZ-1正調(diào)控大豆花葉病毒(SMV)的感染[13]。我們?cè)谇捌诠ぷ髦锌寺〉玫?個(gè)大豆HD-Zip I類鹽脅迫應(yīng)答基因, 超量表達(dá)顯著增強(qiáng)了豆科模式植物百脈根的抗鹽能力[14-15]。目前, HD-Zip I類轉(zhuǎn)錄因子在擬南芥中的抗逆分子機(jī)理研究日趨成熟, 而在大豆中的研究相對(duì)滯后。本研究克隆得到大豆的另一個(gè)HD-Zip I類基因, 從基因編碼蛋白序列結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)進(jìn)化樹、基因的時(shí)空表達(dá)特性等方面進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。通過外源脫落酸、NaCl、PEG、冷等模擬非生物脅迫, 探究基因表達(dá)對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)特征。構(gòu)建了Ubiquitin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)基因的植物表達(dá)載體, 獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)化的模式豆科植物百脈根, 鑒定了該基因的抗鹽功能, 揭示了基因在轉(zhuǎn)基因百脈根抗鹽脅迫中的調(diào)控機(jī)制, 為進(jìn)一步利用基因創(chuàng)制抗鹽大豆新種質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料及處理

栽培大豆Williams 82種子經(jīng)消毒后, 于1/2 Hoagland培養(yǎng)基中萌發(fā)生長(zhǎng), 光照培養(yǎng)箱參數(shù)設(shè)置為溫度25℃, 相對(duì)濕度60%, 18 h光照/6 h黑暗。待幼苗生長(zhǎng)至V1期(第一復(fù)葉期)時(shí)進(jìn)行非生物脅迫處理。其中, 3組幼苗分別使用含100 μmol L–1ABA、含100 mmol L–1NaCl、含30% PEG-6000的1/2 Hoagland培養(yǎng)液處理。另外1組幼苗移至1/2 Hoagland培養(yǎng)液中, 于4℃培養(yǎng)箱冷處理。每組試驗(yàn)處理18棵苗, 分別于脅迫前0 h、脅迫后1、6、12、24和48 h這6個(gè)時(shí)間點(diǎn)取樣, 每次隨機(jī)挑選3棵幼苗, 剪取根部組織, 液氮速凍后于–80℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。試?yàn)重復(fù)3次。

對(duì)另外一批生長(zhǎng)至V1期的大豆幼苗, 用含100 mmol L–1NaCl的1/2 Hoagland培養(yǎng)液處理, 方法同上。設(shè)置3個(gè)重復(fù), 每個(gè)重復(fù)18棵苗, 分別于鹽脅迫前0 h、脅迫后12、24、48、72和96 h取樣, 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)挑選3棵幼苗, 分別收集幼苗根、莖、葉組織, 液氮速凍后于–80℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 GmHDL57基因的克隆與重組質(zhì)粒的構(gòu)建

參照TaKaRa公司RNA抽提試劑盒操作說明, 提取各脅迫樣品的總RNA。使用天根公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA第1鏈。根據(jù)NCBI網(wǎng)站公布的基因序列(GenBank: XM_006574409.2), 設(shè)計(jì)引物F-GmHDL57 (5￠-ATGGCGAGTGGCAAGC TTTATGC-3￠)和R-GmHDL57 (5￠-TCAATAGGGCCA GAAACAG-3￠), 以cDNA第1鏈為模板擴(kuò)增目的片段, 大小為1038 bp。目的片段回收純化后連接T載體測(cè)序驗(yàn)證。將測(cè)序正確的目的基因插入植物表達(dá)載體p1301U中, 上下游引物分別為F-GmHDL57- OX (5￠-CGggatccATGGCGAGTGGCAAG-3￠)和R- GmHDL57-OX (5￠-GGggtaccTCAATAGGGCCAGAA AC-3￠), 小寫字母區(qū)域?yàn)槊盖形稽c(diǎn)序列H I和I, 構(gòu)建過表達(dá)載體p1301U- GmHDL57。

1.3 GmHDL57基因的生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN軟件確定基因的開放讀碼框以及編碼蛋白的分子量大小; 利用SignaIP-4.1軟件預(yù)測(cè)蛋白的信號(hào)肽及切割位點(diǎn); 利用PSORT 軟件分析蛋白的亞細(xì)胞定位情況; 利用在線軟件ProtScale 預(yù)測(cè)蛋白的親水、疏水氨基酸組成情況; 分別運(yùn)用DictyOGlyc 1.1 Server、NetPhos 2.0 Server在線軟件預(yù)測(cè)基因翻譯后磷酸化修飾情況; 使用DNAMAN軟件進(jìn)行同源蛋白多序列比對(duì)分析以及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建; 利用SWISS MODEL Workspace 軟件在線預(yù)測(cè)GmHDL57蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型。

1.4 GmHDL57基因的時(shí)空及脅迫表達(dá)檢測(cè)

從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中[12]獲取基因在幼葉、花、1 cm豆莢、開花后10、14 d莢殼、開花后10、14、21、25、28、35、42 d種子、根和根瘤共14個(gè)組織中的表達(dá)數(shù)據(jù), 利用Excel表繪圖分析基因的時(shí)空表達(dá)特征。

根據(jù)基因序列, 利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物, F-GmHDL57-rt (5￠-GAAAACCTTTTGATGACC-3￠)和R-GmHDL57- rt (5￠-TCAATAGGGCCAGAAACAG-3￠), 以各個(gè)脅迫樣品的cDNA 第1鏈為模板, 按照TaKaRa公司PrimeScript RT reagent Kit操作說明進(jìn)行。以大豆肌動(dòng)蛋白11 ()為內(nèi)參基因, 實(shí)時(shí)熒光定量PCR上游引物為F-ACT11 (5￠-ATTTTGACTGAGCGTG GTTATTCC-3￠); 下游引物為R-ACT11 (5￠-GCTGGT CCTGGCTGTCTCC-3￠)。根據(jù)相對(duì)定量法(DDCt)公式計(jì)算結(jié)果, 利用Microsoft Excel繪圖分析基因在非生物脅迫下的表達(dá)特征。

1.5 百脈根穩(wěn)定轉(zhuǎn)化及鹽脅迫處理

采用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的子葉節(jié)轉(zhuǎn)化法將基因?qū)氚倜}根中, 詳細(xì)方法參見文獻(xiàn)[16]。以轉(zhuǎn)基因和野生型百脈根植株葉片DNA為模板, PCR擴(kuò)增基因, 引物為F-Gus (5￠-ATGT TACGTCCTGTAGAAAC-3￠)和R-Gus (5￠-TCATT GTTTGCCTCCCTG-3￠), PCR產(chǎn)物大小為1812 bp。提取部分PCR陽性植株葉片RNA, 進(jìn)行基因表達(dá)分析(引物同1.4 F-GmHDL57-rt和R-GmHDL57-rt), PCR產(chǎn)物大小為138 bp。以百脈根為內(nèi)參基因, 引物為F-GPDH (5￠-GCCTCATT CAACATCATTCC-3￠)和R-GPDH (5￠-CTATGAACA ACAAAAGGTTGC-3￠), PCR產(chǎn)物大小為112 bp。

收集RT-PCR檢測(cè)為陽性的植株種子即T0代轉(zhuǎn)基因百脈根種子, 將其與野生型種子表面滅菌, 移入MS培養(yǎng)基上待種子萌發(fā)。1周后將幼苗移入含有基質(zhì)的盆缽中, 3周后選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗, 將轉(zhuǎn)基因和野生型植株各分成3組, 每組24 株, 分別用終濃度為0、100和200 mmol L–1NaCl 的1/8 Hoagland 營養(yǎng)液處理, 設(shè)置3個(gè)重復(fù), 14 d后照相并測(cè)定相關(guān)生理生化指標(biāo)。

1.6 轉(zhuǎn)基因百脈根生理指標(biāo)的測(cè)定

丙二醛含量測(cè)定、葉片質(zhì)膜透性(相對(duì)電導(dǎo)率)測(cè)定、葉綠素含量測(cè)定、根系活力檢測(cè)以及陽離子Na+、K+和Ca2+含量測(cè)定的具體操作方法見參考文獻(xiàn)[14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 GmHDL57基因的序列分析

根據(jù)基因的已知序列設(shè)計(jì)引物, 以Williams 82大豆cDNA為模板, 克隆得到與NCBI數(shù)據(jù)庫中公布的基因序列完全一致的基因。該基因包含1個(gè)1038 bp的開放讀碼框, 編碼345個(gè)氨基酸。GmHDL57蛋白的理論分子量為39.08 kD。利用SignaIP-4.1軟件預(yù)測(cè)GmHDL57蛋白不存在信號(hào)肽及切割位點(diǎn), 不屬于分泌蛋白。經(jīng)在線軟件ProtScale 預(yù)測(cè)GmHDL57蛋白除了C端303~314位和中間215~241位氨基酸為疏水區(qū), 其余大部分區(qū)域均為親水區(qū)。運(yùn)用DictyOGlyc 1.1 Server和NetPhos 2.0 Server 在線軟件預(yù)測(cè)基因翻譯后磷酸化修飾情況表明, GmHDL57蛋白有可能在24個(gè)位點(diǎn)發(fā)生磷酸化修飾, 并且磷酸化位點(diǎn)集中分布在疏水區(qū)域。利用PSORT軟件預(yù)測(cè)GmHDL57蛋白的亞細(xì)胞定位情況, 發(fā)現(xiàn)其定位于細(xì)胞核。采用SWISS MODEL Workspace 軟件在線預(yù)測(cè)蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型顯示, GmHDL57蛋白主要由3個(gè)α螺旋、不規(guī)則卷曲與延伸鏈組成(圖1)。3個(gè)α螺旋是由GmHDL57蛋白的HD區(qū)域折疊而成的三維空間結(jié)構(gòu), 這里是靶基因5￠上游區(qū)順式作用元件的專一識(shí)別位點(diǎn), 起著與DNA結(jié)合的功能, 因此α螺旋是該蛋白行使生物學(xué)功能的基礎(chǔ)。LZ區(qū)的亮氨酸殘基側(cè)鏈伸出, 與α螺旋緊密相連, 二者共同作用形成一個(gè)穩(wěn)定的拉鏈狀的疏水作用區(qū)域。綜上, GmHDL57是一個(gè)典型的HD-Zip類轉(zhuǎn)錄因子。

圖1 GmHDL57蛋白質(zhì)的三級(jí)空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

2.2 GmHDL57的同源蛋白比對(duì)及進(jìn)化樹分析

將大豆GmHDL57蛋白與另外10種豆科植物同源蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行序列比對(duì)發(fā)現(xiàn), GmHDL57蛋白與野生大豆、木豆、赤豆等物種的同源蛋白氨基酸序列相似性較高, 并且該類蛋白在不同物種中都有2個(gè)高度保守的區(qū)域, 分別為同源異型框結(jié)構(gòu)域HD和亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域LZ (圖2)。

: 栽培大豆;: 野生大豆;: 木豆;: 赤豆;: 菜豆;: 綠豆;: 鷹嘴豆;: 狹葉羽扇豆;: 蒺藜苜蓿;: 蔓花生;: 落花生。黑線部分為同源異型框結(jié)構(gòu)域序列, 虛線部分為同源異型框結(jié)合類亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域序列。

The sequence marked with solid line demonstrates the homeobox domain, and the sequence marked with dotted line demonstrates the homeobox associated leucine zipper domain.

選取與基因編碼的氨基酸序列相似性較高的幾種植物的HD-Zip蛋白進(jìn)行進(jìn)化樹分析。結(jié)果表明, 大豆GmHDL57蛋白與野生大豆親緣關(guān)系最近, 其次是木豆、赤豆、菜豆和綠豆, 與鷹嘴豆、狹葉羽扇豆和蒺藜苜蓿的親緣關(guān)系較遠(yuǎn), 與蔓花生和落花生的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(圖3)。

圖3 大豆GmHDL57與同系物的系統(tǒng)進(jìn)化分析

: 栽培大豆;: 野生大豆;: 木豆;: 赤豆;: 菜豆;: 綠豆;: 鷹嘴豆;: 狹葉羽扇豆;: 蒺藜苜蓿;: 蔓花生;: 落花生。標(biāo)尺代表遺傳相似性, 表明不同物種間同系物進(jìn)化關(guān)系的遠(yuǎn)近。

The scale represents genetic similarity, indicating the proximity relationships among species.

2.3 GmHDL57基因的時(shí)空表達(dá)分析

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)[12]獲取基因的時(shí)空表達(dá)情況, 從圖4可以看出, 在幼葉、花、1 cm豆莢、根、根瘤以及開花后莢殼和種子中都能檢測(cè)到基因的表達(dá)。在生殖器官花、豆莢和10 d種子中該基因表達(dá)量較高, 在營養(yǎng)器官幼葉中基因表達(dá)量較低。其中,基因在開花后10 d莢殼中的表達(dá)量高于14 d莢殼, 在開花后10 d種子中的表達(dá)量高于14 d、35 d和42 d種子, 在開花后25 d和28 d種子中表達(dá)量較低, 而在開花后21 d種子中未檢測(cè)到該基因的表達(dá)。

2.4 GmHDL57基因在不同脅迫下的表達(dá)特征分析

NaCl和PEG脅迫處理1 h時(shí),基因的表達(dá)量迅速上升, 且隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)量持續(xù)升高, 至48 h 時(shí)達(dá)到最大值, 分別為脅迫前的8.5倍和7.2倍。而在ABA脅迫下,基因的表達(dá)量在1 h和6 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)增加緩慢, 至12 h時(shí)明顯上升, 后又緩緩升高, 至48 h達(dá)到脅迫前的3.9倍。4℃冷脅迫處理時(shí),基因的表達(dá)量持續(xù)下降, 至12 h達(dá)最小值, 為脅迫前的0.5倍, 之后趨于穩(wěn)定, 表現(xiàn)出對(duì)冷脅迫的適應(yīng)性(圖5)。

圖4 大豆GmHDL57基因在不同器官中的表達(dá)分析

橫坐標(biāo)依次為: 幼葉、花、1 cm豆莢、開花后10 d、14 d莢殼、開花后10 d、14 d、21 d、25d、28 d、35 d、42 d種子、根和根瘤; DAF代表開花后的天數(shù)。

Abscissa represented young leaf, flower, 1 cm pod, pod shell at 10 d, pod shell at 14 d, seed at 10 d, seed at 14 d, seed at 21 d, seed at 25 d, seed at 28 d, seed at 3 d, seed at 42 d, root and nodule. DAF means days after flower.

圖5 大豆GmHDL57基因在非生物脅迫下的表達(dá)分析

由圖5可知, 大豆基因在響應(yīng)高鹽脅迫時(shí)基因表達(dá)量變化最為明顯, 因此我們進(jìn)一步對(duì)鹽脅迫下幼苗期大豆根、莖、葉不同組織中基因的表達(dá)特征進(jìn)行了分析。鑒于鹽脅迫下該基因的表達(dá)量在48 h內(nèi)一直持續(xù)上升, 并沒有出現(xiàn)拐點(diǎn), 因此, 我們延長(zhǎng)脅迫處理取樣時(shí)間至96 h。由圖6可知, 鹽脅迫前后基因在大豆根中的表達(dá)量明顯高于莖和葉, 在鹽脅迫處理48 h時(shí),基因在根、莖、葉中的表達(dá)水平均達(dá)到峰值, 在72 h和96 h時(shí)表達(dá)量緩慢下降, 但仍高于鹽脅迫處理前的表達(dá)水平。由此推斷, 鹽脅迫條件下基因具有組織表達(dá)特異性, 可能主要在根中參與鹽脅迫應(yīng)答反應(yīng)。

圖6 鹽脅迫下GmHDL57基因在大豆不同組織中的表達(dá)特征分析

2.5 轉(zhuǎn)基因百脈根的獲得及抗鹽表型分析

通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的百脈根子葉節(jié)轉(zhuǎn)化法, 將構(gòu)建成功的植物表達(dá)載體p1301U-GmHDL57導(dǎo)入百脈根中, 共獲得46株卡那霉素抗性植株。經(jīng)PCR鑒定, 獲得28株P(guān)CR陽性植株(圖7-A)。從中隨機(jī)挑選5株進(jìn)行RT-PCR檢測(cè), 均能檢測(cè)到基因的表達(dá)(圖7-B)。收集RT-PCR檢測(cè)為陽性的植株種子, 不同株系的轉(zhuǎn)基因種子與野生型種子經(jīng)消毒在MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)1周, 盆缽中生長(zhǎng)3周后, 用0、100、200 mmol L–1NaCl進(jìn)行鹽脅迫處理。14 d后, 100 mmol L–1NaCl處理的野生型百脈根葉片開始發(fā)黃枯萎, 而轉(zhuǎn)基因的2個(gè)株系生長(zhǎng)狀態(tài)優(yōu)于對(duì)照; 隨著鹽濃度的升高, 200 mmol L–1NaCl處理的野生型百脈根生長(zhǎng)受到明顯抑制, 大部分植株莖葉枯黃, 生長(zhǎng)矮小, 甚至死亡, 而轉(zhuǎn)基因株系生長(zhǎng)狀態(tài)較好, 只有小部分植株葉片開始發(fā)黃干枯(圖7-C)。

進(jìn)一步對(duì)轉(zhuǎn)基因和野生型百脈根的株高和根長(zhǎng)測(cè)量統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn), 在不含NaCl的基質(zhì)中, 轉(zhuǎn)基因株系和野生型百脈根株高和根長(zhǎng)并無明顯差異, 隨著NaCl濃度的增加, 野生型株高和根長(zhǎng)受到明顯抑制, 而轉(zhuǎn)基因株系株高和根長(zhǎng)受抑制程度較輕(圖8)。以上結(jié)果表明,基因的過表達(dá)能夠減緩鹽脅迫對(duì)植株的毒害作用, 植株的耐鹽能力增強(qiáng)。

2.6 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因百脈根相關(guān)生理指標(biāo)檢測(cè)

從圖9可以看出, 在正常條件下, 轉(zhuǎn)基因和野生株系間丙二醛(MDA)含量、葉綠素含量、相對(duì)質(zhì)膜透性以及根系活力的差異不顯著。隨著鹽濃度的增加, 植株葉片MDA含量和相對(duì)質(zhì)膜透性呈升高趨勢(shì), 但轉(zhuǎn)基因株系升高幅度顯著低于野生型。表明鹽脅迫條件下, 轉(zhuǎn)基因百脈根細(xì)胞膜的氧化損傷程度較輕, 能夠維持較好的細(xì)胞膜生理活性。與之相反, 植株葉片葉綠素含量和根系活力隨著鹽濃度的增加而下降, 但轉(zhuǎn)基因株系下降的幅度顯著低于野生型, 表明轉(zhuǎn)基因株系在鹽脅迫條件下具備較強(qiáng)的光合能力以及較高的根系活力。

圖7 轉(zhuǎn)基因百脈根陽性植株檢測(cè)及抗鹽表型鑒定

A: PCR檢測(cè)植株中基因的表達(dá); B: RT-PCR檢測(cè)植株中基因的表達(dá); C: 不同鹽濃度處理14 d后百脈根的生長(zhǎng)狀態(tài)。Lj 9-5, Lj 1-1: 轉(zhuǎn)基因株系。M: DL2000 DNA marker。

A: detection ofgene expression in plants by PCR; B: detection ofgene expression in plants by RT-PCR; C: growth state ofin different salt concentration treatment for 14 d. Lj 9-5, Lj 1-1: transgenic lines. M: DL2000 DNA marker.

圖8 鹽脅迫對(duì)轉(zhuǎn)基因百脈根株高(A)和根長(zhǎng)(B)的影響

Lj 9-5, Lj 1-1: 轉(zhuǎn)基因株系。*代表差異顯著(<0.05), **代表差異極顯著(<0.01)。

Lj 9-5, Lj 1-1: transgenic lines. * means significant difference (<0.05) and ** means extremely significant difference (<0.01).

2.7 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因百脈根中陽離子的含量分析

在無鹽脅迫下, 轉(zhuǎn)基因和野生型百脈根葉片和根系中Na+、K+和Ca2+含量無明顯差異。隨著鹽濃度的升高, Na+和Ca2+含量均呈現(xiàn)升高趨勢(shì), 而K+含量呈下降趨勢(shì)。與野生型對(duì)照相比, 轉(zhuǎn)基因百脈根中Na+含量的增加幅度較小, Ca2+的增加幅度較大, 而K+的下降幅度較小(圖10)。以上結(jié)果表明, 在高鹽脅迫下,基因的過表達(dá)能夠調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)基因百脈根體內(nèi)的陽離子含量, 從而增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因百脈根對(duì)鹽的耐受性。

3 討論

近年來, 關(guān)于植物HD-Zip類轉(zhuǎn)錄因子參與非生物脅迫應(yīng)答反應(yīng)已成為研究熱點(diǎn)。目前的研究主要集中在擬南芥、水稻[17-18]、玉米[19]、楊樹[20]、黃瓜[21-22]等植物, 對(duì)于大豆中該類蛋白的功能研究報(bào)道較少, 尚處于起步階段。本研究克隆得到1個(gè)HD-Zip I類基因, 其編碼蛋白具有HD-Zip類家族蛋白典型的保守結(jié)構(gòu)域。基因在大豆植株的各個(gè)不同生長(zhǎng)階段及不同器官中均有表達(dá), 生殖生長(zhǎng)較營養(yǎng)生長(zhǎng)階段表達(dá)量高。擬南芥和在營養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)階段均有表達(dá),主要在根和莖的皮層中表達(dá),和主要在根、葉和花中表達(dá), 而在根、莖、葉、花、子葉等各部位均有表達(dá)[23]。HD-Zip類家族基因表達(dá)規(guī)律的復(fù)雜性決定了該類轉(zhuǎn)錄因子功能的多樣性。

圖9 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因百脈根的生理指標(biāo)

A: 丙二醛含量; B: 相對(duì)質(zhì)膜透性; C: 葉綠素含量; D: 根系活力。Lj 9-5, Lj 1-1: 轉(zhuǎn)基因株系。*代表差異顯著(<0.05), **代表差異極顯著(<0.01)。

A: MDA content; B: relative membrane permeability; C: chlorophyll content; D: root activity. Lj 9-5, Lj 1-1: transgenic lines. * means significant difference (<0.05), ** means extremely significant difference (<0.01).

研究表明, 用ABA、NaCl或者低溫處理擬南芥幼苗, HD-Zip類基因和的表達(dá)量上調(diào)至對(duì)照的2~25倍, 而基因的表達(dá)量減少為對(duì)照的一半。和受ABA或者NaCl影響, 其表達(dá)量下調(diào)為對(duì)照的0.5倍。和的表達(dá)不受外源ABA的影響, 經(jīng)鹽脅迫和低溫處理后其表達(dá)量減少[24]。本研究中大豆基因在外源ABA、NaCl和PEG脅迫處理下, 表達(dá)量呈上升趨勢(shì), 48 h時(shí)達(dá)到對(duì)照的3.9~8.5倍。而在4℃冷脅迫處理時(shí),基因的表達(dá)量整體呈下降趨勢(shì), 12 h時(shí)降至最低, 為對(duì)照的0.5倍。說明大豆基因的表達(dá)在鹽和干旱脅迫下與ABA脅迫有著相似的應(yīng)答模式, 而在冷脅迫下與ABA脅迫有著相反的應(yīng)答模式。進(jìn)一步對(duì)鹽脅迫下大豆根、莖、葉不同組織中基因的表達(dá)特征分析發(fā)現(xiàn), 鹽脅迫條件下基因在根中表達(dá)量較高, 具有組織表達(dá)特異性, 可能主要在根中發(fā)揮功能。

本研究構(gòu)建了基因的植物表達(dá)載體, 通過穩(wěn)定轉(zhuǎn)化獲得了轉(zhuǎn)基因百脈根植株, 并希望通過鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因及野生型對(duì)照株系各項(xiàng)生理指標(biāo)的測(cè)定揭示基因的抗鹽功能及調(diào)控機(jī)制。通常高鹽條件下, 植株的丙二醛含量和相對(duì)質(zhì)膜透性會(huì)迅速增加, 導(dǎo)致質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的破壞, 影響功能的發(fā)揮。本研究中轉(zhuǎn)基因百脈根的丙二醛含量和相對(duì)質(zhì)膜透性明顯低于野生型對(duì)照, 說明鹽脅迫下, 轉(zhuǎn)基因百脈根的膜脂過氧化程度較低, 細(xì)胞膜受損程度較小。此外, 在高鹽脅迫下, 轉(zhuǎn)基因株系的葉綠素含量和根系活力顯著高于野生型對(duì)照, 說明轉(zhuǎn)基因百脈根在鹽脅迫下具備較強(qiáng)的光合能力以及較高的根系活力。通過對(duì)以上生理指標(biāo)的監(jiān)測(cè)發(fā)現(xiàn),基因的過表達(dá)減緩了鹽脅迫對(duì)百脈根生長(zhǎng)的抑制, 從而使轉(zhuǎn)基因百脈根保持較好的生長(zhǎng)狀態(tài)。高鹽脅迫影響植株對(duì)Na+、K+和Ca2+等陽離子的吸收。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Na+含量過高會(huì)對(duì)植物造成不利影響[25]。在植物細(xì)胞質(zhì)內(nèi)K+以相對(duì)較高的濃度存在, 參與調(diào)節(jié)離子平衡以及穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)環(huán)境[26-27]。Ca2+也是植物生長(zhǎng)所必需的, 能夠促進(jìn)細(xì)胞對(duì)K+的吸收、調(diào)節(jié)水分平衡、充當(dāng)?shù)诙攀沟萚28]。因此, 維持細(xì)胞質(zhì)內(nèi)較低的Na+水平以及較高的K+、Ca2+水平, 對(duì)植物抵抗鹽脅迫具有重要意義[29]。本試驗(yàn)中, 在同一高鹽濃度條件下, 轉(zhuǎn)基因植株中Na+含量明顯低于對(duì)照, 而K+和Ca2+含量顯著高于對(duì)照, 說明在高鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因植株維持較低的Na+水平, 較高的K+和Ca2+水平, 減輕了過量Na+對(duì)植株的毒害作用, 從而維持植株的正常生理功能。從鹽脅迫誘導(dǎo)、組織表達(dá)特征和陽離子含量分析推斷, 鹽脅迫條件下基因主要在根中發(fā)揮功能, 控制Na+向地上部分運(yùn)輸和積累, 調(diào)節(jié)植物體內(nèi)離子平衡, 進(jìn)而降低鹽脅迫對(duì)植株帶來的傷害。

圖10 鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因百脈根的陽離子含量

A: 葉片中Na+含量; B: 根中Na+含量; C: 葉片中K+含量; D: 根中K+含量; E: 葉片中Ca2+含量; F: 根中Ca2+含量。Lj 9-5, Lj 1-1: 轉(zhuǎn)基因株系。*代表差異顯著(<0.05), **代表差異極顯著(<0.01)。

A: Na+content in leaves; B: Na+content in roots; C: K+content in leaves; D: K+content in roots; E: Ca2+content in leaves; F: Ca2+content in roots. Lj 9-5, Lj 1-1: transgenic lines. * means significant difference (<0.05) and ** means extremely significant difference (<0.01).

我們推斷基因的超量表達(dá)能夠提高轉(zhuǎn)基因百脈根的耐鹽性。目前, 大豆遺傳轉(zhuǎn)化效率低仍然極大制約了大豆抗逆分子改良的發(fā)展[30-34], 因此優(yōu)化大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化體系, 獲得轉(zhuǎn)基因大豆植株, 進(jìn)一步探究該基因在大豆體內(nèi)的功能及其調(diào)控機(jī)制, 是我們下一步工作的重點(diǎn)。

4 結(jié)論

克隆得到一個(gè)大豆HD-Zip I類基因, 該基因在大豆植株的各個(gè)不同時(shí)期及不同器官中均有表達(dá)?；虻谋磉_(dá)在鹽和干旱脅迫下與ABA脅迫應(yīng)答模式相似, 而在冷脅迫下與ABA脅迫應(yīng)答模式相反。鹽脅迫條件下基因在根中表達(dá)量較高, 具有組織表達(dá)特異性。在高鹽脅迫下, 轉(zhuǎn)基因百脈根的株高、根長(zhǎng)、葉綠素含量、根系活力以及陽離子K+、Ca2+含量均顯著高于野生型, 而丙二醛含量、相對(duì)質(zhì)膜透性以及Na+的含量明顯低于野生型。說明基因可能以不同機(jī)制參與了大豆對(duì)非生物脅迫的應(yīng)答過程, 過量表達(dá)基因能夠顯著提高百脈根的抗鹽能力。

[1] Ariel F D, Manavella P A, Dezar C A, Chan R L. The true story of the HD-Zip family., 2007, 12: 419–426

[2] Mukherjee K, Brocchieri L, Burglin T R. A comprehensive cla-ssification and evolutionary analysis of plant homeobox genes., 2009, 26: 2775–2794

[3] Harris J C, Hrmova M, Lopato S, Langridge P. Modulation of plant growth by HD-Zip class I and II transcription factors in response to environmental stimuli., 2011, 190: 823–837

[4] Henriksson E, Olsson A S B, Johannesson H, Johansson H, Hanson J, Engstr?m P, S?derman E. Homeodomain leucine zipper class I genes inexpression patterns and phylogenetic relationships., 2005, 139: 509–518

[5] Olsson A S B, Engstrom P, SodermanE. The homeobox genesandencode potential regulators of growth in response to water deficit in., 2004, 55: 663–677

[6] Himmelbach A, Hoffmann T, Leube M, H?hener B, Grill E. Homeodomain protein ATHB6 is a target of the protein phosphatase ABI1 and regulates hormone responses in., 2002, 21: 3029–3038

[7] Ré D A, Dezar C A, Chan R L, Baldwin I T, Bonaventure G.NaHD20 plays a role in leaf ABA accumulation during water stress, benzylacetone emission from flowers, and the timing of bolting and flower transitions., 2011, 62: 155–166

[8] Ariel F, Diet A, Verdenaud M, Gruber V, Frugier F, Chan R, Crespi M. Environmental regulation of lateral root emergence inrequires the HD-Zip I transcription factor HB1., 2010, 22: 2171–2183

[9] 李明娜, 龍瑞才, 楊青川, 沈益新, 康俊梅, 張鐵軍. 紫花苜蓿鹽誘導(dǎo)HD-Zip類轉(zhuǎn)錄因子的克隆及功能分析. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 47: 622–632Li M N, Long R C, Yang Q C, Shen Y X, Kang J M, Zhang T J. Cloning and function analysis of a salt-stress-induced HD-Zip transcription factorfrom alfalfa., 2014, 47: 622–632 (in Chinese with English abstract)

[10] Cao L, Yu Y, Duanmu H Z,Chen C, Duan X B, Zhu P H, Chen R R, Li Q, Zhu Y M, Ding X D. A novelhomeodomain-leucine zipper (HD-Zip) I gene,, positively regulates bicarbonate tolerance and responds to osmotic stress in Arabidopsis., 2016, 16: 184

[11] Chen X, Chen Z, Zhao H, Zhao Y, Cheng B, Xiang Y. Genome-wide analysis of soybean HD-zip gene family and expression profiling under salinity and drought treatments., 2014, 9: e87156

[12] Belamkar V, Weeks N T, Bharti A K, Farmer A D, Graham M A, Cannon S B. Comprehensive characterization and RNA-Seq profiling of the HD-Zip transcription factor family in soybean () during dehydration and salt stress., 2014, 15: 950

[13] Wang YJ, Li Y D, Luo G Z, Tian A G, Wang H W, Zhang J S, Chen S Y.Cloning and characterization of an HD-Zip I genefrom soybean., 2005, 221: 831–843

[14] 柯丹霞, 李祥永, 王磊, 程琳, 劉永輝, 李小艷, 王慧芳. 大豆的克隆及其轉(zhuǎn)基因百脈根的抗鹽分析. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2017, 50: 1559–1570 Ke D X, Li X Y, Wang L, Cheng L, Liu Y H, Li X Y, Wang H F. Isolation offromand analysis of saline tolerance for transgenic., 2017, 50: 1559–1570 (in Chinese with English abstract)

[15] 柯丹霞, 李祥永. 結(jié)瘤信號(hào)途徑中相關(guān)調(diào)控蛋白的研究進(jìn)展. 信陽師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2015, 28: 621–626Ke D X, Li X Y. Research progress of key regulatory proteins in nodulation pathway.(Nat Sci Edn), 2015, 28: 621–626 (in Chinese with English abstract)

[16] Marquez A J.Handbook. The Netherlands: Springer, 2005. pp 279–284

[17] Agalou A, Purwantomo S, Overnas E, Johannesson H,Zhu X Y,Estiati A,de Kam R J,Engstr?m P,Slamet-Loedin I H,Zhu Z,Wang M,Xiong L Z,Meijer A H, Ouwerkerk P B.A genome-wide survey of HD-Zip genes in rice and analysis of drought-responsive family members., 2008, 66: 87–103

[18] Zhang S X, Haider I, Kohlen W, Jiang L,Bouwmeester H,Meijer A H,Schluepmann H,Liu C M,Ouwerkerk P B.Function of the HD-Zip I genein ABA-mediated drought and salt tolerances in rice., 2012, 80: 571–585

[19] Zhao Y, Zhou Y Q, Jiang H Y, Li X Y,Gan D F,Peng X J,Zhu S W,Cheng B J. Systematic analysis of sequences and expression patterns of drought-responsive members of the HD-Zip gene family in maize., 2011, 6: e28488

[20] Hu R b, Chi X Y, Chai G H, Kong Y Z,He G,Wang X Y,Shi D C,Zhang D Y,Zhou G K.Genome-wide identification, evolutionary expansion, and expression profile of homeodomain- leucine zipper gene family in poplar ()., 2012, 7: e31149

[21] Liu W, Fu R, Li Q, Li J,Wang L N,Ren Z H.Genome-wide identification and expression profile of homeodomain-leucine zipper class I gene family in., 2013, 531: 279–287

[22] Fu R, Liu W, Li Q, Li J, Wang L N, Ren Z H. Comprehensive analysis of the homeodomain-leucine zipper IV transcription factor family in., 2013, 56: 395–405

[23] Elhiti M, Stasolla C. Structure and function of homeodomain-leucine zipper (HD-Zip) proteins., 2009, 4: 86–88

[24] Sahu B B, Shaw B P. Isolation, identification and expression analysis of salt-induced genes in, a natural halophyte, using PCR-based suppression subtractive hybridization., 2009, 9: 69

[25] 王臻昱, 才華, 柏錫, 紀(jì)巍, 李勇, 魏正巍, 朱延明. 野生大豆基因的克隆及其轉(zhuǎn)基因苜蓿的耐鹽堿性分析. 作物學(xué)報(bào), 2013, 38: 971–979 Wang Z Y, Cai H, Bai X, Ji W, Li Y, Wei Z W, Zhu Y M. Isolation offromand analysis of saline- alkaline tolerance for transgenic., 2013, 38: 971–979 (in Chinese with English abstract)

[26] 魏正巍, 朱延明, 化燁, 才華, 紀(jì)巍, 柏錫, 王臻昱, 文益東. 轉(zhuǎn)基因苜蓿植株的獲得及其耐堿性分析. 作物學(xué)報(bào), 2013, 39: 68–75 Wei Z W, Zhu Y M, Hua Y, Cai H, Ji W, Bai X, Wang Z Y, Wen Y D. Transgenic alfalfa withand its alkaline tolerance analysis., 2013, 39: 68–75 (in Chinese with English abstract)

[27] 趙陽, 朱延明, 柏錫, 紀(jì)巍, 吳婧, 唐立酈, 才華. 轉(zhuǎn)雙價(jià)基因苜蓿耐堿性及氨基酸含量分析. 作物學(xué)報(bào), 2014, 40: 431–438 Zhao Y, Zhu Y M, Bai X, Ji W, Wu J, Tang L L, Cai H. Over-expressingenhances alkaline tolerance and methionine content in transgenic., 2014, 40: 431–438 (in Chinese with English abstract)

[28] Yang T, Poovaiah B W. Hydrogen peroxide homeostasis: activation of plant catalase by calcium/calmodulin., 2002, 99: 4097–4102

[29] 朱娉慧, 陳冉冉, 于洋, 宋雪薇, 李慧卿, 杜建英, 李強(qiáng), 丁曉東, 朱延明. 堿脅迫相關(guān)基因的克隆及其轉(zhuǎn)基因苜蓿的耐堿性分析. 作物學(xué)報(bào), 2017, 43: 1319–1327Zhu P H, Chen R R, Yu Y, Song X W, Li H Q, Du J Y, Li Q, Ding X D, Zhu Y M. Cloning of generelated to alkaline stress and alkaline tolerance of transgenic plants., 2017, 43: 1319–1327 (in Chinese with English abstract)

[30] Olhoft P M, Flagel L E, Donovan C M. Efficient soybean transformation using hygromycin B selection in the cotyledonary-node method., 2003, 216: 723–735

[31] 王昌陵, 趙軍, 李英慧, 范云六, 張麗娟, 劉章雄, 關(guān)榮霞, 呂淑霞, 常汝鎮(zhèn), 邱麗娟. 轉(zhuǎn)錄因子ABP9 轉(zhuǎn)化大豆(L.)及遺傳轉(zhuǎn)化條件優(yōu)化. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 41: 1908–1916 Wang C L, Zhao J, Li Y H, Fan Y L, Zhang L J, Liu Z X, Guan R X, Lyu S X, Chang R Z, Qiu L J. Transforming transcription factor ABP9 into Soybean and optimization of the transformation system., 2008, 41: 1908–1916 (in Chinese with English abstract)

[32] Devi M K, Sakthivela G, Giridhar P. Protocol for augmented shoot organogenesis in selected variety of soybean., 2012, 50: 729–734

[33] 楊權(quán), 王月月, 劉炎光, 蔣春志, 張孟臣, 張洪霞, 張潔, 王冬梅. 大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化及抗逆基因的轉(zhuǎn)化研究. 大豆科學(xué), 2015, 34: 205–211 Yang Q, Wang Y Y, Liu Y G, Jiang C Z, Zhang M C, Zhang H X, Zhang J, Wang D M. Study on optimization of soybean cotyledonary node genetic transformation system and the transformation of resistance gene., 2015, 34: 205–211 (in Chinese with English abstract)

[34] 柯丹霞, 熊文真, 彭昆鵬, 李祥永. 抗鹽基因大豆子葉節(jié)遺傳轉(zhuǎn)化研究. 信陽師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2017, 30(1): 46–51 Ke D X, Xiong W Z, Peng K P, Li X Y. Study on genetic transformation of salt resistant genein soybean.(Nat Sci Edn), 2017, 30(1): 46–51 (in Chinese with English abstract)

Cloning and Salt Resistance Function Identification ofGenefrom

KE Dan-Xia*, PENG Kun-Peng, ZHANG Meng-Ke, JIA Yan, and WANG Jing-Jing

College of Life Sciences / Institute for Conservation and Utilization of Agro-bioresources in Dabie Mountains, Xinyang Normal University, Xinyang 464000, Henan, China

TheHD-Zip I class transcription factor plays an important role in plant resistance to abiotic stresses. An HD-Zip I class gene(homeodomain-leucine zipper protein 57) was cloned from soybean in this study. Sequence analysis showed thatgene contained a 1038 bp ORF, encoding 345 amino acids, and featured with HD-Zip family proteins’ typical conserved domain.was expressed in different organs of soybean plants and the highest expression occurred in flowers. The effects of abiotic stresses (abscisic acid, NaCl, PEG, and cold) ongene expression in soybean seedling stage were analyzed by real-time quantitative PCR. The expression level ofgene was obviously increased under high salinity stress and less affected by ABA and drought stress but decreased by cold stress. The expression level ofgene in roots was significantly higher than that in stems and leaves before and after salt stress, and reached the peak at 48 h, then decreased slowly at 72 h and 96 h after salt stress. The overexpression vector ofwas constructed and transformed intostrain EHA105 to obtain the stable transgenicplants. After being treated with 200 mmol L–1NaCl for 14 d, the shoot height, root length, chlorophyll content, root activity as well as K+and Ca2+content increased significantly in transgenic plants compared with the wild type. The malondialdehyde content, relative membrane permeability and Na+content were obviously reduced in transgenic plants compared with the wild type. It is hypothesized that thegene participates in the abiotic stress response of soybean, and over-expression ofgene could enhance resistance to saline in.

;gene; abiotic stress; salt resistance

2017-11-03;

2018-06-12;

2018-06-30.

10.3724/SP.J.1006.2018.01347

柯丹霞, E-mail: kdx_029@163.com

本研究由國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31400213), 河南省科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目(182102110448), 信陽師范學(xué)院青年骨干教師資助計(jì)劃項(xiàng)目(2015), 信陽師范學(xué)院“南湖學(xué)者獎(jiǎng)勵(lì)計(jì)劃”青年項(xiàng)目和信陽師范學(xué)院研究生科研創(chuàng)新基金資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (31400213), the Science and Technology Research Projects of Henan Province (182102110448), the Funding Scheme for Young Core Teachers of Xinyang Normal University (2015), the Nanhu Scholars Program for Young Scholars of Xinyang Normal University, and the Scientific Research Foundation of Graduate School of Xinyang Normal University.

URL:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180629.1549.008.html