陳超敏 ，楊 佳 ，董智雄 ，3，朱長軍 ，3

（1.天津師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387；2.天津師范大學(xué) 天津市動植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387；3.天津師范大學(xué) 分子細(xì)胞系統(tǒng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300387）

細(xì)胞增殖過程又稱為細(xì)胞周期，是細(xì)胞生命活動的重要特征之一.細(xì)胞周期是從一次細(xì)胞分裂結(jié)束開始，經(jīng)過物質(zhì)準(zhǔn)備，直到下一次細(xì)胞分裂結(jié)束為止.細(xì)胞周期分為DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）、DNA合成后期（G2期）和有絲分裂期（M期）[1-3].細(xì)胞有絲分裂期又可分為前期、前中期、中期、后期和末期.細(xì)胞周期是一個十分復(fù)雜而又精確的生命過程，多種蛋白參與細(xì)胞周期的精確調(diào)控，使其能夠正確運(yùn)行，而任何環(huán)節(jié)的異常都可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡或細(xì)胞周期調(diào)控紊亂，最終引起細(xì)胞惡性增殖和腫瘤[4-6].核仁（nucleolus）是真核細(xì)胞內(nèi)無定型的亞細(xì)胞器結(jié)構(gòu)[7-8]，是細(xì)胞內(nèi)核糖體生物發(fā)生的場所[9-10].核糖體是細(xì)胞內(nèi)蛋白翻譯的唯一細(xì)胞器，因此核仁的結(jié)構(gòu)與功能與細(xì)胞增殖密切相關(guān)[11].近年來大量研究表明，核仁及核糖體相關(guān)蛋白在細(xì)胞應(yīng)激反應(yīng)過程中發(fā)揮著重要作用，在多種內(nèi)外條件的刺激下（如營養(yǎng)缺乏、DNA損傷和活性氧自由基ROS的積累），細(xì)胞產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致核糖體發(fā)生生物學(xué)變化[12-13]，即產(chǎn)生核糖體壓力.核糖體壓力應(yīng)答通路參與維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和基因組穩(wěn)定[14-16]，該應(yīng)答通路的異常，包括參與其中的各種蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、定位及功能的異常，都將引起細(xì)胞增殖和功能異常，最終導(dǎo)致多種疾病特別是腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[14，17].

核糖體RNA加工蛋白15（ribosome RNA processing protein 15，RRP15）是一個在進(jìn)化中高度保守的蛋白質(zhì)，其蛋白結(jié)構(gòu)中部含有一個coiled-coil結(jié)構(gòu)域，N端和C端沒有特異結(jié)構(gòu)域.據(jù)報道，在酵母中，RRP15參與核糖體60S大亞基的生物發(fā)生[18]；在小鼠中，RRP15可以調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡，并在核糖體RNA加工中發(fā)揮重要作用[19].本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，RRP15蛋白在細(xì)胞周期有絲分裂間期定位于核仁，并且在保持核仁結(jié)構(gòu)完整、核糖體生物發(fā)生以及細(xì)胞增殖等細(xì)胞生命活動中發(fā)揮重要調(diào)控作用[17，19]，但RRP15在有絲分裂期的功能仍不清楚.已知在細(xì)胞有絲分裂前期核仁發(fā)生解體，RRP15的亞細(xì)胞定位必然發(fā)生變化.RRP15蛋白在細(xì)胞周期不同時期的表達(dá)、亞細(xì)胞定位及其具體功能尚未見報道.

本研究以能夠穩(wěn)定表達(dá)GFP-RRP15的HeLa細(xì)胞為材料，通過細(xì)胞同步化、蛋白免疫印跡、免疫熒光染色、活細(xì)胞成像和染色體提取等方法，研究了RRP15在細(xì)胞周期不同時期的表達(dá)情況、亞細(xì)胞定位及其與有絲分裂期細(xì)胞染色體的關(guān)系，希望能夠?yàn)檫M(jìn)一步研究RRP15蛋白在細(xì)胞有絲分裂期的功能、探討RRP15與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系以及將RRP15作為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人宮頸癌細(xì)胞株HeLa、pEGFP-RRP15質(zhì)粒為天津師范大學(xué)分子細(xì)胞系統(tǒng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室所有[17].

1.1.2 試劑

DMEM培養(yǎng)基，美國Gibco公司；胎牛血清，美國Hyclone公司；Lipofectamine 3000、熒光標(biāo)記或辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗和DAPI，美國Invitrogen公司；特異性單克隆鼠抗α-Tubulin抗體、GFP抗體，美國 Sigma公司；RNA 酶（RNase）、DNA 酶（DNase），美國Takara公司；新霉素（G418），德國Calbiochem公司；特異性多克隆兔抗RRP15抗體、特異性多克隆兔抗PRC1抗體，本課題組自制.

1.1.3 儀器

蛋白電泳儀，美國Bio-Rad公司；Nikon TS-100 FL倒置熒光顯微鏡和Nikon 90i共聚焦熒光顯微鏡，日本Nikon公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及傳代

HeLa細(xì)胞用含有10%（體積分?jǐn)?shù)）胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在細(xì)胞培養(yǎng)箱中（溫度為37℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%）培養(yǎng)，每周傳代2～3次，傳代時先用胰酶消化細(xì)胞，擴(kuò)增細(xì)胞至新鮮培養(yǎng)基中.

1.2.2 細(xì)胞同步化實(shí)驗(yàn)

采用雙胸腺嘧啶核苷（double-thymidine）阻滯法將HeLa細(xì)胞阻滯于G1/S期.在對數(shù)生長期的HeLa細(xì)胞中加入終濃度為2 mmol/L的胸腺嘧啶核苷（thymidine），培養(yǎng)16～18 h.將細(xì)胞釋放至新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，然后再次加入終濃度為2 mmol/L的胸腺嘧啶核苷，繼續(xù)培養(yǎng)12 h.最后釋放細(xì)胞至新鮮培養(yǎng)基中，每隔2 h收集一次細(xì)胞，直至24 h.將收集的細(xì)胞用體積分?jǐn)?shù)為70%的冰乙醇溶液固定或裂解后保存在-20℃冰箱內(nèi)，分別通過流式細(xì)胞術(shù)和蛋白印跡雜交法進(jìn)行檢測分析.

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)

將同步化收集固定的細(xì)胞離心去除乙醇，用PBS洗滌 2次.加入 0.5 mL 的碘化丙啶（PI）染色液（50 μg/mL PI+100 mg/L RNase），37℃下避光放置30 min.應(yīng)用Facsort流式細(xì)胞儀對細(xì)胞內(nèi)的DNA含量進(jìn)行檢測，使用CellQuest軟件分析細(xì)胞周期的分布狀況.

1.2.4 蛋白免疫印跡雜交（Western blot）

收集細(xì)胞，使用1×SDS蛋白上樣緩沖液進(jìn)行裂解.將細(xì)胞裂解液進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，其后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜.用含有脫脂奶粉（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%）的TBS緩沖液室溫封閉30 min，隨后經(jīng)室溫一抗孵育2 h，二抗孵育1 h，最后加ECL顯色液，在暗室內(nèi)曝光檢測PVDF膜上的蛋白.

1.2.5 細(xì)胞免疫熒光（immunofluorescence，IF）

在細(xì)胞爬片上培養(yǎng)HeLa細(xì)胞，取出爬片后PBS洗3次，用500 μL的福爾馬林固定液固定細(xì)胞15 min，用含有甘氨酸（濃度為0.1 mol/L）的PBS終止固定反應(yīng).加入封閉液室溫封閉30 min，棄去封閉液，用含有Triton X-100（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%）的PBS洗3次.隨后加一抗室溫孵育2 h，熒光標(biāo)記的二抗室溫避光孵育1h，加1μg/mL的DAPI染色3min.最后封片，鏡檢.

1.2.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

在24孔板中接種5×104個HeLa細(xì)胞，CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h.按照產(chǎn)品說明書，應(yīng)用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑將質(zhì)粒pEGFP-RRP15轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率.

1.2.7 G418篩選

細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，用胰酶進(jìn)行消化，收集細(xì)胞計數(shù).轉(zhuǎn)1 000個細(xì)胞至直徑為10 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每皿加入含有G418（質(zhì)量濃度為1 g/L）的DMEM培養(yǎng)基，每5 d更換新鮮的含G418的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng).10 d后在倒置熒光顯微鏡下挑取熒光細(xì)胞克隆，置于24孔板中，待細(xì)胞生長擴(kuò)增后轉(zhuǎn)入直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng).

1.2.8 活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)（living cell imaging）

將穩(wěn)定表達(dá)GFP-RRP15的細(xì)胞接種于玻璃底細(xì)胞培養(yǎng)皿中，在活細(xì)胞成像系統(tǒng)中進(jìn)行培養(yǎng).應(yīng)用熒光顯微鏡觀察記錄細(xì)胞內(nèi)熒光蛋白的變化，每2 min拍照一次，連續(xù)拍攝24 h.

1.2.9 染色體提取實(shí)驗(yàn)（chromosome spreading）

在含有秋水仙素（質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL）的DMEM中培養(yǎng)HeLa細(xì)胞18 h，收集培養(yǎng)皿中懸浮的有絲分裂期細(xì)胞，置于冰上.用冰冷的PBS洗3次，再次離心收集.加入含有KCl（濃度為60 mmol/L）的PBS，37℃下放置30 min，短暫離心.應(yīng)用固定緩沖液（甲醇和乙酸的體積比為3∶1）將細(xì)胞冰上固定15 min，短暫離心.用2 mL固定buffer重懸細(xì)胞，從高處將細(xì)胞滴到載玻片上，隨后將細(xì)胞在含有DNase I（1 U/μL）的PBS中37℃下孵育20 min，對照組不含DNaseI.再用含有RNase（質(zhì)量濃度為100μg/mL）的PBS在37℃下孵育20 min.用PBS洗3次，每次5 min.隨后室溫一抗孵育2 h，二抗避光孵育1 h，質(zhì)量濃度為1 μg/mL的DAPI染色3 min.在載玻片上滴加4 μL的抗淬滅劑，封片，鏡檢.

2 結(jié)果與分析

2.1 RRP15在細(xì)胞周期不同時期的表達(dá)

采用Double-thymidine阻滯法對HeLa細(xì)胞進(jìn)行同步化處理，在不同時間收集細(xì)胞后，用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布狀況，用Western blot檢測RRP15在細(xì)胞周期不同時期的表達(dá)水平，結(jié)果如圖1所示.

圖1（a）中的流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果表明，HeLa細(xì)胞同步化較好，在0 h所有細(xì)胞均集中在G1/S期，其后隨著釋放時間的推移，進(jìn)入HS期，并在6～8 h時進(jìn)入G2/M期，在10 h重新進(jìn)入G1期.由圖1（b）可以看出，PRC1（protein regulate cytokinesis 1）蛋白主要在6～8 h的細(xì)胞中表達(dá)，該蛋白是一個參與調(diào)控細(xì)胞有絲分裂及胞質(zhì)分裂的微管結(jié)合蛋白，在G2/M期高表達(dá).RRP15蛋白在細(xì)胞周期的不同時期均有表達(dá)，且在10～24 h的細(xì)胞中表達(dá)微量上調(diào).

圖1 RRP15在細(xì)胞周期不同時期的表達(dá)Fig.1 Expression of RRP15 during cell cycle

2.2 RRP15在細(xì)胞有絲分裂期的亞細(xì)胞定位

RRP15在整個細(xì)胞周期中均有表達(dá)，預(yù)示它在細(xì)胞周期的各個時期都發(fā)揮著不可或缺的功能.利用純化的RRP15抗體對細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖2（a）所示.為了進(jìn)一步直觀觀察RRP15在細(xì)胞生長周期不同時期的定位，進(jìn)行活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖2（b）所示.

由圖2（a）可以看出：RRP15在間期細(xì)胞中主要定位于核仁；在核基質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)中也有少量定位.而在有絲分裂期，RRP15的細(xì)胞定位始終伴隨著染色體的行為而變化：前期核膜尚未破裂，RRP15仍主要定位于核仁部位；進(jìn)入前中期后，核膜破裂，核仁消失，RRP15散布在整個細(xì)胞中，并在染色體周圍定位較多；中期RRP15隨著染色體排列而集中在赤道板附近；后期RRP15仍集中在染色體附近；在末期，RRP15出現(xiàn)多個點(diǎn)狀集中區(qū)域（藍(lán)箭頭所示），可能為重新組裝的核仁結(jié)構(gòu)；當(dāng)核膜形成，核仁重新出現(xiàn)時，RRP15重新定位于核仁中.除此之外，RRP15在有絲分裂末期的中小體結(jié)構(gòu)處也觀察到少量定位（黃箭頭所示）.由圖2（b）可以看出：GFP-RRP15在有絲分裂間期也主要定位于核仁部位，這與內(nèi)源性染色結(jié)果一致；而在有絲分裂期，GFP-RRP15始終伴隨著染色體；在末期，除主要定位于重新裝配的核仁部位外，在中小體部位也存在少量GFP-RRP15定位（紅箭頭所示）.總的來看，RRP15在有絲分裂期是一個染色體伴侶蛋白，始終伴隨染色體定位.

圖2 RRP15在細(xì)胞有絲分裂期的亞細(xì)胞定位Fig.2 RRP15 subcellular localization in mitosis

2.3 RRP15與染色體的關(guān)系

細(xì)胞免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)和活細(xì)胞成像實(shí)驗(yàn)顯示，RRP15在有絲分裂期伴隨在染色體外周.為了進(jìn)一步確認(rèn)RRP15與染色體的關(guān)系，利用染色體提取制備方法分離有絲分裂中期細(xì)胞的染色體，并通過免疫熒光觀察RRP15與染色體的關(guān)系，結(jié)果如圖3（a）所示.將純化的染色體經(jīng)RRP15抗體和DAPI染色，發(fā)現(xiàn)RRP15與DNA存在明顯的共定位，由此證實(shí)RRP15定位于分離的有絲分裂期染色體上.RRP15可能通過與DNA直接作用結(jié)合在染色體上，也可以通過與染色體上其他蛋白的相互作用定位至染色體.為了進(jìn)一步分析RRP15的染色體定位機(jī)制，再次進(jìn)行了染色體提前制備實(shí)驗(yàn)，并對實(shí)驗(yàn)操作步驟做了修改.將染色體從細(xì)胞中分離到載玻片上后，首先用DNase處理消化DNA，然后再進(jìn)行固定，染色.通過免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)檢測DNase處理后RRP15蛋白定位的變化.如果RRP15為DNA結(jié)合蛋白，則消化DNA后RRP15也將從染色體上脫落，無法觀察到RRP15的染色；若RRP15為染色體外周蛋白，消化DNA則不會影響RRP15的定位，最后仍可觀察到RRP15染色.實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖 3（b）所示.由圖 3（b）可以看出，DNase處理引起染色體DNA的染色明顯下降，但RRP15的染色體外周染色并沒有顯著變化.這表明RRP15在有絲分裂期定位于染色體但不依賴于染色體DNA，而是通過其他機(jī)制定位于染色體外周.

圖3 RRP15與染色體的關(guān)系Fig.3 Relationship of RRP15 with chromosome

3 討論與分析

核糖體RNA加工蛋白RRP15已被證實(shí)是核仁定位蛋白，與核仁的形成、核糖體的生物發(fā)生以及細(xì)胞生長增殖密切相關(guān)[17].本研究明確了RRP15在細(xì)胞周期不同時期的表達(dá)情況和亞細(xì)胞定位，證實(shí)RRP15在整個細(xì)胞周期中均有穩(wěn)定表達(dá)，且在G1期表達(dá)微量上調(diào).RRP15在細(xì)胞有絲分裂間期的定位與功能研究已經(jīng)較為明確.前期研究[17]表明，RRP15在間期定位于核仁，并且在控制核仁形成、核糖體生物發(fā)生和細(xì)胞增殖方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用，但是RRP15在有絲分裂期的定位與功能仍然是未知的.本研究通過細(xì)胞免疫熒光染色、活細(xì)胞成像技術(shù)及有絲分裂中期染色體提取染色等實(shí)驗(yàn)確定了在有絲分裂期RRP15的定位伴隨著染色體，并且在有絲分裂末期有少量定位于中小體部位.RRP15在有絲分裂期是一個染色體外周蛋白，其染色體外周定位不依賴于染色體DNA.這一結(jié)果表明，RRP15在有絲分裂期作為染色體外周蛋白，可能發(fā)揮著保護(hù)和維持細(xì)胞有絲分裂期染色體結(jié)構(gòu)的功能，在有絲分裂期細(xì)胞染色體的整列與分離過程中發(fā)揮潛在作用，最終參與調(diào)控細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性[20-21].

綜上所述，本研究結(jié)果為探討RRP15在細(xì)胞有絲分裂期的功能提供了細(xì)胞表型基礎(chǔ)，并為探究染色體外周蛋白的定位提供了新的技術(shù)方法.在后續(xù)研究中，本課題組會進(jìn)一步探討將細(xì)胞內(nèi)RRP15過表達(dá)或敲除后有絲分裂期染色體整列與分離以及有絲分裂紡錘體形成與功能的異常等，最終明確RRP15在細(xì)胞有絲分裂期的具體作用.