王德凱 ，李 穎 ，王躍棠 ，梅續(xù)芳 ，解李娜 ，李清芳 ，馬成倉

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300387；2.天津師范大學(xué)天津市動植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300387）

土壤微生物是生活在土壤中的細(xì)菌、真菌、放線菌、藻類的總稱.其組成和結(jié)構(gòu)一方面受土壤性質(zhì)的影響，如土壤水分、土壤溫度、pH、土壤養(yǎng)分、土壤質(zhì)地等[1-2]；另一方面，土壤微生物群落與植物生長過程緊密相關(guān)，植物通過凋落物、根系分泌物、植物生產(chǎn)力等影響土壤微生物群落[3-4].灌木已成為全球草地生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，其密度和蓋度較大且呈逐年增加趨勢.灌叢的形成改變了地表土壤資源的分配，使水分和養(yǎng)分較多地聚集在灌叢內(nèi)，導(dǎo)致土壤資源具有空間異質(zhì)性，形成“沃島”[5].“沃島”的形成又會引發(fā)土壤有機(jī)碳和其他成分的空間異質(zhì)性，加劇了資源的異質(zhì)化和斑塊化[6]，從而影響土壤微生物群落.灌叢土壤資源異質(zhì)化又會引起灌叢內(nèi)外植被的異質(zhì)化，進(jìn)一步影響土壤微生物群落[7-8].

錦雞兒屬（Caragana Fabr.）植物是內(nèi)蒙古草原最常見的灌木，具有很強(qiáng)的適應(yīng)干旱、寒冷環(huán)境和耐貧瘠能力，不僅是牲畜的優(yōu)質(zhì)牧草，還能夠防風(fēng)固沙、保持水土[9].本研究以內(nèi)蒙古荒漠草原的中間錦雞兒灌叢的土壤微生物為研究對象，通過傳統(tǒng)培養(yǎng)法和分子生物學(xué)技術(shù)，比較灌叢內(nèi)外土壤微生物群落的差異，探討中間錦雞兒灌叢形成導(dǎo)致的土壤資源異質(zhì)化對土壤微生物的影響，進(jìn)一步理解中間錦雞兒灌叢的沃島效應(yīng).

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

樣地位于內(nèi)蒙古鄂托克旗的烏蘭鎮(zhèn)（北緯39°1′，東經(jīng)107°98′），該地區(qū)為典型的溫帶大陸性季風(fēng)氣候，日照充足，四季分明，年平均降水量約為250 mm，降水主要集中在7—9月份.年平均蒸發(fā)量為2 400～2 800 mm，是降水量的8到12倍.年平均氣溫為6.5℃，年日照時(shí)數(shù)約3 000 h.土壤質(zhì)地以疏松的砂質(zhì)壤土或沙土為主.

1.2 研究方法

1.2.1 土壤樣品采集

2016年7月在鄂托克旗烏蘭鎮(zhèn)選取3個(gè)優(yōu)勢種為中間錦雞兒的地區(qū)作為樣地，每個(gè)樣地隨機(jī)選取3株中間錦雞兒灌叢，在灌叢內(nèi)和灌叢外（距離灌叢邊緣 2 m）分別采集 0～10 cm（A 層）、10～20 cm（B 層）、30～40 cm（C層）的土壤樣品約300 g，用自封袋密封.樣品于4℃保存，一部分用于土壤理化性質(zhì)的測定，一部分用于土壤微生物多樣性的測定.

1.2.2 土壤理化性質(zhì)的測定

采用水浸提電位法測定土壤pH值；采用烘干法測量含水量；采用重鉻酸鉀容量法測定有機(jī)質(zhì)（Organic matter）含量；采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測定速效磷（Available phosphorus）含量；采用醋酸銨浸提-火焰光度法測定速效鉀（Available potassium）含量；使用流動分析儀測定硝態(tài)氮（Nitrate nitrogen）和銨態(tài)氮（Ammonium nitrogen）含量.將土樣浸提，然后用DDS～LLA型電導(dǎo)儀測定電導(dǎo)率（Electricconductivity）[10].中間錦雞兒灌叢內(nèi)外的土壤理化性質(zhì)如表1所示.

表1 中間錦雞兒灌叢內(nèi)外土壤理化性質(zhì)Tab.1 Physical and chemical characteristics of soil inside and outside Caragana intermedia shrubs

1.2.3 土壤微生物群落的多樣性測定

（1）土壤微生物培養(yǎng)：分別采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬丁氏培養(yǎng)基和高氏一號培養(yǎng)基法培養(yǎng)土壤中的細(xì)菌、真菌和放線菌，采用稀釋平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)，結(jié)果以每克干土所含的微生物菌落數(shù)表示.用平板劃線分離法分離純化微生物菌落.

1g干土中的菌落數(shù)（cfu/g）=M×鮮土質(zhì)量/干土質(zhì)量式中：M=a×u/V，a為培養(yǎng)皿中的平均菌落數(shù)，u為稀釋倍數(shù)，V為每個(gè)培養(yǎng)皿中加入的土壤懸液的體積（本實(shí)驗(yàn)中為0.2 mL）.

（2）微生物的分子生物學(xué)鑒定：細(xì)菌和放線菌DNA采用生工Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒進(jìn)行提取，真菌DNA采用生工Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作.采用通用引物 1492R（5′-GGT TAC CTT GTT ACGACT T-3′）和 27F（5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTCAG-3′）擴(kuò)增細(xì)菌和放線菌16S rDNA片段，GeoA2（5′-CCA GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3′）和 Geo11（5′-ACC TTG TTA CTT TTA CTT CC-3′）擴(kuò)增真菌18S rDNA片段.PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由北京華大基因公司測序，所得堿基序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫，使用BLAST程序進(jìn)行比對分析，將菌株鑒定到屬.

采用Shannon-Wiener多樣性指數(shù)（H′）分析評價(jià)土壤微生物群落的多樣性[11].

式中：Pi表示群落中第i個(gè)物種的個(gè)體數(shù)占群落中個(gè)體總數(shù)的比例.

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVAs）（P＜0.05），分析灌叢內(nèi)外不同土層間微生物菌落數(shù)量和多樣性的差異.用Tukey HSD做多重比較.采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析灌叢內(nèi)外的差異.采用CANOCO 4.5軟件對土壤微生物和環(huán)境因子之間的關(guān)系進(jìn)行冗余分析.用Monte Carlo置換檢驗(yàn)分析環(huán)境因子對土壤微生物群落影響的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）.

2 結(jié)果與分析

2.1 中間錦雞兒灌叢土壤微生物的數(shù)量

中間錦雞兒灌叢內(nèi)外不同土層的土壤微生物數(shù)量如圖1所示.

圖1 灌叢內(nèi)外土壤細(xì)菌、放線菌和真菌菌落總數(shù)Fig.1 Quantity of bacteria，actinomycetes and fungi inside and outside the shrubs

由圖1可以看出，土壤微生物總數(shù)表現(xiàn)為：細(xì)菌＞放線菌＞真菌.灌叢內(nèi)土壤細(xì)菌數(shù)隨著土層深度的增加顯著下降（P＜0.05），而灌叢外則呈先緩慢增加后減少的趨勢；同一土層灌叢內(nèi)土壤細(xì)菌總數(shù)均顯著高于灌叢外的數(shù)量（P＜0.05）.灌叢內(nèi)外放線菌總數(shù)均表現(xiàn)為A層＞B層＞C層，且不同土層間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；同一土層灌叢內(nèi)的土壤放線菌總數(shù)均大于灌叢外的數(shù)量，A層和B層灌叢內(nèi)外的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），C層灌叢內(nèi)外數(shù)量相近（P＞0.05）.灌叢內(nèi)外的土壤真菌數(shù)隨著土層深度的增加均呈先增加后減少的趨勢，不同土層之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；同一土層灌叢內(nèi)土壤真菌總數(shù)均顯著高于灌叢外的數(shù)量（P＜0.05）.

2.2 中間錦雞兒灌叢土壤微生物的群落組成

2.2.1 細(xì)菌

本研究從中間錦雞兒灌叢內(nèi)外土壤中共分離出細(xì)菌13屬，如表2所示.無論是灌叢內(nèi)還是灌叢外，A層的優(yōu)勢屬均為芽孢桿菌屬（Bacillus）和短小桿菌屬（Curtobacterium Yamada），B層和C層的優(yōu)勢屬為芽孢桿菌屬、短小桿菌屬和類芽孢桿菌屬（Paenibacillus Ash），優(yōu)勢屬的相對豐度在不同土層間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）.在灌叢內(nèi)，芽孢桿菌屬的相對豐度隨土層深度增加顯著下降（P＜0.05），灌叢外則無顯著差異（P＞0.05）.無論是灌叢內(nèi)還是灌叢外，類芽孢桿菌屬的相對豐度均隨土層深度的增加而顯著升高（P＜0.05）.在灌叢內(nèi)，短小桿菌屬在B層的數(shù)量最多，在灌叢外則是A層數(shù)量最多.壤霉菌屬（A-gromyces）、溶桿菌屬（Lysobacter）、鞘氨醇桿菌屬（Sphingobacterium sp）、嗜麥芽窄食單胞菌屬（Stenotrophomonas maltophilia））、金黃桿菌屬（Chryseobacterium））、假單胞菌屬（Pseudoxanthomonas）為灌叢內(nèi)特有屬，且壤霉菌屬、溶桿菌屬、鞘氨醇桿菌屬、金黃桿菌屬均集中在灌叢內(nèi)的A層.節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）僅在A層出現(xiàn).葡萄球菌屬（Staphylococcus）在各土層均能檢測到，灌叢內(nèi)各土層間的差異較?。≒＞0.05），灌叢外則隨著土層深度的增加呈下降趨勢（P＜0.05）.中華根瘤菌屬（Sinorhizobium Chen）在灌叢內(nèi)僅在A層檢測到；灌叢外則分布于A層和B層.微桿菌屬（Microbacterium）在灌叢內(nèi)的各個(gè)土層均可檢測到，且A層和C層數(shù)量相近，顯著高于B層；灌叢外則出現(xiàn)于B層和C層，且后者數(shù)量顯著高于前者（P＜0.05）.

表2 灌叢內(nèi)外土壤細(xì)菌群落組成及相對豐度Tab.2 Community composition and relative abundance of bacteria inside and outside shrubs %

2.2.2 真菌

中間錦雞兒灌叢內(nèi)外土壤中共分離出真菌12屬，如表3所示.由表3可以看出，曲霉屬（Aspergillus）為灌叢內(nèi)外各土層的優(yōu)勢屬，且相對豐度隨著土層深度的增加顯著增加（P＜0.05）.小囊菌（Microascaceae）為灌叢內(nèi)B、C層和灌叢外C層的優(yōu)勢屬.青霉屬（Penicillium）主要集中在灌叢內(nèi)的A層和灌叢外的B、C層，灌叢內(nèi)的相對豐度隨著土層深度的增加顯著降低（P＜0.05），灌叢外則是B層數(shù)量最多.莖點(diǎn)霉屬（Phorna）和隱球菌屬（Cryptococcus）均僅出現(xiàn)在灌叢內(nèi)外的A層，而鏈格孢霉屬（Alternaria）出現(xiàn)在A層和B層.木霉屬（Trichoderma）、露漆濕斑菌屬（Myrothecium roridum）和小麥葉枯病菌（Septoriatritici）均為灌叢內(nèi)特有屬，疣孢漆斑菌屬（Myrothecium verrucaria）為灌叢外特有屬.鐮刀菌屬（FusariumLink）、球毛殼菌屬（Chaetomium）和小囊菌（Microascaceae）在灌叢內(nèi)外的各個(gè)土層均能檢測到，通常富集在B層和C層.

表3 灌叢內(nèi)外土壤中真菌群落組成及相對豐度Tab.3 Community composition and relative abundance of fungi inside and outside shrubs %

2.2.3 放線菌

中間錦雞兒灌叢內(nèi)外土壤中共分離出了放線菌5屬，如表4所示.灌叢內(nèi)和灌叢外各土層的優(yōu)勢屬均為鏈霉菌屬（Streptomyces），相對豐度占各土層放線菌總數(shù)的83%～95%，B層的相對豐度顯著高于A層和 C 層（P＜0.05）.小單孢菌屬（Micromonospora）僅在灌叢內(nèi)出現(xiàn)，為灌叢內(nèi)A層的優(yōu)勢屬.諾卡氏菌屬（Nocardia）同樣僅出現(xiàn)在灌叢內(nèi)，為灌叢內(nèi)C層的優(yōu)勢屬，且相對豐度隨著土壤深度增加顯著升高（P＜0.05）.Dyadobacter屬僅在灌叢內(nèi)的A層檢測到.

表4 灌叢內(nèi)外土壤中放線菌群落的組成及相對豐度Tab.4 Community composition and relative abundance of actinomycetes inside and outside shrub canopies %

2.3 中間錦雞兒灌叢土壤微生物多樣性

中間錦雞兒灌叢不同土層的土壤微生物多樣性指數(shù)計(jì)算結(jié)果如表5所示.

表5 灌叢內(nèi)外土壤微生物的Shannon-Wiener指數(shù)Tab.5 Shannon-Wiener index（H′）of soil microorganisms inside and outside the shrubs

由表5可以看出，中間錦雞兒灌叢內(nèi)土壤細(xì)菌的H′指數(shù)隨著土層深度的增加顯著下降（P＜0.05），灌叢外則隨著土層深度的增加先增加后下降，但不同土層之間的差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；A層和B層灌叢內(nèi)的細(xì)菌H′指數(shù)顯著高于灌叢外的數(shù)值，C層灌叢內(nèi)外的數(shù)值相同.土壤真菌的H′指數(shù)在灌叢內(nèi)外均隨著土層深度的增加呈下降趨勢；A層灌叢內(nèi)的數(shù)值顯著高于灌叢外的數(shù)值，B層和C層則是顯著低于灌叢外的數(shù)值（P＜0.05）.灌叢內(nèi)土壤放線菌的H′隨著土層深度的增加呈下降趨勢（P＜0.05），而灌叢外H′隨著土層深度的增加先降低后增加（P＜0.05）；A層和B層灌叢內(nèi)的放線菌H′指數(shù)顯著高于灌叢外的數(shù)值（P＜0.05），C層數(shù)值相近（P＞0.05）.

2.4 土壤微生物群落與環(huán)境之間的關(guān)系

2.4.1 土壤細(xì)菌群落與環(huán)境的關(guān)系

對中間錦雞兒灌叢土壤細(xì)菌群落與環(huán)境之間的關(guān)系進(jìn)行冗余分析，結(jié)果如圖2所示.

圖2 土壤細(xì)菌群落和環(huán)境因子的冗余分析Fig.2 RDA diagram of the relationship between soil bacterial communities and environmental factors

RDA的直接排序圖顯示，第一軸、第二軸對響應(yīng)變量的解釋比例分別為56.7%和25.6%，Monte Carlo置換檢驗(yàn)排序軸均達(dá)到顯著水平（第一排序軸：F=9.156，P＜0.05；所有排序軸：F=5.147，P=0.002），說明環(huán)境因子能夠顯著影響土壤細(xì)菌群落.與第一軸關(guān)系最密切的是速效鉀（r=0.706 5），與第二軸關(guān)系最緊密的是灌叢（r=0.8467）.RDA排序圖結(jié)果表明，假單胞菌屬、溶桿菌屬、嗜麥芽窄食單胞菌屬、芽胞桿菌屬、壤霉菌屬、溶桿菌屬、金黃桿菌屬和鞘氨醇桿菌屬與土壤有機(jī)質(zhì)、硝態(tài)氮含量呈顯著正相關(guān)，但與土壤pH呈顯著負(fù)相關(guān).類芽孢桿菌屬與土壤含水量呈顯著正相關(guān)，與銨態(tài)氮含量呈顯著負(fù)相關(guān).中華根瘤菌屬與銨態(tài)氮含量呈顯著正相關(guān)，但與土壤含水量呈顯著負(fù)相關(guān).節(jié)桿菌屬與速效磷、速效鉀含量呈顯著正相關(guān)，與土壤土壤含水量也呈顯著負(fù)相關(guān).

2.4.2 土壤真菌群落與環(huán)境的關(guān)系

對中間錦雞兒灌叢土壤真菌群落與環(huán)境之間的關(guān)系進(jìn)行冗余分析，結(jié)果如圖3所示.

圖3 土壤真菌群落和環(huán)境因子的冗余分析Fig.3 RDA diagram of the relationship between soil fungal communities and environmental factors

RDA直接排序圖顯示，第一軸、第二軸對響應(yīng)變量的解釋比例分別為69.3%和11.3%，Monte Carlo置換檢驗(yàn)排序軸均達(dá)到顯著水平（第一排序軸：F=15.825，P＜0.05；所有排序軸：F=8.020，P＜0.05）.與第一軸關(guān)系最密切的是灌叢（r=0.754 7），與第二軸關(guān)系最緊密的是硝態(tài)氮含量（r=0.863 1）.球毛殼菌屬和木霉屬與硝態(tài)氮含量、速效鉀含量和有機(jī)質(zhì)含量呈顯著正相關(guān)，與土壤pH呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）.小囊菌屬與土壤含水量呈顯著正相關(guān)，與速效磷含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）.疣孢漆斑菌屬與速效磷含量含量、土壤pH呈顯著正相關(guān)，與土壤有機(jī)質(zhì)含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）.

放線菌冗余分析Monte Carlo置換檢驗(yàn)未達(dá)到顯著水平，說明環(huán)境因子對放線菌的影響不顯著.

3 討論與結(jié)論

本研究對內(nèi)蒙古荒漠草原中間錦雞兒灌叢內(nèi)外的微生物多樣性進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，土壤可培養(yǎng)細(xì)菌的數(shù)量最多，其次是放線菌，真菌數(shù)量最少，這與多數(shù)研究[12-13]結(jié)果一致.土壤微生物的數(shù)量和群落多樣性存在明顯的垂直分布異質(zhì)性.如苦豆子、芨芨草、油蒿等的土壤微生物數(shù)量隨土層加深呈下降趨勢[14-16]；小興安嶺的原始紅松林、硬闊葉林和白樺林3種林地的土壤微生物多項(xiàng)多樣性指數(shù)隨著土層深度的增加顯著下降[17].細(xì)菌和真菌的豐富度隨土壤深度的增加而下降，而放線菌的豐富度隨土壤深度的增加而增加[18-19].本研究結(jié)果表明，中間錦雞兒灌叢的土壤可培養(yǎng)細(xì)菌、真菌和放線菌的數(shù)量及H′均表現(xiàn)為表層土或次表層土最大，這主要是因?yàn)橥寥辣韺痈采w有較多的凋落物，凋落物的分解提高了土壤表層養(yǎng)分含量，有利于表層土中土壤微生物的生長.另外，土壤性質(zhì)隨著土層深度的變化而變化，從而影響土壤微生物群落.本研究通過RDA分析發(fā)現(xiàn)土壤速效鉀和硝態(tài)氮均與土壤可培養(yǎng)細(xì)菌和真菌的關(guān)系密切，說明速效鉀和硝態(tài)氮是影響中間錦雞兒土壤細(xì)菌和真菌的主要環(huán)境因素.RDA分析還表明土壤可培養(yǎng)放線菌數(shù)量與環(huán)境因子之間的相關(guān)性不顯著，說明環(huán)境變化對放線菌群落的影響不大.中間錦雞兒灌叢內(nèi)的土壤細(xì)菌、真菌、放線菌數(shù)量和多樣性均大于灌叢外，這是由于中間錦雞兒灌叢的生長發(fā)育引起土壤資源空間異質(zhì)性，灌叢內(nèi)土壤養(yǎng)分聚集，形成比周圍環(huán)境更適宜的微生境[20-21]，從而有利于土壤微生物生長.與灌叢外相比，灌叢內(nèi)的植物多樣性更高，這也會增加土壤有機(jī)質(zhì)含量并調(diào)節(jié)土壤含水量，即改善了土壤微生物的生存環(huán)境[22-23].

在土壤細(xì)菌中，Lysobacter含有較高的G+C含量和生物分解活性，能分泌各種抗生素、酶和生物活性物質(zhì)，并抑制有害細(xì)菌的滋生，控制植物疾病.中間錦雞兒灌叢中，Lysobacter僅出現(xiàn)在灌叢內(nèi)表層，這對中間錦雞兒灌叢具有保護(hù)作用.諾卡氏菌能夠在一定程度上指示土壤肥力的高低，諾卡氏菌越多，土壤肥力越高.本研究結(jié)果表明諾卡氏菌屬只出現(xiàn)在灌叢內(nèi)，也說明了灌叢內(nèi)的土壤肥力高于灌叢外的肥力.