唐文誠，李 敏，易輝燕，羅芳芳，楊 麗

(綿陽市第三人民醫(yī)院·四川省精神衛(wèi)生中心，四川 綿陽 621000)

抑郁癥是一種臨床常見的、嚴重危害人類身心健康的精神疾病，發(fā)病機制復雜，可由各種原因引起，其發(fā)病率和自殺率均較高，患者的心理社會功能受損明顯[1]。細胞因子作為能在細胞之間傳遞信息、具有免疫調(diào)節(jié)和效應功能的一類蛋白質(zhì)或小分子多肽，其在抑郁癥中的作用已引起越來越多研究者的重視[2]。Smith[3]于90年代提出細胞因子假說，認為抑郁癥及抑郁相關癥狀與腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、干擾素-γ(interferon-γ，INF-γ)以及白介素1(interleukin-1，IL-1)等細胞因子的過度分泌有關。而細胞因子的過度分泌與體內(nèi)氧化應激密切相關，有研究顯示，雙相情感障礙患者發(fā)作期的氧化應激系統(tǒng)失衡，這可能會引發(fā)雙相情感障礙的某些臨床特征[4]。慢性應激反應可改變體內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)和激素的釋放、炎性因子的產(chǎn)生以及神經(jīng)營養(yǎng)因子和生長因子的表達，導致海馬組織內(nèi)神經(jīng)再生障礙，使學習功能減退，誘發(fā)抑郁癥[5-6]。抑郁癥患者常有心境低落、思維遲緩、意志活動減退等癥狀，學習、記憶和工作能力均有不同程度的下降，而海馬神經(jīng)元與學習、記憶功能密切相關[7-9]。由于炎性細胞因子作用的重要靶點之一是海馬組織，故炎癥-細胞因子假說也被很多學者關注[10]。有研究顯示，非甾體抗炎藥如美洛昔康、尼美舒利有一定的抗抑郁作用[11-13]。阿司匹林作為經(jīng)典的非甾體抗炎藥物，可作用于細胞因子而發(fā)揮解熱鎮(zhèn)痛、抗炎、抗血栓等作用[14]，但目前阿司匹林單獨用于抗抑郁治療及其抗抑郁機制的相關研究較少，本研究通過觀察阿司匹林對慢性不可預見性溫和應激(chironic unpredictable mild stress，CUMS)抑郁模型大鼠海馬組織內(nèi)細胞因子的影響，探討阿司匹林的抗抑郁作用及其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

清潔級成年雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量(200±20)g，由重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供。進行晝夜時間比為1∶1(12 h/12 h)的循環(huán)飼養(yǎng)，保持室內(nèi)溫度(25±2)℃、濕度(65±20)%，食物與水充分供給，自由攝取。適應性喂養(yǎng)7 d后開始試驗。本研究經(jīng)倫理委員會審核通過，遵守實驗動物照料和使用原則。

1.1.2 實驗試劑及藥品

阿司匹林，購于辰欣藥業(yè)股份有限公司；0.9%氯化鈉注射液，購于四川科倫藥業(yè)股份有限公司；TNF-α試劑盒、白介素10(interleukin-10，IL-10)試劑盒、白介素6(interleukin-6，IL-6)試劑盒、白介素4(interleukin-4，IL-4)試劑盒、白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)試劑盒，均購于福建海韻生物科技有限公司。

1.1.3 實驗設備與儀器

曠場實驗行為測試儀、高架十字迷宮測試儀、強迫游泳行為測試儀，均由重慶醫(yī)科大學藥理實驗室制。MDF-U3386S型-80℃超低溫冰箱購自日本SANYO公司，iMark550型多功能酶標儀購自美國Bio-Rad公司，JM-B30002電子天平購自諸暨市超澤衡器設備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組

將30只雄性SD大鼠適應性喂養(yǎng)7 d后，采用曠場試驗對大鼠行為進行評定，然后按隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組和阿司匹林組各10只。正常組繼續(xù)在原條件下飼養(yǎng)，模型組和阿司匹林組單籠飼養(yǎng)。

1.2.2 CUMS抑郁模型建立

參考汪燕等[15-17]研究方法，采用慢性不可預見性刺激結(jié)合孤養(yǎng)方式建立抑郁大鼠模型。除正常組外，模型組和阿司匹林組均接受為期21 d的不同刺激。刺激方法包括：4℃冰水游泳5 min、45℃熱刺激5 min、鼠籠45°傾斜24 h、異味刺激24 h、禁食24 h、禁水24 h、夾尾巴1 min、潮濕墊料24 h、晝夜顛倒12 h/12 h。每天隨機選擇1種方法對大鼠進行刺激，每種刺激方法不超過3次且同種刺激不能連續(xù)出現(xiàn)。

1.2.3 干預方法

于建模成功后對3組大鼠開始灌胃，灌胃時間為每天8∶00-9∶00，每次灌胃量均為2 mL，每日1次，連續(xù)灌胃21 d。阿司匹林組給藥方法：阿司匹林3 mg/(kg·d)，用0.9%氯化鈉注射液配制成0.3 mg/mL的藥液；正常組和模型組均給予等體積0.9%氯化鈉注射液。

1.2.4 行為及療效評定

對模型組和阿司匹林組大鼠連續(xù)21 d進行CUMS后，采用曠場實驗評定大鼠行為以判斷建模是否成功。對3組大鼠灌胃21 d后，采用曠場實驗、強迫游泳實驗、高架十字迷宮實驗評定療效。曠場實驗主要是觀察大鼠5 min內(nèi)的水平和垂直運動次數(shù)，用于評定大鼠的運動和探索行為能力。強迫游泳實驗主要是觀察大鼠6 min內(nèi)的攀爬、游泳、潛水次數(shù)和不動時間，本研究僅觀察大鼠的不動時間，用于評定藥物是否具有抗抑郁作用。高架十字迷宮實驗主要是觀察大鼠5 min內(nèi)進入開放臂次數(shù)(OE)、進入開放臂時間百分比(OT%)及進入高架十字迷宮總次數(shù)(OE+CE)，用于評定大鼠的焦慮或抑郁程度。曠場實驗、強迫游泳實驗及高架十字迷宮實驗的具體操作方法和步驟按相關文獻[12-13]進行。

1.2.5 細胞因子檢測

運用酶聯(lián)免疫吸附測定法(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA)的生物素雙抗體夾心法測定大鼠IL-1β、IL-4、IL-6、IL-10及TNF-α水平。根據(jù)說明書及相關文獻[9,13]的步驟和方法進行操作。根據(jù)標準品的濃度及對應吸光度(OD)值，先計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的OD值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。

1.3 統(tǒng)計方法

2 結(jié) 果

2.1 CUMS前三組大鼠曠場實驗結(jié)果比較

CUMS前，三組大鼠的水平和垂直運動次數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1 CUMS前三組大鼠曠場實驗結(jié)果比較次)

2.2 CUMS后三組大鼠曠場實驗結(jié)果比較

建模后，與正常組相比，模型組、阿司匹林組大鼠的水平和垂直運動次數(shù)均減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。見表2。

表2 CUMS后三組大鼠曠場實驗結(jié)果比較次)

2.3 干預后三組大鼠行為指標比較

干預后，三組大鼠的水平與垂直運動次數(shù)、不動時間、OE及(OE+CE)次數(shù)、OT%值差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。進一步兩兩比較顯示，模型組水平運動與垂直運動、OE及(OE+CE)次數(shù)均少于正常組，OT%值低于正常組，不動時間長于正常組，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)。阿司匹林組水平運動與垂直運動、OE及(OE+CE)次數(shù)均多于模型組，OT%值高于模型組，不動時間短于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或0.01)。見表3。

2.4 干預后三組大鼠海馬組織內(nèi)細胞因子水平比較

干預后，三組大鼠海馬組織的IL-1β，IL-4，IL-6，IL-10，TNF-α水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P均<0.05)。進一步兩兩比較顯示，模型組大鼠IL-1β、IL-6和TNF-α水平均高于正常組，IL-4水平低于正常組(P<0.05或0.01)；正常組與模型組IL-10水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。阿司匹林組大鼠IL-10水平高于模型組，IL-6和TNF-α水平均低于模型組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或0.01)，阿司匹林組與模型組大鼠IL-4、IL-1β水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表4。

表3 干預后三組大鼠行為指標比較

注：與正常組比較，aP<0.01；與阿司匹林組比較，bP<0.05，cP<0.01

表4 干預后三組大鼠海馬組織內(nèi)細胞因子水平比較

注：IL-1β，白介素1β；TNF-α，腫瘤壞死因子α；IL-6，白介素6；IL-4，白介素4；IL-10，白介素10；與正常組比較，aP<0.01，bP<0.05；與阿司匹林組比較，cP<0.01，dP<0.05

3 討 論

抑郁癥是一種常見的慢性心理疾病，長時間的慢性壓力是其發(fā)病的主要誘因[18]。CUMS通過改變外部環(huán)境使大鼠產(chǎn)生異常行為，從而建立抑郁模型，該模型能模擬人類抑郁的核心癥狀(如對愉悅事件的反應)，更接近人類抑郁癥的各種癥狀[15]，是一種經(jīng)典的抑郁建模方法。

本研究采用CUMS結(jié)合孤養(yǎng)方式建立大鼠抑郁模型。對大鼠連續(xù)21 d進行CUMS后，模型組和阿司匹林組大鼠的水平運動和垂直運動次數(shù)均少于正常組(P均<0.05)，說明模型組和阿司匹林組大鼠的活動度、對新鮮環(huán)境的探索能力降低，快感缺乏。提示CUMS致大鼠出現(xiàn)抑郁行為，建模成功，與Lu等[19-21]研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果顯示，干預后，阿司匹林組大鼠的水平、垂直運動次數(shù)均多于模型組，水平運動反映動物的活動度，垂直運動反映動物對新環(huán)境的好奇度[20]，提示經(jīng)阿司匹林灌胃后，大鼠的活躍度增強，探索能力提高。水中不動時間反映藥物是否具有抗抑郁作用[17,22]，本研究中，阿司匹林組大鼠的不動時間短于模型組，提示阿司匹林具有一定抗抑郁作用。本研究結(jié)果顯示，干預后，阿司匹林組大鼠的OE、(OE+CE)次數(shù)均多于模型組，OT%值高于模型組，提示經(jīng)阿司匹林灌胃后，大鼠的抑郁或焦慮程度減輕。

細胞因子可分為前炎性細胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)和抗炎性細胞因子(IL-4、IL-10)。有研究顯示，細胞因子在抑郁癥的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，前炎性細胞因子與抑郁癥的發(fā)病相關，而抗炎性細胞因子與抗抑郁療效相關[5,23]。有研究發(fā)現(xiàn)，在抑郁癥患者的血液和腦脊液中均伴有IL-1β、IL-6、TNF-α水平的升高，而抗抑郁藥物的療效與IL-4、IL-10水平的下降有關[23]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠海馬組織的IL-1β、IL-6、TNF-α水平高于正常組，而IL-4水平低于正常組，提示抑郁癥的發(fā)生可能與細胞因子水平異常有關，與以往研究結(jié)果一致。干預后，阿司匹林組大鼠IL-10水平高于模型組，IL-6及TNF-α水平均低于模型組，提示阿司匹林的抗抑郁作用可能與抑制前炎性細胞因子(IL-6、TNF-α)的釋放及促進抗炎性細胞因子(IL-10)的釋放有關，與鐘家菊等[2,24]研究結(jié)果一致。

綜上所述，阿司匹林可改善抑郁模型大鼠的抑郁行為，其可能是通過調(diào)節(jié)細胞因子發(fā)揮抗抑郁作用，為探索非甾體類解熱鎮(zhèn)痛藥的抗抑郁作用提供了一定的實驗依據(jù)。本研究存在一定的局限性，首先，樣本量較小，今后的研究建議擴大樣本量以進一步驗證阿司匹林的抗抑郁效果；其次，未從蛋白質(zhì)組學和基因組學等方面進行更深入的研究。