程宇

[摘要]動(dòng)物行為是受中樞神經(jīng)系統(tǒng)控制的，因此能很好地反映動(dòng)物腦部的結(jié)構(gòu)功能。阿爾茨海默病（AlzheimersDisesse）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性病，起病隱襲，病程呈慢性進(jìn)行性，是老年期癡呆癥最常見，也是最平常的一種類型。臨床主要表現(xiàn)為記憶性障礙、認(rèn)知性功能障礙、人格改變及語言障礙等神經(jīng)精神癥狀，日常生活能力會(huì)有減退，并有神經(jīng)精神癥狀和行為障礙嚴(yán)重影響社交、職業(yè)與生活功能。因此，通過八臂迷宮、曠場(chǎng)等動(dòng)物認(rèn)知行為學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)芎芎玫胤从矨D研究藥物對(duì)AD模型動(dòng)物認(rèn)知和記憶功能的影響，從而了解AD研究藥物的治療效果。

[關(guān)鍵詞]AD；八臂迷宮；曠場(chǎng)；物體識(shí)別

隨著人口的老齡化，認(rèn)知障礙疾病如阿爾茲海默病己成為危害社會(huì)人群健康的重大疾病之一。流行病學(xué)研究顯示，AD的患病率隨年齡增高而增高，在65歲以上人群中約為5%，而在85歲以上人群中約為20%。我國(guó)目前患有AD的患者大約350～450萬，通過大樣本流行病學(xué)的相關(guān)性調(diào)查發(fā)現(xiàn)我國(guó)55歲以上AD的患病率分別為2.59%，65歲以上為4.8%。盡管AD發(fā)病的具體誘發(fā)機(jī)制仍不十分明確，但可以知道B淀粉樣蛋白及Tau蛋白異常修飾等在病理過程中起到關(guān)鍵作用，被廣泛公認(rèn)。但是由于國(guó)際上對(duì)AD病理靶點(diǎn)的研究還不夠深入，目前尚缺乏有效的指導(dǎo)思想和治療藥物，因此，尋找更準(zhǔn)確有效的指導(dǎo)思想，治療靶點(diǎn)和相關(guān)藥物，成為AD治療研究重中之重。

在利用動(dòng)物樣品（小白鼠）來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的阿爾茨海默病的病理病例研究中，主要側(cè)重反映各種記憶能力，例如空間記憶能力的結(jié)論測(cè)試，測(cè)試方法有八臂通道迷宮實(shí)驗(yàn)，新物體辨別實(shí)驗(yàn)等，目前關(guān)于阿爾茨海默病的動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)活動(dòng)相關(guān)研究還比較少，所以我們現(xiàn)在通過曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)對(duì)AD動(dòng)物模型的自主行為特點(diǎn)進(jìn)行了分析。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

嚙齒類動(dòng)物具有價(jià)格低廉、侍養(yǎng)簡(jiǎn)單、生存率高等特點(diǎn)，并且其與人類的腦部解剖結(jié)構(gòu)和生理特征較為相近和相似，更適于誘導(dǎo)模型測(cè)試的大量使用，成為AD最常用的動(dòng)物測(cè)試模型。因此實(shí)驗(yàn)室一般選用實(shí)驗(yàn)鼠等嚙齒類動(dòng)物。雄性SD大鼠44只，購(gòu)買于廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)所需體重嚴(yán)格控制在250～300g范圍內(nèi)。

1.2八臂迷宮

1.2.1實(shí)驗(yàn)原理

八臂迷宮實(shí)驗(yàn)，是目前國(guó)內(nèi)外最為常用，最具有參考價(jià)值的評(píng)價(jià)動(dòng)物學(xué)習(xí)記憶能力的模型，是由Olton等人建立。主要作用于檢測(cè)臨床藥物在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)，主要是大腦受損狀態(tài)下，工作記憶行為和參考記憶行為等方面的表現(xiàn)，它是由若干個(gè)完全一樣的臂組成的，這些臂從中央向四周圍放射出來，每個(gè)臂盡頭有水和食物提供，實(shí)驗(yàn)人員再根據(jù)分析動(dòng)物取食的策略等各種不同參數(shù)可以反映出樣品動(dòng)物的對(duì)應(yīng)記憶能力。迷宮操作簡(jiǎn)單、可行，現(xiàn)已被廣泛用于學(xué)習(xí)記憶認(rèn)知實(shí)驗(yàn)功能評(píng)價(jià)。

1.2.2實(shí)驗(yàn)步驟

（1）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來到應(yīng)首先適應(yīng)新環(huán)境，適應(yīng)新環(huán)境7-10天后，定期為其稱量體重，禁止進(jìn)食1-2天，每次訓(xùn)練完結(jié)后限制性地提供食料約（15-20g），以使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體重一直保持在正常進(jìn)食對(duì)照鼠的80%-85%的范圍。（2）第二天，工作人員在迷宮的每個(gè)臂端及中央?yún)^(qū)開始分撒食物顆粒（每只5～6粒）。同時(shí)將對(duì)應(yīng)數(shù)量的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物置于迷宮中央（打開通道門）。讓實(shí)驗(yàn)老鼠自由攝食、探究10min。（3）第三天，重復(fù)第二天的訓(xùn)練。目的是為了讓實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在沒有應(yīng)激條件下反復(fù)熟悉環(huán)境。（4）第四天起，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行單個(gè)訓(xùn)練：在每個(gè)臂靠近外端食盒處各放一顆食粒，讓動(dòng)物自由攝食，并記錄數(shù)據(jù)，食粒吃完或10min后將動(dòng)物取出。（5）第五天，將食物放在食盒內(nèi)，將實(shí)驗(yàn)鼠進(jìn)行重復(fù)訓(xùn)練，一天2次。（6）第六天以后，隨機(jī)選若干個(gè)（建議先取4個(gè)）臂，每個(gè)臂放一顆食粒；各臂門關(guān)閉，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物放在迷宮中；30s后，臂門打開，讓動(dòng)物在迷宮中自由活動(dòng)并自行攝取食粒，直到動(dòng)物吃完所有4個(gè)臂的食物。若果10min后，食粒仍未吃完，則實(shí)驗(yàn)終止。

每天需要來回進(jìn)行兩次訓(xùn)練，每次其間間隔約1h以上。白鼠進(jìn)入有食物的臂且攝取了食品為一次正確選擇，反之則為錯(cuò)誤選擇。連續(xù)訓(xùn)練5次，錯(cuò)誤選擇次數(shù)為1次或1次以下，同時(shí)WME必須為零的情況下，斷定訓(xùn)練成功。

1.2.3注意事項(xiàng)

本次試驗(yàn)在操作的過程中主要注意事項(xiàng)是禁止進(jìn)食，保持重量為原體重81.00%-86.00%，從實(shí)驗(yàn)的結(jié)果和相關(guān)數(shù)據(jù)顯示：實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的動(dòng)物無明顯差異性，排除因樣品饑餓程度不同與其他非學(xué)習(xí)因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成的影響。迷宮實(shí)驗(yàn)外的一切物品在實(shí)驗(yàn)過程中均始終保持不變，目的是使動(dòng)物進(jìn)行對(duì)照。

實(shí)驗(yàn)顯示，樣品大鼠在八臂迷宮內(nèi)，對(duì)于周圍光照、人或移動(dòng)物體以及迷宮內(nèi)有食物殘?jiān)凹S便的情況不了解等因素導(dǎo)致害怕，腎上腺素分泌過多對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有很大的影響，因此實(shí)驗(yàn)環(huán)境始終需要保持安靜，排除外界因素干擾。以上措施，保證了本次采用八臂迷宮訓(xùn)練小鼠實(shí)驗(yàn)的確實(shí)可信性。

1.3曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

1.3.1實(shí)驗(yàn)原理

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)原理是評(píng)價(jià)在新環(huán)境中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的自主行為、探究行為與緊張程度的一種測(cè)試方法。以實(shí)驗(yàn)動(dòng)物（白鼠）在新環(huán)境中的某些特殊行為的持續(xù)時(shí)間，出現(xiàn)頻率和出現(xiàn)次數(shù)等，反映實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在新環(huán)境中的研究行為，主要觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物尿便次數(shù)的反應(yīng)及其緊張程度。

1.3.2實(shí)驗(yàn)過程

實(shí)驗(yàn)過程，關(guān)鍵要求必須是日常參與實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)人員搬運(yùn)大鼠，實(shí)驗(yàn)員與設(shè)備保持適當(dāng)距離，實(shí)驗(yàn)員避免被實(shí)驗(yàn)大鼠看到。將動(dòng)物放入箱內(nèi)底面中心，同時(shí)進(jìn)行攝像和計(jì)時(shí)。觀察3～5min。取出大鼠后，用紙巾沾取75%乙醇徹底清除迷宮，等待液體揮發(fā)擴(kuò)散后，再進(jìn)行下一只大鼠的測(cè)試。避免前一實(shí)驗(yàn)結(jié)束后實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的殘留痕跡影響下一實(shí)驗(yàn)的測(cè)試結(jié)果。然后更換實(shí)驗(yàn)動(dòng)物再繼續(xù)該實(shí)驗(yàn)。

根據(jù)計(jì)算機(jī)軟件設(shè)計(jì)不同可觀察的參數(shù)不同，如某一肢體越過的格子數(shù)為水平得分，后肢站立次數(shù)為垂直得分，修飾次數(shù)，尿便次數(shù)；運(yùn)動(dòng)速度，沿邊運(yùn)動(dòng)距離，中央運(yùn)動(dòng)距離等。所用的計(jì)算機(jī)失蹤分析系統(tǒng)與新物體識(shí)別相同，曠場(chǎng)底部被分成面積相等的9塊正方形格子。將實(shí)驗(yàn)鼠放置在中央格，曠場(chǎng)上方的攝像機(jī)開啟并記錄該動(dòng)物在一段時(shí)間內(nèi)的活動(dòng)情況，通過軟件分析系統(tǒng)分析實(shí)驗(yàn)鼠在一定時(shí)間內(nèi)的活動(dòng)狀態(tài)，約10min。

主要觀察目標(biāo)：①其在方格間穿行的次數(shù)②直立次數(shù)③實(shí)驗(yàn)鼠在中央格停留時(shí)間④實(shí)驗(yàn)鼠穿過中央格次數(shù)等。

研究認(rèn)為，實(shí)驗(yàn)鼠經(jīng)過格子的次數(shù)可代表動(dòng)物的興奮程度；實(shí)驗(yàn)鼠站立的次數(shù)可以代表動(dòng)物對(duì)陌生環(huán)境的好奇心及適應(yīng)能力。數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05，被認(rèn)為是有統(tǒng)計(jì)學(xué)相對(duì)差異。

一般情況下，實(shí)驗(yàn)鼠喜暗，因此其在曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常在邊緣區(qū)域活動(dòng)，但對(duì)照鼠沒有目標(biāo)地在曠場(chǎng)中奔跑，由于其在中央?yún)^(qū)出現(xiàn)的次數(shù)明顯多于正常大鼠，直立次數(shù)、活動(dòng)總數(shù)以及在中央?yún)^(qū)出現(xiàn)的比率等幾項(xiàng)指標(biāo)反映大鼠的自主活動(dòng)，并和AD大鼠病情嚴(yán)重程度有相關(guān)性。因此在一定程度上可以反映相對(duì)人類患者也會(huì)表現(xiàn)出煩躁不安，肢體強(qiáng)直等次能夠?yàn)榘l(fā)病特征。實(shí)驗(yàn)證明，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)?zāi)軌驒z測(cè)動(dòng)物模型的自主行為變化，可以用做更廣泛的藥物研發(fā)實(shí)驗(yàn)。尤其是隨著現(xiàn)代教育技術(shù)發(fā)達(dá)，再加上計(jì)算機(jī)技術(shù)和圖像處理技術(shù)攝影技術(shù)等的引入，使動(dòng)物行為分析的檢測(cè)指標(biāo)和工具大大增加，顯現(xiàn)出該實(shí)驗(yàn)的高效、無創(chuàng)、靈敏、客觀等優(yōu)點(diǎn)。

2總結(jié)

目前，世界各國(guó)包括我國(guó)，隨著人口老齡化進(jìn)程的到來，和年齡相關(guān)的認(rèn)知性功能障礙已經(jīng)成為目前醫(yī)藥行業(yè)神經(jīng)科學(xué)研究的熱門話題。為了能使人們更好地了解認(rèn)知性功能相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理，選擇合適的方法很重要，例如動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)研究方法（如曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)）對(duì)于目前的行業(yè)來說是有必要的。各種動(dòng)物模型的出現(xiàn)，使得認(rèn)知功能評(píng)估可以為研究AD提供重要的依據(jù)。其局限性為，人類和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物存在種群差異和個(gè)體差異，人類的認(rèn)知功能區(qū)別于動(dòng)物，是一個(gè)高級(jí)復(fù)雜的腦部神經(jīng)活動(dòng)過程，而動(dòng)物的行為學(xué)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容也有別于人類的認(rèn)知，人類的許多認(rèn)知功能是人類獨(dú)有的而不能在實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭斜憩F(xiàn)出來的。在實(shí)驗(yàn)過程中，因個(gè)體以及種群差異，僅僅通過動(dòng)物的表現(xiàn)而不參考人類的實(shí)際表現(xiàn)是無法精確評(píng)估學(xué)習(xí)和記憶的完整信息的，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物可能受認(rèn)知能力等不相關(guān)的因素干擾。而每種行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法的使用條件與側(cè)重點(diǎn)都不一樣，應(yīng)用時(shí)要根據(jù)不同樣品的不同需要進(jìn)行適當(dāng)選擇。必要時(shí)也可結(jié)合多種動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)方法來進(jìn)行不定期綜合統(tǒng)計(jì)分析，與影像學(xué)、現(xiàn)代教育學(xué)，組織病理學(xué)，組織藥理學(xué)及神經(jīng)電生理技術(shù)等結(jié)合，為阿爾茲海默病的研究提供科學(xué)可靠的依據(jù)。