郭開發(fā),趙思峰,吳彩蘭,艾尼古麗·依明

(新疆綠洲農(nóng)業(yè)病蟲害治理與植保資源利用自治區(qū)高校重點實驗室/石河子大學農(nóng)學院,新疆 石河子 832003)

農(nóng)田防護林是由樹木組成的具有多種功能的人工廊帶網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng),對改善農(nóng)田小氣候,減輕和防御各種自然災害,保證農(nóng)業(yè)穩(wěn)產(chǎn)、高產(chǎn)作用明顯。在西北干旱地區(qū),改善林帶小氣候,是農(nóng)田防護林的主要作用,其次在防風固沙、增加生物多樣性、凈化空氣、碳匯和保障作物穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)等方面起到重要作用[1-2]。新疆南疆主要造林樹種有新疆楊Populusalbacv.pyramidalis、箭桿楊P.nigracv.Afghanica、柳樹Salixmatsudana、榆樹Ulmuspumila、胡楊Populuseuphratica等,這些樹種具有生長快、耐干旱、耐寒冷、防護效益高等優(yōu)點。但因缺水干旱、單一種植、經(jīng)營管理粗放、防治措施不當?shù)?新疆農(nóng)田防護林腐爛病危害嚴重,防護林的可持續(xù)效益和生態(tài)環(huán)境屏障功能受到嚴重制約。克熱曼 等[3]對克拉瑪依市林木病害進行了調(diào)查,結(jié)果表明楊樹Populusspp.、榆樹 、柳樹、白蠟Fraxinuschinensis、沙棗Elaeagnusangustifolia、衛(wèi)矛Euonymusalatus等林木均有腐爛病的發(fā)生,其中楊樹腐爛病發(fā)生程度最為嚴重。作者2012—2015年采集南疆農(nóng)田防護林主要樹種腐爛病樣品 ,采用形態(tài)學特征結(jié)合分子生物學技術(shù),對南疆農(nóng)田防護林主要樹種腐爛病的病原菌進行了鑒定,以期為今后有效防治該病提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 感病樣本采集 從新疆楊、箭桿楊、胡楊、柳樹4種主要樹種上采集腐爛病樣本52份(表1)。所采集的枝條樣品均表面有黑色的分生孢子器,分生孢子器上產(chǎn)生卷須狀黃色或粉紅色分生孢子角。

1.2 病原菌分離與致病性測定

1.2.1 分離與純化 病原菌采用常規(guī)組織分離法分離[4]。先在 PDA 培養(yǎng)基上進行分離,待分離物長出后,在WA培養(yǎng)基上進行單孢純化,獲得的菌株保存在試管PDA 斜面上,置于4 ℃ 冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 致病性測定 采用離體枝條接種法[5]進行致病性測定。選擇 1 a生健康林木新鮮枝條,截成約20 cm長小段,先用自來水沖洗后,再用 0.1% HgCl2浸泡 1 min,然后用無菌水沖洗、晾干,枝條兩端用保鮮膜將保濕脫脂棉包裹。用鐵釘釘帽 (直徑 7 mm)加熱后燙傷枝條樹皮,以菌絲塊 (直徑7 mm) 接種在燙傷部位,用保鮮膜將其包裹。每個分離物接種 5 段枝條,每段枝條接種 2 處,以無菌 PDA 餅作為空白對照。接種枝條放置于白瓷盤,在28 ℃光照培養(yǎng)箱中發(fā)育,接種 7 d 后觀察、記錄枝條發(fā)病情況,并對發(fā)病枝條進行再分離。

1.3 病原菌鑒定

1.3.1 形態(tài)學鑒定 將供試菌株接種在離體林木枝條上,待其產(chǎn)生分生孢子器后,用雙面刀片切片,制成玻片后在生物顯微鏡下觀察縱、橫切面形態(tài)特征,并測量分生孢子大小,記錄并拍照[6-7]。

1.3.2 分子生物學鑒定 依據(jù)形態(tài)學鑒定結(jié)果,挑選部分代表菌株在 PDA 平板上培養(yǎng) 5 d后,采用Lee等[8]的方法提取菌絲基因組DNA。借鑒Peever 等[9]的方法,用通用引物ITS1和ITS4擴增代表菌株的ITS和5.8S rDNA,用引物Beta-2a和Beta-2b擴增代表菌株的β-tubulin 基因。PCR反應(yīng)體系:PCR TaqMix 12.5 μL、10 μmol/L ITS1/ Beta-2a 1 μL、10 μmol/L ITS4/ Beta-2b 1 μL、基因組 DNA 0.5 μL、ddH2O 10 μL至終體積為 25 μL。ITS 序列 PCR 擴增反應(yīng)程序為94 ℃ 預變性 4 min,然后94 ℃變性 30 s,55 ℃退火 30 s,72 ℃延伸 40 s,共30個循環(huán),最后72 ℃延伸 10 min;β-tubulin基因 PCR 擴增反應(yīng)程序:94 ℃預變性 4 min,然后 94 ℃變性 30 s,58 ℃退火 30 s,72 ℃延伸 40 s,共 30 個循環(huán),最后 72 ℃ 延伸 10 min。反應(yīng)完成后,1 % 瓊脂糖凝膠電泳檢測 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物。

將不同引物PCR 反應(yīng)產(chǎn)物進一步純化后,送至北京六合華大基因科技股份有限公司進行基因測序。測序后的序列經(jīng)校正后,在GenBank 中進行同源序列搜索( BLAST搜索),比較測試菌株同現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫中相應(yīng)序列的同源程度。用 MEGA 5 軟件進行比對并構(gòu)建系統(tǒng)樹,應(yīng)用自展(bootstrap)檢驗系統(tǒng)樹,自展數(shù)據(jù)集為1 000次。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌致病性 人工離體接種1～2 a生新鮮林木枝條后,各分離菌株均可導致林木枝條發(fā)病。接種 7 d 后接種部位出現(xiàn)褐色、水浸狀病斑。隨后病斑沿接種部位擴展呈圓形。離體枝條病斑部位表皮皺縮,病健交界明顯(圖1)。接種 20 d 后,病斑表皮皺縮,且產(chǎn)生大量黑色小點,室溫條件下溢出黃色分生孢子角,對發(fā)病組織進行再分離,均可獲得相應(yīng)的接種菌株。對照枝條上未出現(xiàn)癥狀。

圖1 腐爛病菌致病性測定結(jié)果

2.2 病原菌鑒定

2.2.1 形態(tài)學鑒定 從新疆南疆農(nóng)田防護林腐爛病樣品中共分離獲得了52個菌株。其中新疆楊分離得到6株,箭桿楊17株,胡楊12株,柳樹17株。鑒定出3種病原菌,分別是金黃殼囊孢Cytosporachrysosperma(有性型:Valsasordida),Cytosphoranivea(有性型:Leucostomaniveum)和Cryptosphaeriapullmanensis,由于腐爛病病原菌在新疆主要以無性世代存在,得到的52個菌株均為無性型(表1)。

表1 新疆南疆農(nóng)田防護林主要樹種腐爛病病原菌分離結(jié)果

2.2.2 分子生物學鑒定 用真菌通用引物ITS1/ITS4在供試菌株中均可以擴增到550 bp 大小的片段,將PCR擴增得到的ITS序列測序,在GenBank 中比對發(fā)現(xiàn)菌株的ITS序列分別和V.sordida,L.niveum和Cryptosphaeriapullmanensis的相似度最高。選擇代表性的11個菌株與11個從GenBank下載的序列(3個V.sordida序列、2個L.niveum序列、2個V.mali序列、2個Cryptosphaeriapullmanensis序列、1個Cryptosphaerialigniota序列和外群Alternariasp.序列)共22個序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。其中7個菌株和V.sordida聚為一枝,自展支持率達到93%;2個菌株和L.niveum聚在一枝,2個菌株和Cryptosphaeriapullmanensis在同一個分支,自展支持率均達到93%以上(圖2)。

用真菌引物Beta-2a/Beta-2b在供試菌株中均可以擴增到500 bp 大小的片段,將PCR擴增得到的ITS序列測序,在GenBank 中比對發(fā)現(xiàn)菌株的β-tubulin序列分別和V.sordida,L.niveum和Cryptosphaeriapullmanensis的相似度最高。選擇代表性的11個菌株與11個從GenBank下載的序列(3個V.sordida序列、2個L.niveum序列、2個V.mali序列、2個Cryptosphaeriapullmanensis序列、1個Cryptosphhaeriamulticontinentalis序列和外群Alternariasp.序列)共22個序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。其中7個菌株和V.sordida聚為一枝,自展支持率達到96%;2個菌株和L.niveum聚在一枝,2個菌株和Cryptosphaeriapullmanensis在同一個分支(圖3)。

圖2 基于ITS序列構(gòu)建的腐爛病菌及該屬其它真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹

3 結(jié)論與討論

對新疆南疆農(nóng)田防護林主要樹種腐爛病樣品進行了病原菌分離,采用形態(tài)學和分子生物學技術(shù)對分離菌株進行種類鑒定和致病性測定,結(jié)果表明引起新疆南疆農(nóng)田防護林主要樹種腐爛病的病原菌有金黃殼囊孢C.chrysosperma,C.nivea和Cryptosphaeriapullmanensis,其中C.chrysosperma是主要種。Cryptosphaeriapullmanensis在國內(nèi)鮮有報道,在胡楊上屬首次發(fā)現(xiàn)。

國內(nèi)外對防護林的研究主要集中在其所產(chǎn)生的生態(tài)效益、經(jīng)濟效益和社會效益[10]。防護林的生態(tài)效益研究主要集中在防護林的農(nóng)田小氣候效應(yīng)及其對土壤結(jié)構(gòu)、養(yǎng)分的改良作用[11],而目前對防護林病害的報道較少,因此加強新疆農(nóng)田防護林病害的研究并以此為依據(jù)開展病害防治是維護新疆農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)平衡的新任務(wù)。

殼囊孢屬Cytospora真菌是引起樹木腐爛病的重要病原,其有性型是黑腐皮殼屬Valsa。危害新疆農(nóng)田防護林的腐爛病病原菌均為無性型,未發(fā)現(xiàn)有性型。新疆農(nóng)田防護林主要樹種是楊柳科林木,而引起楊柳科林木腐爛病的病原物主要有Cytosporaatrocirrhata[12],Cytosporachrysosperma[13],C.germanica[14],C.kantschavelii[15],C.tritici[16]。在我國西北、華北及東北地區(qū),Valsasordida被認為是引起楊樹腐爛病的主要病原菌,主要危害楊樹、柳樹、桉樹、榆樹等樹種[17-18]。楊明秀[19]從各地楊樹、柳樹、核桃等多種寄主均可分離得到C.chrysosperma,且致病性與寄主有關(guān),即在楊樹上分離的病原菌對楊樹的致病性強于非楊樹寄主,但與地理位置無明顯關(guān)系。

腐爛病已成為新疆林木主要病害之一。在新疆南疆地區(qū)果園腐爛病發(fā)生嚴重,受害嚴重果園發(fā)病率達 70 %～90 %,可導致整園衰亡,腐爛病已對新疆林果生產(chǎn)和發(fā)展造成嚴重威脅[20]。在阿勒泰地區(qū),腐爛病危害人工種植的北京楊、俄羅斯楊、新疆楊、速生楊等楊屬樹種,發(fā)病率可達 90%以上[21]。本研究明確了新疆南疆農(nóng)田防護林腐爛病的病原菌種類,將為農(nóng)田防護林腐爛病的防治提供一定指導。

圖3 基于Beta-Tubulin序列構(gòu)建的腐爛病菌及該屬其它真菌的系統(tǒng)發(fā)育樹