廖旺姣,黃乃秀,鄒東霞,覃世杰,蔣曉萍

(1.廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院,廣西特色經(jīng)濟(jì)林培育與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣西 南寧 530002; 2.廣西國有六萬林場,廣西 玉林 537000)

八角Illiciumverum是我國南方歷史悠久的珍貴經(jīng)濟(jì)林樹種之一,主要分布在廣西、云南等少數(shù)幾個(gè)省區(qū)。據(jù)統(tǒng)計(jì),目前廣西栽培面積約26萬hm2,產(chǎn)量和面積均占全國90%以上。炭疽病是危害八角的重要病害,2003年吳耀軍 等[1]報(bào)道八角炭疽病病原為球炭疽菌Colletotrichumcoccodes(Wall) Hughes,黃思良 等[2]對球炭疽菌生物學(xué)特性進(jìn)行了研究,為黃乃秀 等[3]和廖明 等[4]對球炭疽菌進(jìn)行室內(nèi)毒力測定及防治八角炭疽病提供有效參考依據(jù)。2015—2016年,炭疽病在廣西各八角產(chǎn)區(qū)嚴(yán)重發(fā)生,對八角炭疽病病原重新進(jìn)行分離鑒定,發(fā)現(xiàn)了一種新的致病菌即哈銳炭疽菌ColletotrichumhoriiWeir & Johnst[5],其生物學(xué)特性尚未見報(bào)道,為明確八角炭疽病發(fā)病規(guī)律,有效監(jiān)測病害,及時(shí)提出防控措施,作者對哈銳炭疽菌生物學(xué)特性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 供試菌株 由廣西壯族自治區(qū)林業(yè)科學(xué)研究院森林保護(hù)研究所從玉林市采集的八角炭疽病病斑中分離鑒定獲得。測試前,活化保存的菌株,挑取菌絲移至PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng),6 d 后供測試用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溫度對菌絲生長及產(chǎn)孢的影響 將直徑6 mm的菌塊植入PDA平皿中央,分別置于10～40 ℃梯度為5 ℃的7個(gè)溫度,每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)6 d后用十字交叉法測量菌落直徑,取其平均值,15 d后在顯微鏡下用血球計(jì)數(shù)板測定產(chǎn)孢量[6]。每處理3皿,重復(fù)3次。

1.2.2 濕度對分生孢子萌發(fā)的影響 參考黃思良 等[3]的方法,用滅菌水配制孢子懸浮液,濃度為400倍鏡下每視野15～20 個(gè)孢子。將孢子液涂于載玻片上,陰干后分別置50%，75%，85%，90%，100%，100%+水滴6種不同濕度的小容器中,各處理重復(fù)3次，適溫下保濕24 h后鏡檢其孢子萌發(fā)數(shù)。

1.2.3 不同碳、氮源對菌絲生長及產(chǎn)孢的影響 基礎(chǔ)培養(yǎng)基:硝酸鈉2.00 g、磷酸氫二鉀1.00 g、氯化鉀0.50 g、七水合硫酸鎂0.50 g、硫酸鐵0.01 g、蔗糖30.00 g、瓊脂粉20.00 g、水1 000 mL[6],用等質(zhì)量的葡萄糖等10種碳源取代蔗糖,組配成含不同碳源的培養(yǎng)基;用等質(zhì)量的硝酸銨等10種氮源取代硝酸鈉,組配成含不同氮源的培養(yǎng)基。挑取直徑為6 mm的菌絲塊接種到上述不同碳、氮源培養(yǎng)基平板中央,每處理3次重復(fù),置于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng),菌落直徑和產(chǎn)孢量測定方法同1.2.1。

1.2.4 光照對菌絲生長及產(chǎn)孢的影響 在PDA平板上移入直徑6 mm的菌餅,分別置于連續(xù)光照(8 W,燈與培養(yǎng)皿的距離為 30 cm )、完全黑暗、12 h光暗交替3種光照條件下,25 ℃恒溫培養(yǎng),菌落直徑和產(chǎn)孢量測量方法同1.2.1。

1.3 數(shù)據(jù)分析 采用DPS v13.01軟件[7]統(tǒng)計(jì)分析,采用Duncan氏新復(fù)極差法差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對菌絲生長及產(chǎn)孢的影響 哈銳炭疽菌在10～35 ℃均能生長,40 ℃菌絲停止生長,適宜菌絲生長溫度25～35 ℃,最適生長溫度為30 ℃。10～30 ℃,隨溫度升高,菌絲生長速率加快,30～40 ℃,菌絲生長速率逐漸下降，尤其溫度超過35 ℃,菌絲生長速率急劇下降。該菌產(chǎn)生分生孢子溫度是10～35 ℃,最適產(chǎn)孢溫度為30 ℃,產(chǎn)孢量為3.33 ×106個(gè)/mL,其次是25 ℃,產(chǎn)孢量為2.17×106個(gè)/mL(圖1)。

2.2 濕度對分生孢子萌發(fā)的影響 哈銳炭疽菌分生孢子萌發(fā)率隨相對濕度降低而降低,各相對濕度分生孢子萌發(fā)差異顯著。病菌在水滴中萌發(fā)率最高,達(dá)94.83%,其次是飽和濕度,萌發(fā)率為63.17%,相對濕度為50%時(shí),分生孢子不萌發(fā)(表1)。

圖1 不同溫度對菌絲生長和產(chǎn)孢的影響

相對濕度孢子萌發(fā)率相對濕度孢子萌發(fā)率100+水滴94.83 ± 1.70 a8523.00 ± 1.41 d10063.17 ± 1.92 b7514.33 ± 0.95 e9035.67 ± 1.56 c500.00 ± 0.00 f

注:經(jīng)Duncan氏新復(fù)極差方法檢驗(yàn),同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母表示組間差異不顯著(P>0.05)。

2.3 不同碳源對哈菌絲生長及產(chǎn)孢的影響 哈銳炭疽菌在供試的10種碳源培養(yǎng)基上均能生長,菌落生長狀況不一。在葡萄糖、D-木糖和蔗糖培養(yǎng)基上生長最好,25 ℃培養(yǎng)6 d的菌落直徑分別為76.18，74.18和73.72 mm,說明病菌對這3種碳源利用效果最好；其次是D-果糖和甘露醇;對可溶性淀粉和阿拉伯樹膠粉等利用效果最差,菌落直徑分別為60.06，60.46 mm,但能促進(jìn)產(chǎn)孢,產(chǎn)孢量分別為9.17×106，5.33×106個(gè)/mL,蔗糖也能促進(jìn)哈銳炭疽菌產(chǎn)生分生孢子,產(chǎn)孢量達(dá)5.50×106個(gè)/mL,與其它碳源處理差異顯著(圖2)。

注:經(jīng)Duncan氏新復(fù)極差方法檢驗(yàn),同類圖柱上不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母表示組間差異不顯著(P>0.05)。

圖2不同碳源對菌生長及產(chǎn)孢的影響

2.4 不同氮源對菌絲生長及產(chǎn)孢的影響 哈銳炭疽菌可利用多種氮源,對有機(jī)氮牛肉膏利用效果最好,25 ℃培養(yǎng)6 d的菌落直徑為82.28 mm,其次是酵母粉菌落直徑為79.95 mm,對硫酸銨的利用效果最差,菌落直徑為22.50 mm,但產(chǎn)孢量卻最高,達(dá)5.67×106個(gè)/mL,與其它氮源處理差異顯著(圖3)。

注:經(jīng)Duncan氏新復(fù)極差方法檢驗(yàn)，同類圖柱上不同小寫字母表示組間差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母表示組間差異不顯著(P>0.05)。

圖3不同氮源對菌生長及產(chǎn)孢的影響

2.5 光照對菌絲生長及產(chǎn)孢的影響 哈銳炭疽菌連續(xù)光照菌落直徑最大,為74.21 mm,其次是12 h光暗交替處理,菌落直徑為73.89 mm,完全黑暗處理菌落直徑最小,為69.62 mm,光照(連續(xù)光照和12 h光暗交替)處理與黑暗處理差異顯著;3種處理產(chǎn)孢量大小與菌落直徑相反,連續(xù)光照處理產(chǎn)孢量0.67×106個(gè)/mL,其次是12 h光暗交替處理,產(chǎn)孢量1.17×106個(gè)/mL,完全黑暗處理產(chǎn)孢量1.50×106個(gè)/mL,各處理差異顯著。說明光照有利于菌絲生長,黑暗則有利于產(chǎn)孢。

3 結(jié)論與討論

哈銳炭疽菌菌絲生長和產(chǎn)孢溫度是10～35 ℃,最適溫度均為30 ℃,說明該菌是一種高溫適生菌;分生孢子隨相對濕度增大,萌發(fā)率隨之增高,在水滴中萌發(fā)率最高,為94.83 %。高溫高濕有利于該病害發(fā)生和蔓延,這與廣西八角炭疽病發(fā)病高峰期為6—8月相吻合[3]。哈銳炭疽菌可利用多種碳氮源,對葡萄糖、D-木糖和蔗糖利用最好；可溶性淀粉和阿拉伯樹膠粉利用最差,但產(chǎn)孢量卻最高；對牛肉膏利用最好,產(chǎn)孢量最低；對硫酸銨利用效果最差,產(chǎn)孢量最大;不同碳、氮源培養(yǎng)基上哈銳炭疽菌絲生長速度快慢的變化,極有可能是由于不同培養(yǎng)基成分刺激哈銳炭疽菌中某些基因的表達(dá)所致[8]。3種光照處理結(jié)果顯示:連續(xù)光照菌落直徑最大,其次是12 h光暗交替處理,完全黑暗處理菌落直徑最小;分生孢子產(chǎn)孢量與之相反。這與邢來君 等[9]報(bào)道的光照可影響真菌的生長速度的結(jié)論相符。