騫 宇,雷愛玲,劉曉敬,易若琨,趙 欣

(重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院,重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心,重慶市功能性食品工程技術(shù)研究中心,功能性食品研發(fā)重慶市工程實(shí)驗(yàn)室,重慶 400067)

牦牛酸乳是我國青藏高原地區(qū)少數(shù)民族牧民經(jīng)常食用的一種自然發(fā)酵乳制品,其含有各類營養(yǎng)成分,具有多種生物活性作用,是一種優(yōu)質(zhì)的天然食品[1]。牦牛酸乳的品質(zhì)受到原料和發(fā)酵環(huán)境的影響,特別是不同環(huán)境下發(fā)酵微生物的差異對品質(zhì)產(chǎn)生較大影響,因此不同地區(qū)牦牛酸乳的抗氧化能力、調(diào)節(jié)免疫力作用均有一定差異[1-2]。牦牛酸乳由于特殊的發(fā)酵環(huán)境和特殊的發(fā)酵工藝,其微生物組成與一般乳酸有較大差異[3],牦牛酸乳中含有大量乳酸菌,對其進(jìn)行深入的分離鑒定可分離出具有益生菌潛質(zhì)的優(yōu)質(zhì)乳酸菌[4-5]。

潰瘍性結(jié)腸炎(UC)是一種發(fā)病率較高的炎癥性腸病,通過動(dòng)物模型研究食品對潰瘍性結(jié)腸炎的作用效果和機(jī)制是常用的方法[6]。其中葡聚糖硫酸鈉(DSS)造?？梢孕纬深愃婆R床的潰瘍性結(jié)腸炎表現(xiàn),是最為理想的潰瘍性結(jié)腸炎模型[7]。腸道出現(xiàn)UC損傷后,乳酸菌在腸道中發(fā)揮其抗氧化作用,清除腸道內(nèi)的自由基能夠緩解UC[8]。腸道逐漸出現(xiàn)炎癥狀態(tài)時(shí)腸黏膜通透性將發(fā)生變化,炎癥加劇時(shí),腸黏膜通透性也將大幅度提高[9-10]。研究顯示植物乳桿菌BLP可通過改善腸黏膜通透性緩解DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎[11]。臨床研究也報(bào)道乳酸菌在UC藥物治療期間能夠有明顯的協(xié)助作用,可以有效地加強(qiáng)治療效果[12]。乳酸菌通過多種途徑對UC起到緩解作用,但是對其機(jī)制的研究還缺乏深入研究。同時(shí),本研究團(tuán)隊(duì)從牦牛酸乳中分離鑒定出了新的乳酸菌菌種,其作用機(jī)制也有待進(jìn)一步研究。

本研究以從青海玉樹藏族自治州的自然發(fā)酵牦牛酸乳中分離鑒定的乳酸菌LactobacillusplantarumYS-2(LP-YS2)為研究對象,觀察LP-YS2對DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的抑制作用。利用包括分子生物學(xué)方法,特別是觀察結(jié)腸相關(guān)基因表達(dá)的變化,檢測LP-YS2對結(jié)腸炎實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的影響,驗(yàn)證LP-YS2對DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎的抑制效果,為深入利用LP-YS2積累理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

七周齡雄性C57BL/6J小鼠 購自于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號:SYXK(渝)2012-0001);LactobacillusplantarumYS-2 由本研究組分離自青海玉樹自然發(fā)酵牦牛酸乳中,保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(保藏號:CCTCC M 2016748);MRS肉湯培養(yǎng)基 北京索萊寶科技有限公司;柳氮磺胺吡啶、葡聚糖硫酸鈉(DSS,分子量40 kDa) 美國Sigma公司;內(nèi)皮素(ET)、生長抑素(SS)、P物質(zhì)(SP)、血管活性腸肽(VIP)測定試劑盒 北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司;IL-2、IL-10血清細(xì)胞因子測定試劑盒 美國BioLegend公司;髓過氧化物酶(MPO)、谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;SYBR Green PCR Master Mix 美國賽默飛公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR引物 北京天根生化科技有限公司;其余試劑 均為國產(chǎn)分析純；MRS液體培養(yǎng)基 48 g MRS肉湯培養(yǎng)基加熱溶解于1 L蒸餾水中,121 ℃高壓滅菌 15 min。

Biomate3S紫外可見光分光光度儀、A200PCR儀、LUX多功能性酶標(biāo)儀、Stepone plus熒光定量PCR儀 美國Thermo Fisher Scientific公司;ICEN-24R高速冷凍離心機(jī) 杭州奧盛儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)菌種準(zhǔn)備 接種LactobacillusplantarumYS-2菌種在MRS液體培養(yǎng)基(48 g MRS肉湯培養(yǎng)基加熱溶解于1L蒸餾水中,121 ℃高壓滅菌 15 min)中36 ℃培養(yǎng)24 h,然后離心分離(3000 r/min,10 min),棄去上層培養(yǎng)基,加入生理鹽水與下層乳酸菌混勻,調(diào)節(jié)濃度至1×108CFU/mL和1×109CFU/mL,以備動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行灌胃。

1.2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 小鼠飼養(yǎng)于室溫(25±2) ℃、相對濕度(50%±5%)的環(huán)境中,同時(shí)保持飼養(yǎng)環(huán)境每12 h調(diào)節(jié)光/暗。適應(yīng)飼養(yǎng)一周后選擇50只體重(25±2) g的C57BL/6J小鼠,將小鼠分為5組,分別為正常組、模型組、LP-YS2-L組(低濃度LP-YS2灌胃組)、LP-YS2-H組(高濃度LP-YS2灌胃組)和柳氮磺胺吡啶組(陽性對照組)。實(shí)驗(yàn)周期5周,實(shí)驗(yàn)過程中,正常組小鼠給予自由攝入飲水和飲食,同時(shí)每日灌胃0.2 mL生理鹽水;除正常組小鼠外,其余各組小鼠在第3周和第5周分別給予2%和4%(w/v)的DSS水溶液,其余時(shí)間給予自由攝入飲水和飲食;LP-YS2-L和LP-YS2-H組小鼠除給予自由攝入飲水和飲食外每日灌胃0.2 mL的1×108CFU/mL和1×109CFU/mL的LP-YS2;柳氮磺胺吡啶組小鼠除給予自由攝入飲水和飲食外每日按濃度20 mg/kg bw灌胃柳氮磺胺吡啶[13]。5周后實(shí)驗(yàn)結(jié)束后采用斷頸法處死小鼠,然后測定小鼠結(jié)腸的質(zhì)量和長度,同時(shí)取血和結(jié)腸組織待用。

1.2.3 小鼠血清ET-1、SS、SP和VIP水平測定 取小鼠血漿后在4500 r/min條件下離心分離15 min分離得到血清,然后按試劑盒方法測定血清和結(jié)腸組織中ET-1、SS、SP和VIP的水平[14]。

1.2.4 小鼠血清中IL-2和IL-10細(xì)胞因子水平的測定 按1.2.3方法對小鼠結(jié)腸血漿進(jìn)行處理得到血清,然后按試劑盒方法測定小鼠血清中的IL-2和IL-10細(xì)胞因子水平[14]。

1.2.5 小鼠結(jié)腸組織中MPO、SOD含量和GSH、MDA活力的測定 結(jié)腸組織與生理鹽水按照質(zhì)量比1∶9混合后用超聲粉碎將結(jié)腸組織進(jìn)行勻漿處理,然后按試劑盒方法測定結(jié)腸組織中MPO、SOD的活力和GSH、MDA含量[14]。

1.2.6 qPCR實(shí)驗(yàn)測定小鼠結(jié)腸組織mRNA表達(dá) 將小鼠結(jié)腸組織打碎,然后用RNAzol提取結(jié)腸組織的總RNA,并將提取到的總RNA濃度稀釋到1 μg/μL。取5 μL稀釋后的總RNA提取液,按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒方法進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA模板。取2 μL的cDNA模板,和10 μL的SYBR Green PCR Master Mix、上下游引物(表1)各1 μL進(jìn)行混合,在反應(yīng)條件95 ℃,60 s后再進(jìn)行40個(gè)循環(huán):95 ℃,15 s;55 ℃,30 s;72 ℃,35 s;然后95 ℃,30 s;55 ℃,35 s進(jìn)行檢測,并以GAPDH為內(nèi)參,根據(jù)公式2-ΔΔCt=ΔCt(檢測基因)-ΔCt(GAPDH)計(jì)算基因的相對表達(dá)量[15]。

表1 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)引物序列

1.3 數(shù)據(jù)分析

將3次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值,然后使用統(tǒng)計(jì)軟件SAS9.1利用one-way ANOVA方法對各組實(shí)驗(yàn)結(jié)果在p<0.05 水平上是否具有顯著差異進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 LP-YS2對結(jié)腸的作用

DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎后小鼠出現(xiàn)便血及體重下降,同時(shí)解剖后觀察到小鼠結(jié)腸長度變短及出現(xiàn)腫大,判斷為造模成功[16]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型組小鼠的結(jié)腸長度最短,正常組小鼠最長;同時(shí)模型組小鼠的結(jié)腸質(zhì)量/結(jié)腸長度也最低,正常組小鼠最高(表2)。研究證實(shí)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠其結(jié)腸質(zhì)量和結(jié)腸長度與正常小鼠均出現(xiàn)差異,總結(jié)之前的研究,可用結(jié)腸質(zhì)量/結(jié)腸長度的比值作為實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎程度的重要評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出,LP-YS2-H可以顯著(p<0.05)緩解DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎造成的結(jié)腸長度和結(jié)腸質(zhì)量/結(jié)腸長度比值降低,且效果與20 mg/kg bw灌胃量的藥物柳氮磺胺吡啶接近,同時(shí)效果顯著優(yōu)于LP-YS2-L(p<0.05)。

表2 各組小鼠的結(jié)腸長度和結(jié)腸重量/結(jié)腸長度比值

2.2 LP-YS2對小鼠血清ET-1、SS、SP和VIP水平的作用

由表3可以看出正常組小鼠血清中的SS和VIP水平均高于其余各組,而ET水平則低于其余各組;模型組小鼠則顯示出相反的情況,其小鼠血清中ET和SP水平最高,而SS和VIP水平最低。相對于模型組,LP-YS2可以顯著(p<0.05)提高結(jié)腸炎小鼠血清中的SS和VIP水平和顯著降低ET和SP水平,且高濃度LP-YS2(LP-YS2-H)的效果更好,接近于藥物陽性對照柳氮磺胺吡啶組。研究表明內(nèi)皮素的血管收縮作用可以引起結(jié)腸黏膜的糜爛,甚至潰瘍,能加劇結(jié)腸炎[17-18]。SS能夠通過抑制胃酸等胃腸液的分泌減輕胃腸炎癥,SS的減少將加劇胃腸液的分泌,加重結(jié)腸炎[19]。P物質(zhì)是細(xì)神經(jīng)纖維內(nèi)的一種神經(jīng)肽,能夠調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)與免疫系統(tǒng),P物質(zhì)的大量積累可加劇結(jié)腸炎的程度[18]。同時(shí)過量的P物質(zhì)可誘發(fā)結(jié)腸炎,拮抗動(dòng)物體內(nèi)P物質(zhì)后能緩解結(jié)腸炎[20]。VIP能夠抑制機(jī)體內(nèi)iNOS的轉(zhuǎn)錄,避免結(jié)腸組織中過量的iNOS轉(zhuǎn)化成NO,從而導(dǎo)致腸黏膜的損傷;也能夠控制結(jié)腸炎對免疫系統(tǒng)紊亂[19-21]。通過抑制ET、SP水平和增加SS、VIP水平能夠緩解結(jié)腸炎,本研究中LP-YS2可以通過以上作用起到抑制潰瘍性結(jié)腸炎的作用。

表3 各組小鼠血清的ET、SS、SP和VIP水平

2.3 LP-YS2對小鼠血清IL-2和IL-10細(xì)胞因子水平的作用

由表4可知,模型組小鼠血清的IL-2細(xì)胞因子水平顯著(p<0.05)低于其余各組小鼠;在LP-YS2作用下,LP-YS2-H和LP-YS2-L組小鼠血清的IL-2細(xì)胞因子水平顯著提高(p<0.05),并且LP-YS2-H作用下IL-2水平略低于藥物柳氮磺胺吡啶的作用。相反的,模型組小鼠血清的IL-10水平最高,正常組小鼠最低,LP-YS2-H作用下小鼠的IL-10水平僅低于藥物物柳氮磺胺吡啶組和正常組小鼠。IL-2是Th2細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子,與UC直接相關(guān);Th2細(xì)胞介導(dǎo)免疫反應(yīng)影響UC,IL-2在過程通過影響Th2細(xì)胞起到抑制炎癥的作用,減輕UC程度[22-24]。IL-10是具有免疫抑制作用的Treg細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子,能夠促進(jìn)結(jié)腸炎的發(fā)展[24];LP-YS2能夠提升IL-2水平和降低IL-10水平,通過調(diào)控機(jī)體免疫系統(tǒng)緩解結(jié)腸炎。

表4 各組小鼠血清細(xì)胞因子IL-2和IL-10水平的影響

2.4 LP-YS2對小鼠結(jié)腸組織MPO、SOD活力和GSH、MDA含量的作用

由表5可知,正常組小鼠結(jié)腸組織中的GSH含量和SOD活力最強(qiáng),MPO活力和MDA含量最弱,體內(nèi)保持正常的氧化水平,未見自由基對機(jī)體造成損傷;DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎后,GSH含量和SOD活力顯著(p<0.05)下降,而MPO活力和MDA含量則顯著(p<0.05)上升。LP-YS2和柳氮磺胺吡啶可以顯著(p<0.05)抑制DSS造成的GSH含量、SOD活力下降和MPO活力、MDA含量上升。同時(shí),相對于模型組小鼠高濃度的LP-YS2(LP-YS2-H)能夠更顯著(p<0.05)的上升小鼠結(jié)腸組織的GSH含量、SOD活力和下調(diào)MPO活力、MDA含量。結(jié)腸病變發(fā)生炎癥后組織中中性粒細(xì)胞聚集開始下降,大量中性粒細(xì)胞內(nèi)流進(jìn)入組織使MPO活力大幅度提高[25],同時(shí)ROS和RNS等自由基大量聚集,進(jìn)一步使結(jié)腸組織發(fā)生損傷和毒性反應(yīng),加劇結(jié)腸炎[26]。實(shí)驗(yàn)和臨床研究都證實(shí)發(fā)生結(jié)腸炎后,結(jié)腸組織中的GSH含量和SOD活力大幅度降低,同時(shí)過氧化產(chǎn)物MDA則大幅度上升[27-28],由此證實(shí)控制自由基在組織中的聚集,增強(qiáng)抑制氧化的酶活力,可以起到抑制結(jié)腸炎的作用。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)UC導(dǎo)致SOD活力和GSH含量下降,而MPO活力和MDA含量增強(qiáng),LP-YS2可顯著(p<0.05)抑制UC對結(jié)腸造成的氧化應(yīng)激反應(yīng),抑制結(jié)腸炎。

表5 各組小鼠結(jié)腸組織的MPO、GSH、MDA和SOD活力

2.5 LP-YS2對小鼠結(jié)腸組織nNOS、eNOS和iNOS mRNA表達(dá)的作用

由表6可知,DSS誘導(dǎo)結(jié)腸癌后可導(dǎo)致小鼠結(jié)腸中nNOS和eNOS的mRNA相對表達(dá)量下降,而iNOS相對表達(dá)量上升。LP-YS2可上調(diào)DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中的nNOS和eNOS相對表達(dá)量和下調(diào)iNOS的相對表達(dá)量,且LP-YS2-H上調(diào)nNOS和eNOS相對表達(dá)量和下調(diào)iNOS的相對表達(dá)量顯著(p<0.05)強(qiáng)于LP-YS2-L,LP-YS2-H作用小鼠結(jié)腸的nNOS、eNOS和iNOS相對表達(dá)量略低于柳氮磺胺吡啶20 mg/kg bw灌胃作用小鼠的相對表達(dá)量。有研究顯示eNOS可以控制產(chǎn)生適量的NO,從而保持結(jié)腸組織處于正常狀態(tài),對結(jié)腸炎引起的結(jié)腸損傷有重要的控制作用;iNOS則能轉(zhuǎn)化出大量的NO,過量的NO對結(jié)腸組織的損傷具有副作用,加劇結(jié)腸的損傷[29]。nNOS也可以控制NO在組織中的濃度,維持組織不受到過量NO的侵害,同時(shí)nNOS還可以控制iNOS的過量表達(dá),抑制炎癥[29-30]。本研究中LP-YS2-H組小鼠由于受到LP-YS2-H的作用,上調(diào)了結(jié)腸中nNOS、eNOS表達(dá)和下調(diào)了iNOS表達(dá),對結(jié)腸炎起到了抑制作用。

表6 LP-YS2對小鼠結(jié)腸組織nNOS、eNOS和iNOS mRNA表達(dá)的作用

2.6 LP-YS2對小鼠結(jié)腸組織c-Kit和SCF mRNA表達(dá)的作用

由表7可知,正常組小鼠結(jié)腸組織中c-Kit和SCF的mRNA相對表達(dá)強(qiáng)度最高,模型組小鼠結(jié)腸中的c-Kit和SCF相對表達(dá)強(qiáng)度最低。LP-YS2-H組小鼠結(jié)腸中的c-Kit和SCF相對表達(dá)強(qiáng)度顯著(p<0.05)高于LP-YS2-L組和模型組小鼠,低于柳氮磺胺吡啶組和正常組小鼠。UC導(dǎo)致結(jié)腸功能紊亂,結(jié)腸動(dòng)力降低,UC導(dǎo)致正常的Cajal間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量降低,使結(jié)腸動(dòng)力下降,與UC進(jìn)程直接相關(guān)[31]。c-Kit和SCF對保持Cajal間質(zhì)細(xì)胞數(shù)量有重要的作用,SCF/Kit 信號途徑受損后,Cajal間質(zhì)細(xì)胞不僅數(shù)量下降,Cajal間質(zhì)細(xì)胞的增殖也將受到影響,使UC的癥狀加劇[32]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明LP-YS2可通過上調(diào)結(jié)腸組織中c-Kit和SCF的表達(dá)抑制DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎。

表7 LP-YS2對小鼠結(jié)腸組織c-Kit和SCF mRNA表達(dá)的作用

2.7 LP-YS2對小鼠結(jié)腸組織IL-8和CXCR2 mRNA表達(dá)的作用

由表8可知,DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎模型組小鼠結(jié)腸的IL-8和CXCR2 mRNA相對表達(dá)量最高,正常組小鼠結(jié)腸的相對表達(dá)量最低。藥物柳氮磺胺吡啶組小鼠結(jié)腸的IL-8和CXCR2相對表達(dá)量僅高于正常組,低于其余各組。LP-YS2-H組小鼠結(jié)腸的IL-8和CXCR2相對表達(dá)量則顯著(p<0.05)低于LP-YS2-L組和模型組小鼠。IL-8是一種中性粒細(xì)胞趨化和活化因子,可以介導(dǎo)多種途徑誘發(fā)的炎癥反應(yīng),包括能介導(dǎo)UC的炎癥[33]。CINC-1是IL-8家族中的一種中性粒細(xì)胞趨化因子,CXCR2是CINC-1的受體,CXCR2能夠起到介質(zhì)作用來調(diào)控器官間相互作用,降低CXCR2在組織中的含量有助于減輕UC造成的結(jié)腸損傷[34-35]。LP-YS2可以顯著下調(diào)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸中的IL-8和CXCR2 mRNA表達(dá),從而抑制結(jié)腸炎。

表8 LP-YS2對小鼠結(jié)腸組織IL-8和CXCR2 mRNA表達(dá)的作用

3 結(jié)論

本研究采用DSS誘導(dǎo)小鼠結(jié)腸炎動(dòng)物模型對從自然發(fā)酵牦牛酸乳中分離到的乳酸菌LP-YS2的結(jié)腸炎抑制效果進(jìn)行了體外研究。通過對小鼠血清和結(jié)腸組織的觀察,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示相對與結(jié)腸炎模型組小鼠,LP-YS2可以抑制結(jié)腸炎對小鼠造成的影響,緩解結(jié)腸炎,使小鼠機(jī)體各項(xiàng)指標(biāo)向正常狀態(tài)轉(zhuǎn)換。由此可以看出,LP-YS2可以抑制DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎,濃度與效果呈正相關(guān),高濃度LP-YS2的作用更為強(qiáng)烈。LP-YS2是一種具有結(jié)腸炎抑制效果的優(yōu)質(zhì)乳酸菌,有待進(jìn)一步開發(fā)利用。