裘迪紅,黃麗華,陳哲科,王妮妮,戴 苡,鐘要紅

(杭州醫(yī)學(xué)院,浙江杭州 310053)

目前,慢性病已經(jīng)是全球人類健康的重大問題,動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、冠心病等心血管疾病已嚴(yán)重威脅著人類的健康,血清中高膽固醇含量是引起眾多心血管疾病的重要因素之一,甚至成為導(dǎo)致死亡的首要因素[1]。目前雖然有許多用于降低膽固醇的藥物,但人們更希望能夠通過非藥物途徑來達(dá)到降低膽固醇含量的目的。

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)屬于乳桿菌科中的乳桿菌屬,是人體胃腸道的土著菌群,植物乳桿菌具有維持腸道內(nèi)菌群平衡[2]、降低膽固醇水平[3]、提高機(jī)體免疫力、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收[4]等多種功能。利用益生菌降低食品和人體血清中的膽固醇,是近20年來隨著人們對(duì)營(yíng)養(yǎng)與健康要求的逐漸提高才發(fā)展起來的一項(xiàng)新的研究課題,其應(yīng)用價(jià)值也正被越來越多的研究者和企業(yè)所看好。因此,國內(nèi)外學(xué)者對(duì)植物乳桿菌的分離鑒定及其益生特性進(jìn)行了大量的研究,植物乳桿菌降低血清中膽固醇的益生特性尤其引人注目,Jeun等研究了植物乳桿菌的降血脂功能,Lye等研究植物乳桿菌的降血脂功能及其機(jī)理,Jafari等研究了植物乳桿菌發(fā)酵乳的降膽固醇效果[5-7]。冉冉在藏靈菇源酸奶復(fù)合菌發(fā)酵劑對(duì)大鼠降膽固醇的研究中發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌對(duì)大鼠血清膽固醇有顯著的降低作用[8],王俊國在植物乳桿菌LIP-1對(duì)高脂血癥大鼠血脂的調(diào)節(jié)作用的研究中也發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌有降血脂的功能[9]。更多的研究者開始關(guān)注植物乳桿菌產(chǎn)品的開發(fā)以及機(jī)理的研究。目前,國內(nèi)市場(chǎng)尚未出現(xiàn)以降膽固醇功能為主的功能性發(fā)酵乳,因此開發(fā)降膽固醇發(fā)酵乳,對(duì)高脂血癥的人群進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)干預(yù),以期達(dá)到降低血脂、預(yù)防心血管疾病的目的,是預(yù)防慢性病的一條途徑。

本實(shí)驗(yàn)從從泡菜中分離出一株體外膽固醇降解率為45%的植物乳桿菌,經(jīng)過牛乳發(fā)酵的風(fēng)味研究發(fā)現(xiàn),該菌在牛乳培養(yǎng)基中能產(chǎn)生獨(dú)特的風(fēng)味,因此把該菌應(yīng)用到降膽固醇發(fā)酵乳的制備中。為縮短發(fā)酵時(shí)間,采用混合乳酸菌發(fā)酵制備發(fā)酵乳,為了解其降血脂功能,采用高血脂模型小鼠研究發(fā)酵乳在體內(nèi)的降血脂功能,以期為將來降膽固醇乳制品的生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮牛乳 蒙牛牌,購于超市;菌種 植物乳桿菌,實(shí)驗(yàn)室分離鑒定獲得;商業(yè)發(fā)酵劑(嗜酸鏈球菌、保加利亞乳桿菌) 北京川修科技有限公司;昆明雄性小鼠 6周齡,體重38～44 g,許可證號(hào)SCXK(滬)2012-0002,上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司;動(dòng)物房條件 溫度(20±2) ℃,濕度78.5%,每天12 h光照,12 h黑暗;基礎(chǔ)飼料配方(W/W):面粉20%,米粉10%,玉米20%,麩皮25%,豆料20%,骨粉2%,魚粉;高脂飼料配方(W/W):基礎(chǔ)飼料83.8%,膽固醇1%,豬油10%,牛膽鹽0.2%,蛋黃5%;MRS肉湯培養(yǎng)基 航景生物科技有限公司。

總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)和高密度脂蛋白(HDL-C)含量試劑盒 德賽診斷系統(tǒng)(上海)有限公司;0500790S日立7020全自動(dòng)生化分析儀 上海曼普生物科技有限公司。PL4002電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;H-205R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;QHZ-12A組合式恒溫振蕩培養(yǎng)箱 上海瀘西分析儀器廠有限公司;HWS恒溫恒濕培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠;LDZX-50KB立式高壓滅菌鍋 上海申安醫(yī)療器械廠;紫外分光光度計(jì)、FE20實(shí)驗(yàn)室PH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;DK-8D型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒溫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 植物乳桿菌發(fā)酵液的制備 取 0.4 mL活化的植物乳桿菌于10 mL MRS肉湯培養(yǎng)基中,37 ℃搖床培養(yǎng)至菌體濃度約為107～108cfu/mL。

1.2.2 發(fā)酵乳的制備 混合菌發(fā)酵:新鮮牛乳預(yù)熱到70 ℃,于40 MPa下均質(zhì),95 ℃殺菌5 min冷卻至37 ℃,按比例加入植物乳桿菌和商業(yè)發(fā)酵劑發(fā)酵,植物乳桿菌添加比例為2%(v/v),商業(yè)發(fā)酵劑的添加量為0.05%(v/v),37 ℃靜止培養(yǎng),14 h后停止發(fā)酵,測(cè)定發(fā)酵乳的pH,同時(shí)用選擇培養(yǎng)基測(cè)定植物乳桿菌活菌數(shù)。

1.2.3 高脂模型的建立和灌胃方法 動(dòng)物分組和飼喂安排:小鼠自由飲水,基礎(chǔ)飼料飼喂一周后,按體重和TC平均分配原則將小鼠分成正常組、對(duì)照組和發(fā)酵乳組3 組,每組10 只。不同處理組喂食情況分別為:正常組:喂基礎(chǔ)飼料,每天每只灌胃0.4 mL生理鹽水;對(duì)照組:喂高脂飼料,每天每只灌胃0.4 mL生理鹽水;發(fā)酵乳組:喂高脂飼料,每天每只灌胃0.4 mL自制發(fā)酵乳。其中,正常組和對(duì)照組小鼠飼養(yǎng)14 d 后采血,檢測(cè)TC、TG,評(píng)價(jià)是否形成高脂血癥。小鼠飼養(yǎng)期間,每天保持充足的食物和飲水,期間每天記錄小鼠的體重和攝食量。

1.2.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理與檢測(cè)方法

1.2.4.1 體重、攝食量和飼料利用率的測(cè)定 小鼠飼養(yǎng)期間,每天定時(shí)稱量攝食量并記錄,每周稱一次體重,計(jì)算飼料利用率:飼料利用率(%)=體重/攝入量×100。

1.2.4.2 血清中TC、TG、LDL-C和HDL-C含量的測(cè)定 小鼠飼養(yǎng)28 d禁食12 h,眼眶靜脈叢采血,4 ℃冰箱靜置3 h,離心(3000 r/min,15 min,4 ℃),取血清,試劑盒測(cè)定小鼠血清中的TC、TG、LDL-C和HDL-C含量。

1.2.4.3 臟器指數(shù)的測(cè)定 末次灌胃24 h后,稱量體重,立即摘取心臟、肝臟、脾臟和腎臟,生理鹽水沖洗,濾紙吸干后稱重,與小鼠最終體質(zhì)量的比值即為臟器指數(shù)。

1.2.4.4 肝臟TC、TG含量的測(cè)定 把肝臟0.5 g加入5 mL甲醇-氯仿(V/V=2∶1)進(jìn)行研磨,用甲醇氯仿(2∶1)混合液收集,定容至10 mL后于45 ℃水浴1 h,于4 ℃離心(8000×g,10 min),取30 μL上清液,用試劑盒測(cè)定TC和TG含量。

1.2.4.5 安全性評(píng)價(jià) 小鼠采血處死后,無菌操作取出肝臟,稱重后,轉(zhuǎn)移到滅菌培養(yǎng)皿,4 ℃冷藏,30 min內(nèi)測(cè)定肝臟組織中是否有乳酸菌。具體方法:無菌條件切取肝臟2 g,滅菌PBS緩沖溶液(pH6.8)懸浮,均質(zhì)機(jī)均質(zhì),溶液涂布MRS平板,37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h,觀察平板有無菌落。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵乳的制備

由于植物乳桿菌是營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株,在牛乳中發(fā)酵能力差[10],而商業(yè)發(fā)酵劑的主要菌株是嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌,具有較強(qiáng)的發(fā)酵能力,所以本實(shí)驗(yàn)選擇混合發(fā)酵的方法,在傳統(tǒng)的發(fā)酵乳發(fā)酵過程中添加植物乳桿菌進(jìn)行協(xié)同發(fā)酵,以此來提高植物乳桿菌的發(fā)酵能力。按植物乳桿菌添加比例為2%,商業(yè)發(fā)酵劑的添加量為0.05%,加入商業(yè)發(fā)酵劑和植物乳桿菌,37 ℃培養(yǎng)14 h后,所得發(fā)酵乳口感細(xì)膩,組織均勻,有酸奶獨(dú)特的風(fēng)味,發(fā)酵乳中的植物乳桿菌的活菌數(shù)為106cfu/mL。

2.2 發(fā)酵乳對(duì)高脂血癥小鼠的影響

2.2.1 小鼠的高脂血癥模型的建立 如表1所示,在實(shí)驗(yàn)14 d后,與正常組相比,對(duì)照組小鼠血清中TC、TG顯著升高(p<0.05),表明高脂模型誘導(dǎo)成功。

表1 正常組、對(duì)照組小鼠血清中的TC、TG含量

2.2.2 發(fā)酵乳對(duì)高脂小鼠的體重、攝食量、飼料利用率及臟器指數(shù)的影響 在整個(gè)喂養(yǎng)期間,三組小鼠毛色光潔,食欲正常,均未出現(xiàn)異常體征,未發(fā)生自然死亡。由表2和表3可知,發(fā)酵乳組小鼠的體重、攝食量、飼料利用率和臟器指數(shù)與正常組相比,無顯著差異(p>0.05),說明植物乳桿菌對(duì)小鼠沒有毒副作用。對(duì)照組的體重、攝食量和飼料利用率比其它兩組顯著增高(p<0.05)。這進(jìn)一步說明了本實(shí)驗(yàn)高脂模型建立成功。

表2 不同處理組小鼠的體重、攝食量和飼料利用率

表3 不同處理組小鼠的臟器指數(shù)(%)

2.2.3 發(fā)酵乳對(duì)高脂小鼠血清TC、TG、LDL-C和HDL-C含量的影響 從表4中可以看出,28 d喂養(yǎng)后,與對(duì)照組相比,發(fā)酵乳組小鼠血清中TC和TG含量顯著下降(p<0.05),分別降低了43.21%和40.31%,而LDL-C和HDL-C無顯著變化(p>0.05)。鄒華軍在發(fā)酵泡菜對(duì)高脂血癥大鼠的干預(yù)效果研究中也有類似的結(jié)論[11],但是二者降低程度不同。王俊國在植物乳桿菌LIP-1對(duì)高脂血癥大鼠血脂的調(diào)節(jié)作用中也發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌有降血脂的功能,與本文不同之處是其LDL-C降低顯著(p<0.05),HDL-C升高顯著(p<0.05)。分析原因主要是植物乳桿菌降膽固醇的效果受很多因素的影響,在發(fā)酵乳中的植物乳桿菌與在脫脂乳中的植物乳桿菌由于培養(yǎng)基不同,降血脂的程度也會(huì)不同。

表4 不同處理組小鼠血清中的TC、TG、HDL-C、LDL-C含量(mmol/L)

2.2.4 發(fā)酵乳對(duì)高脂小鼠肝臟TC、TG 含量的影響 由表5可看出,實(shí)驗(yàn)28 d后,與正常組相比,對(duì)照組肝臟的TC、TG顯著增加(p<0.05),與對(duì)照組相比,灌胃發(fā)酵乳組小鼠肝臟中TC、TG顯著下降(p<0.05),分別下降了48.95%和31.54%。這說明了飼喂植物乳桿菌發(fā)酵乳可以顯著減少膽固醇在高脂小鼠肝臟中的積存(p<0.05)。但是飼喂植物乳桿菌發(fā)酵乳的高脂小鼠中TC和TG含量仍明顯高于正常組(p<0.05),表明灌胃植物乳桿菌仍不能使高脂小鼠恢復(fù)到正常狀態(tài)。

表5 不同處理組小鼠肝臟中的TC和TG含量(mg/g)

2.2.5 肝臟的乳酸菌檢測(cè) 對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠肝臟的乳酸菌檢測(cè)顯示,MRS平板上未發(fā)現(xiàn)乳酸菌菌落的形成,說明發(fā)酵乳在小鼠體內(nèi)不會(huì)發(fā)生肝腸易位現(xiàn)象。

3 討論與結(jié)論

目前,許多國內(nèi)外研究者對(duì)乳酸菌降低膽固醇的影響因素和機(jī)理進(jìn)行了研究,觀點(diǎn)主要集中在以下3點(diǎn):a. 乳酸菌菌體細(xì)胞能夠同化吸收膽固醇:體外研究表明,在厭氧的條件下,乳酸菌在含有膽鹽的高膽固醇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)時(shí),菌體細(xì)胞可以同化吸收介質(zhì)中的膽固醇,降低介質(zhì)中膽固醇的含量。Grill[12]等發(fā)現(xiàn)在含有牛膽鹽的高膽固醇培養(yǎng)基中,厭氧條件下,食淀粉乳桿菌細(xì)胞具有較強(qiáng)的膽固醇同化能力,可以降低培養(yǎng)基中約50%的膽固醇。b. 乳酸菌降解結(jié)合態(tài)膽酸轉(zhuǎn)變?yōu)橛坞x態(tài)膽酸,后者由于溶解度下降與膽固醇發(fā)生共沉淀反應(yīng),從而降低膽固醇含量。Klaver[13]等研究者認(rèn)為,乳酸菌對(duì)膽固醇的降低作用是因?yàn)樵谒嵝詶l件(pH<6.0)下,膽固醇與膽鹽形成了沉淀,從而降低了培養(yǎng)基中膽固醇的含量。人體內(nèi)存在脫結(jié)合膽酸與膽固醇共沉淀現(xiàn)象,這一作用將阻止膽固醇進(jìn)入血液循環(huán),避免了血清中高膽固醇的出現(xiàn)。c. 其他理論。對(duì)雙歧桿菌的研究還發(fā)現(xiàn),雙歧桿菌通過抑制人體內(nèi)活化的T細(xì)胞,控制新形成的低密度脂蛋白LDL受體,有助于降低血清膽固醇水平[14]。植物乳桿菌降膽固醇的作用機(jī)理是復(fù)雜的,反映出來的降膽固醇的效果也是不一樣的。只有了解植物乳桿菌降膽固醇機(jī)理,才能最大程度地降低血清中的膽固醇。

本實(shí)驗(yàn)利用從泡菜中分離的植物乳桿菌制備發(fā)酵乳,發(fā)酵劑與植物乳桿菌接種量分別為0.05%(V/V)和2%(V/V),發(fā)酵溫度為37 ℃,時(shí)間14 h,發(fā)酵乳具有清香、口感好的特點(diǎn)。經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)發(fā)酵乳對(duì)高脂小鼠具有一定的降膽固醇效果,高脂小鼠血清中TC和TG含量顯著下降(p<0.05),而LDL-C和HDL-C含量無顯著變化(p>0.05)。發(fā)酵乳在小鼠體內(nèi)不會(huì)發(fā)生肝腸易位現(xiàn)象。為了增強(qiáng)發(fā)酵乳對(duì)高脂小鼠的降膽固醇能力,提高植物乳桿菌的發(fā)酵能力,植物乳桿菌的代謝、降膽固醇機(jī)理是今后研究的重點(diǎn),在此基礎(chǔ)上,優(yōu)化發(fā)酵乳工藝條件,生產(chǎn)降膽固醇發(fā)酵乳,對(duì)高脂血癥人群進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)干預(yù),預(yù)防慢性病,提高全民的健康水平。