石建斌，王 寧，周 紅，許慶華，喬文青，嚴(yán)根土

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 棉花研究所/棉花生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 安陽(yáng) 455000)

赤霉素(Gibberellins，簡(jiǎn)稱GAs)作為一種重要的植物激素，其在植物的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育周期中起調(diào)節(jié)作用，參與控制多種多樣的植物發(fā)育過(guò)程，包括種子萌發(fā)、根的生長(zhǎng)、莖的伸長(zhǎng)、葉片伸展、表皮毛發(fā)育、花粉管生長(zhǎng)、花和果實(shí)的發(fā)育等[1-3]。并且植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性也與GA生物合成的調(diào)控有著或多或少的關(guān)系，目前通過(guò)GA矮化突變體的研究已經(jīng)基本闡明了高等植物赤霉素代謝途徑[4]。赤霉素合成過(guò)程較為復(fù)雜，整個(gè)合成途徑可分為3個(gè)階段，參與其合成的關(guān)鍵酶主要包括古巴焦磷酸合成酶(Copalyl pyrophosphate synthase,CPS)、內(nèi)-貝殼杉烯合成酶(Ent-kaurene synthase,KS)、內(nèi)-貝殼杉烯氧化酶(Ent-kaurene oxidase,KO)、GA-2氧化酶(GA-2 oxidase)、GA-20氧化酶(GA-20 oxidase)和GA-3氧化酶(GA-3 oxidase)等[5]。自20世紀(jì)60年代起，由于水稻sd1基因和小麥Rht1基因在育種中的應(yīng)用，極大地提高了世界主要糧食作物的產(chǎn)量，由于GAs對(duì)農(nóng)作物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控作用，其直接或間接的影響著農(nóng)作物的產(chǎn)量和質(zhì)量，最近的研究表明主要農(nóng)作物的“綠色革命”都與赤霉素密切相關(guān)[6-7]。目前，在分子水平上研究赤霉素的表達(dá)調(diào)控已成為植物激素研究領(lǐng)域中的前沿和熱點(diǎn)[8-10]。實(shí)時(shí)熒光定量PCR為目前常用檢測(cè)基因表達(dá)量的方法，操作簡(jiǎn)便，省時(shí)省力，高精確度和高靈敏度等特點(diǎn)，能夠檢測(cè)表達(dá)豐度較低的mRNA，已經(jīng)成為基因表達(dá)量分析的首選方法[11-12]。

赤霉素在棉花上的應(yīng)用包括促進(jìn)棉種發(fā)芽，提高種子活性；促進(jìn)莖葉伸長(zhǎng)，增加棉株高度；促進(jìn)花芽分化，刺激花粉萌發(fā)及花粉管伸長(zhǎng)，防止蕾鈴脫落，并促進(jìn)果實(shí)生長(zhǎng)；膨大棉鈴，增加庫(kù)容量，有利于提高單鈴質(zhì)量等。研究赤霉素合成途徑相關(guān)酶基因在棉花中的時(shí)空表達(dá)模式，有助于對(duì)赤霉素的合理應(yīng)用，以及進(jìn)行株型改良研究。因此，本研究以陸地棉品種“中571”為材料，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，分析在不同生長(zhǎng)發(fā)育階段內(nèi)不同組織間的赤霉素合成途徑關(guān)鍵酶基因的表達(dá)情況，為進(jìn)一步了解棉花株型發(fā)育中赤霉素的表達(dá)模式提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

“中571”(Z571)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所提供，為本課題培育的常規(guī)品種。

主要儀器包括超凈工作臺(tái)，微量移液槍(Eppendorf)，iQ5實(shí)時(shí)熒光PCR儀(Bio-Rad)，高速冷凍離心機(jī)，PCR儀，水平凝膠電泳儀，凝膠成像系統(tǒng)。

主要試劑包括2×SYBR Green I Mix(Takara)，96孔PCR板(Takara)，RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒、Fast Quant cDNA第一鏈合成試劑盒、RNase-Free DNase I、10×buffer、dNTP、Taq聚合酶均購(gòu)自天根生物公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 材料準(zhǔn)備 取Z571種子，在播種期種植于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所東場(chǎng)九區(qū)試驗(yàn)田。分別于幼苗期(8片真葉)、開(kāi)花期、吐絮期取植株的根、莖、葉部位組織，-80 ℃保存。

1.2.2 棉花總RNA提取與質(zhì)量檢測(cè) 取保存的各樣品，提取RNA。室內(nèi)稱取棉花各組織樣品材料0.5 g在液氮中迅速研磨成粉末，按植物總RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行，提取的RNA用核酸測(cè)定儀測(cè)定濃度和純度，并用12 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈 以提取的RNA為模版，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，體系為20 μL，包含Total RNA 30 ng、5×g DNA Buffer 2 μL、RNase-Free ddH2O補(bǔ)足20 μL，混勻并簡(jiǎn)短離心，在PCR儀中進(jìn)行42 ℃ 3 min，4 ℃ 2 min。之后在體系中加入FQ-RT Primer Mix 2 μL、10×Fast RT Buffer 2 μL、RT Enzyme Mix 1 μL和RNase-Free ddH2O 5 μL，混勻后置于PCR儀中進(jìn)行42 ℃ 15 min，95 ℃ 3 min，取出后-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 引物的設(shè)計(jì) 植物中參與赤霉素合成途徑的關(guān)鍵酶主要包括CPS1、KS、KO、GA2ox、GA20ox和GA3ox，以及赤霉素受體基因GID1，經(jīng)在NCBI查找EST序列并參考水稻、葡萄、番茄等植物赤霉素代謝關(guān)鍵酶基因序列[13-15]，利用Primer Premier 5在各基因保守序列內(nèi)設(shè)計(jì)特異性引物，以棉花內(nèi)源持家基因UBQ7(GenBank：DQ116441)作為內(nèi)參基因[16]，所有引物由上海生物工程公司合成(表1)。

表1 引物序列表

1.2.5 qRT-PCR分析 以反轉(zhuǎn)合成的各樣品cDNA為模版，用各目的基因的特異性引物進(jìn)行Real-timePCR擴(kuò)增。反應(yīng)中，分別擴(kuò)增不同生長(zhǎng)階段各材料樣品中根、莖、葉組織內(nèi)的各目的基因和內(nèi)參基因，每樣設(shè)3重復(fù)。反應(yīng)體系為20 μL，包含10 μL 2×SYBR Green I，引物各1 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 15 min、95 ℃ 10 s、60 ℃ 30 s，40 times，熔解曲線的測(cè)定均是從65 ℃到95 ℃，每0.5 ℃/5 s測(cè)定吸光值1次。數(shù)據(jù)由iQ5熒光定量PCR儀全程采集、分析，用2-(△△CT)法計(jì)算目的基因表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 Z571棉花植株取樣與Real-time PCR

在田間分別于幼苗期，開(kāi)花期和吐絮期采集棉花植株的根、莖、葉組織，用蒸餾水沖洗干凈，經(jīng)吸水紙吸干多余水分后，-80 ℃保存?？俁NA的提取參照RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行，經(jīng)12 g/L的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA，條帶清晰無(wú)降解，可用于下一步的反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)和熒光定量實(shí)驗(yàn)(圖1)。

a:幼苗期；b:開(kāi)花期；c:吐絮期；M:Marker；1～3:幼苗期根莖葉組織RNA；4～7:開(kāi)花期根莖葉花組織RNA；8～10:吐絮期根莖葉組織RNAa:seedling；b:full-blooming；c:boll opening；M:Marker；1-3:RNA of root,stem,leaf in seedling stage；4-7:RNA of root,stem,leaf,flower in full-blooming stage；8-10:RNA of root,stem,leaf in boll opening stage圖1 中571生長(zhǎng)發(fā)育與RNA檢測(cè)Fig.1 The growth and development of Z571and RNA detection

第一鏈cDNA的合成參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作進(jìn)行，并以合成的cDNA為模版，利用特異性引物對(duì)Z571材料的根、莖、葉組織內(nèi)赤霉素合成途徑各關(guān)鍵酶基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)，如圖2所示，各目的基因及內(nèi)參基因的擴(kuò)增曲線表現(xiàn)較好，由于目的基因不同，熔解曲線為多峰，但同一目的基因的熔解曲線表現(xiàn)為單峰，擴(kuò)增產(chǎn)物特異性好，擴(kuò)增曲線中的熒光值能夠準(zhǔn)確反應(yīng)目的產(chǎn)物的擴(kuò)增，可以進(jìn)行基因相對(duì)表達(dá)量的計(jì)算。

a:各目的基因擴(kuò)增曲線；b:內(nèi)參基因(UBQ7)擴(kuò)增曲線；c:各目的基因熔解曲線；d:內(nèi)參基因(UBQ7)熔解曲線a:amplification curve of target gene；b:amplification curve of UBQ7；c:melt curve of target gene；d:melt curve of UBQ7圖2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線Fig.2 Real-time PCR amplification curve

基因Gene組織Tissue幼苗期 SeedlingΔCT=-ΔΔCT=CT(Target)-CT(UBQ7)ΔCT(Root)-ΔCT2-ΔΔCT開(kāi)花期 Full-bloomingΔCT=-ΔΔCT=CT(Target)-CT(UBQ7)ΔCT(Root)-ΔCT2-ΔΔCT吐絮期 Boll openingΔCT=-ΔΔCT=CT(Target)-CT(UBQ7)ΔCT(Root)-ΔCT2-ΔΔCTCPS1根Root11.230.001.0010.081.152.2211.030.201.15莖Stem9.321.913.759.831.402.6511.42-0.190.88葉Leaf13.91-2.680.1611.95-0.720.6110.011.222.33花Flower12.76-1.530.35KS根Root7.500.001.006.990.501.426.860.641.55莖Stem8.22-0.730.606.570.931.907.370.131.09葉Leaf12.85-5.360.0210.97-3.480.097.140.361.28花Flower10.13-2.630.16KO根Root6.810.001.006.570.241.187.53-0.720.61莖Stem7.33-0.520.706.000.811.757.22-0.410.75葉Leaf8.29-1.490.367.52-0.720.616.080.731.65花Flower7.96-1.150.45GA2ox1根Root3.840.001.002.001.853.591.372.475.55莖Stem6.04-2.200.222.161.683.211.672.174.51葉Leaf4.91-1.060.482.391.462.753.420.421.34花Flower2.111.733.32GA3ox1根Root12.520.001.0010.911.603.0411.261.262.39莖Stem10.611.913.7510.372.154.4410.571.953.86葉Leaf9.712.817.028.034.4922.449.842.686.40花Flower8.593.9315.23GA20ox1根Root15.250.001.0013.771.492.8015.000.251.19莖Stem13.731.532.8810.814.4521.7913.062.194.58葉Leaf16.03-0.770.5914.600.651.5712.812.445.44花Flower9.935.3340.15GID1B根Root5.950.001.003.802.154.446.01-0.060.96莖Stem5.340.601.524.821.132.195.520.431.35葉Leaf6.30-0.350.784.041.913.763.832.124.34花Flower0.815.1435.25

棉花材料Z571在不同生長(zhǎng)階段內(nèi)的CPS1、KS、KO、GA2ox1、GA3ox1、GA20ox1和GID1B基因的表達(dá)量采用2-ΔΔCT法，以棉花內(nèi)源基因UBQ7為參考基因，以幼苗期Z571根組織為對(duì)照樣品進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果如表2所示。

2.2 GAs合成相關(guān)酶基因在幼苗期的表達(dá)分析

由圖3可以看出，以幼苗期Z571根組織內(nèi)各目的基因的表達(dá)為對(duì)照，赤霉素合成途徑各關(guān)鍵酶基因在Z571莖、葉組織內(nèi)的表達(dá)量各不相同。在Z571莖中，CPS1、GA3ox1和GA20ox1的表達(dá)量較高，表達(dá)量分別為3.75、3.75和2.88，KS、KO和GA2ox1表達(dá)量較低，其中GA2ox1最低，表達(dá)量為0.22；在Z571葉中，GA3ox1表達(dá)量升高，為7.02，其它基因表達(dá)量均低于對(duì)照。GID1B作為赤霉素受體基因，在莖組織中與GA3ox1、GA20ox1基因表達(dá)呈正相關(guān)。綜合來(lái)看，CPS1、GA20ox1和GID1B在莖中表達(dá)量較高，在葉組織中表達(dá)量較低，GA3ox1在莖葉中表達(dá)量均高于對(duì)照，KS、KO和GA2ox1在莖葉組織內(nèi)表達(dá)量均低于對(duì)照水平，不同組織間基因表達(dá)量差異均達(dá)顯著水平(P<0.05)。苗期棉花植株生長(zhǎng)速率較快，需要充足的養(yǎng)分與激素來(lái)滿足與調(diào)節(jié)植株的生長(zhǎng)發(fā)育，該期間主要以根的生長(zhǎng)與莖的伸長(zhǎng)為主，需要后期階段GA3-氧化酶與GA20-氧化酶促進(jìn)活性GAs的合成。

2.3 GAs合成相關(guān)酶基因在開(kāi)花期的表達(dá)分析

開(kāi)花期內(nèi)棉花植株各組織中的GAs相關(guān)基因表達(dá)量如圖4，根組織中，各目的基因的表達(dá)量與苗期相比均有不同程度的上調(diào)，表達(dá)量在1.18～4.44，其中GA3ox1和GA20ox1分別為3.04和2.80，GID1B為4.44，GA2ox1基因表達(dá)量為3.59，以上差異均達(dá)極顯著水平(P<0.01)。莖組織中，各目的基因表達(dá)量也均表現(xiàn)為上調(diào)，為1.75～21.79，其中GA20ox1基因表達(dá)量最大，為21.79，其次為GA3ox1的4.44，差異均達(dá)極顯著水平(P<0.01)。葉組織中，GA2ox1、GA3ox1、GA20ox1和GID1B基因表達(dá)量較對(duì)照水平有所上調(diào)，分別為2.75、22.44、1.57和3.75，其中以GA3ox1基因表達(dá)量上調(diào)明顯，其余基因均表現(xiàn)為下調(diào)?；ńM織中，GA3ox1、GA20ox1、GID1B基因表達(dá)量高于對(duì)照且達(dá)極顯著水平(P<0.01)，分別為15.23、40.15和35.25，推測(cè)GA3ox1和GA20ox1基因的表達(dá)與花器官的形成有關(guān)。

圖3 幼苗期GAs合成途徑各關(guān)鍵酶基因在棉花各組織內(nèi)的表達(dá)情況Fig.3 The expression of GAsmetabolism key enzyme genes in cotton tissues in seedling stage

圖4 開(kāi)花期GAs合成途徑各關(guān)鍵酶基因在棉花各組織內(nèi)的表達(dá)情況Fig.4 The expression of GAsmetabolism key enzyme genes in cotton tissues in full-blooming stage

2.4 GAs合成相關(guān)酶基因在吐絮期的表達(dá)分析

棉花植株生長(zhǎng)發(fā)育后期，各組織內(nèi)GAs相關(guān)基因表達(dá)如圖5所示，此階段內(nèi)各目的基因表達(dá)量變化較大，根組織中GA2ox1和GA3ox1基因表達(dá)量顯著上調(diào)，分別為5.55和2.39，與對(duì)照相比差異達(dá)顯著水平(P<0.05)，其余基因表現(xiàn)不明顯。莖組織中，CPS1、KO基因表達(dá)量為下調(diào)，其余基因表達(dá)量均上調(diào)，其中以GA2ox1上調(diào)幅度最大，為4.51，其次為GA3ox1和GA20ox1，表達(dá)量分別為3.86和4.58，達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。葉組織中所有目的基因均表現(xiàn)為上調(diào)，最高為GA3ox1的6.40，其次為GA20ox1的5.44，且均達(dá)極顯著水平(P<0.01)。葉組織內(nèi)KS、GA2ox1表達(dá)量較小，為1.28和1.34。該生長(zhǎng)階段內(nèi)，植株的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)逐漸降低，表現(xiàn)為根莖GA2ox1基因表達(dá)量升高；此時(shí)棉桃生長(zhǎng)發(fā)育至脫水成熟，需要內(nèi)源GAs的促進(jìn)與調(diào)控，表現(xiàn)為植株葉組織中GA3ox1、GA20ox1基因及GAs受體基因GID1B表達(dá)量上調(diào)。

2.5 棉花GAs合成相關(guān)酶基因在不同生長(zhǎng)階段的表達(dá)變化

赤霉素合成途徑相關(guān)酶基因在根組織內(nèi)隨生長(zhǎng)發(fā)育變化趨勢(shì)如圖6所示。以幼苗期根組織為對(duì)照，CPS1、KO、GA3ox1、GA20ox1和GID1B基因均表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)，KS、GA2ox1基因則表現(xiàn)出逐漸升高的趨勢(shì)。CPS1、GA3ox1、GA20ox1、GID1B基因表達(dá)量在開(kāi)花期上調(diào)幅度均超過(guò)2倍，其中以GID1B上調(diào)幅度最大，為4.44，到吐絮期，CPS1、GA3ox1、GA20ox1、GID1B基因表達(dá)量逐漸下降，CPS1、GA20ox1、GID1B下降到對(duì)照水平以下，GA3ox1基因雖然降低，但仍維持在2.39水平。KO基因幼苗期和開(kāi)花期表達(dá)量變化不大，到吐絮期稍有降低。相比于KS基因，GA2ox1基因表達(dá)量上升趨勢(shì)更為明顯，其開(kāi)花期表達(dá)量為3.59，后逐漸上升到吐絮期的5.55。

圖5 吐絮期GAs合成途徑各關(guān)鍵酶基因在棉花各組織內(nèi)的表達(dá)情況Fig.5 The expression of GAsmetabolism key enzyme genes in cotton tissues in boll opening stage

圖6 Z571根組織GAs合成途徑各關(guān)鍵酶基因的表達(dá)情況Fig.6 The expression of GAsmetabolism key enzyme genes in cotton root

莖組織內(nèi)各基因的表達(dá)變化趨勢(shì)如圖7所示，CPS1基因表達(dá)量在3個(gè)時(shí)期表現(xiàn)出逐漸下降的趨勢(shì)，由幼苗期的3.75下降為吐絮期的0.88；GA2ox1基因表現(xiàn)出逐漸升高的趨勢(shì)，表達(dá)量由幼苗期的0.22逐漸上升為吐絮期的4.51；KS、KO、GA3ox1、GA20ox1、GID1B基因表達(dá)量均表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，且GA3ox1、GA20ox1、GID1B基因表達(dá)量一直維持在對(duì)照水平以上，其中GA20ox1在開(kāi)花期的表達(dá)量達(dá)到了21.79，表明在開(kāi)花期階段，莖組織內(nèi)GA20ox1基因表達(dá)活躍，為棉花植株的果枝的伸長(zhǎng)、花器官發(fā)育及成鈴提供充足的活性GAs。

葉組織內(nèi)各目的基因的表達(dá)變化趨勢(shì)如圖8所示，CPS1、KS、KO、GA20ox1和GID1B基因表達(dá)量在3個(gè)時(shí)期內(nèi)逐漸升高，GA2ox1和GA3ox1基因表達(dá)為先升高后下降。幼苗期內(nèi)，葉組織中的CPS1、KS和KO基因表達(dá)量相對(duì)較低，尤其是KS基因，其在幼苗期與開(kāi)花期內(nèi)的表達(dá)量分別為0.02和0.09。GA2ox1基因在幼苗期低于對(duì)照水平，到開(kāi)花期表達(dá)量達(dá)到升高，到吐絮期又回歸到正常水平；GA3ox1基因表達(dá)量始終處于較高水平，且到開(kāi)花期達(dá)22.44，吐絮期有所降低；GA20ox1和GID1B基因的表達(dá)量呈逐漸升高的趨勢(shì)，可能與后期棉桃的成熟吐絮有關(guān)。

圖7 Z571莖組織GAs合成途徑各關(guān)鍵酶基因的表達(dá)情況Fig.7 The expression of GAsmetabolism key enzyme genes in cotton stem

圖8 Z571葉組織GAs合成途徑各關(guān)鍵酶基因的表達(dá)情況Fig.8 The expression of GAsmetabolism key enzyme genes in cotton leaf

3 討論與結(jié)論

赤霉素作為一種重要的植物激素，它能控制植物生長(zhǎng)發(fā)育的多個(gè)方面，包括根系的生長(zhǎng)、莖的伸長(zhǎng)、葉的展開(kāi)、種子萌發(fā)和花的發(fā)育等，這必然要求植物對(duì)體內(nèi)的赤霉素水平進(jìn)行精確的調(diào)控，而這種調(diào)控主要是通過(guò)控制GA合成代謝途徑各種酶基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。近年來(lái)隨著植物功能基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，赤霉素研究取得重大進(jìn)展，特別是赤霉素生物合成途徑，起關(guān)鍵作用的酶基因已在許多植物中克隆出來(lái)[17-18]。在這些關(guān)鍵酶基因中，CPS、KS和KO在赤霉素的合成早期起作用，其只參與一步反應(yīng)，GA2ox、GA20ox和GA3ox則參與多步反應(yīng)，發(fā)生在赤霉素合成后期，催化具有生物活性赤霉素的合成[19]。研究表明，CPS作為赤霉素合成途徑的起始關(guān)鍵基因，直接影響植物赤霉素的產(chǎn)生，從而嚴(yán)重影響植物的發(fā)育，若CPS完全突變，植物將不能產(chǎn)生赤霉素[20]。在赤霉素合成途徑中，CPS和KS的催化作用被認(rèn)為是在總體水平上調(diào)控赤霉素合成的關(guān)鍵位點(diǎn)[21]。水稻中阻礙KO的催化步驟則會(huì)影響活性赤霉素的合成，最終導(dǎo)致植物矮化[22]。GA2ox是在赤霉素合成途徑中起負(fù)調(diào)控作用的關(guān)鍵酶，起到將有生物活性的GA1和GA4變成無(wú)生物活性的GA8和GA34的分解作用，活性GAs的減少必然影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育[23-24]。水稻和玉米中，由于GA3ox基因的突變，導(dǎo)致了植株矮化的發(fā)生[3,25]。GA20ox是嚴(yán)格調(diào)控的酶，既受活性GA反饋調(diào)節(jié)，又受光周期調(diào)控，過(guò)量表達(dá)GA20ox，植物通常會(huì)表現(xiàn)為節(jié)間伸長(zhǎng)，葉色變淡等特征[18]。赤霉素受體(GID)是赤霉素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的重要成員，直接影響著赤霉素對(duì)植物體效應(yīng)的發(fā)揮，研究表明，在外源GA3誘導(dǎo)下，MsGID1B基因的表達(dá)量較高，可能參與紫花苜蓿的抗逆調(diào)控[26]。近年來(lái)，通過(guò)轉(zhuǎn)基因方法，人們對(duì)GA生物合成通路中所涉及到的基因進(jìn)行了一系列的操作，有利于了解它們?cè)谥参锇l(fā)育過(guò)程中所起的作用和具體的控制過(guò)程，例如談心等[27]利用RNA干擾技術(shù)，構(gòu)建了煙草GA 20-氧化酶基因RNAi植物表達(dá)載體，經(jīng)轉(zhuǎn)化煙草植株后，有效地干擾了煙草GA 20-氧化酶基因的表達(dá)，從而影響煙草植株體內(nèi)活性GAs的合成，影響植株的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致植株矮化。Yamaguchi等[28]在南瓜中發(fā)現(xiàn)CPS基因表達(dá)水平會(huì)根據(jù)不同發(fā)育階段變化，在幼嫩的組織中極為豐富，之后隨著衰老程度增加而降低。

本研究結(jié)果表明，隨著棉花植株的生長(zhǎng)發(fā)育，赤霉素合成途徑相關(guān)基因在不同組織及不同時(shí)期內(nèi)的表達(dá)量各不相同。幼苗期，棉花植株生長(zhǎng)速率較快，需要充足的養(yǎng)分與激素來(lái)滿足與調(diào)節(jié)植株的生長(zhǎng)發(fā)育，該期間主要以根的生長(zhǎng)與莖的伸長(zhǎng)為主，表現(xiàn)為莖中起正向調(diào)控的相關(guān)酶基因GA3ox1和GA20ox1表達(dá)量較高，以促進(jìn)活性GAs的合成。開(kāi)花期，GAs相關(guān)基因表達(dá)量發(fā)生較大變化，各目的基因在根莖組織內(nèi)的表達(dá)量均有不同程度的上調(diào)；莖中GA20ox1基因表達(dá)量最大，為21.79，其次為GA3ox1的4.44；葉組織中GA3ox1表達(dá)量最大，為22.44。莖中GA20ox1基因的高表達(dá)為植株莖的伸長(zhǎng)及果枝發(fā)育提供必要的活性赤霉素水平，這與Huang等[29]研究結(jié)果相一致，GA-3氧化酶同GA-20氧化酶類似，也是嚴(yán)格調(diào)控的酶，受反饋調(diào)節(jié)和光周期調(diào)控，在GAs合成途徑中起正向調(diào)控作用[30-32]，莖、葉、花組織中的GA3ox1、GA20ox1基因表達(dá)量較高，推測(cè)可能與開(kāi)花成鈴有關(guān)。吐絮期，棉花植株以棉桃的脫水成熟吐絮為主，植株的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)逐漸降低，表現(xiàn)為根莖GA2ox1基因表達(dá)量升高，根莖部位活性赤霉素含量降低，葉組織中GA3ox1、GA20ox1基因及GAs受體基因GID1B的高表達(dá)量，可以正向促進(jìn)葉片中活性赤霉素含量，為棉桃生長(zhǎng)發(fā)育與脫水成熟提供必要的激素水平，與前人研究一致[33]。GIDB作為GAs的受體基因，能與赤霉素結(jié)合形成二聚體，將赤霉素的信號(hào)傳遞給下游元件，在植物體上產(chǎn)生赤霉素效應(yīng)。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)棉花品種“中571”植株體內(nèi)赤霉素合成相關(guān)酶基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)各目的基因在不同組織內(nèi)的表達(dá)量有所差異。且隨著生長(zhǎng)發(fā)育的進(jìn)行，棉花植株根莖葉組織內(nèi)赤霉素合成相關(guān)基因的表達(dá)量變化趨勢(shì)存在一定差異。幼苗期莖組織內(nèi)GA3ox1和GA20ox1表達(dá)量較高，為植株的生長(zhǎng)發(fā)育提供了充足的激素水平；開(kāi)花期，莖、葉、花組織中的GA3ox1、GA20ox1基因表達(dá)可能與開(kāi)花成鈴有關(guān)；吐絮期，根莖組織GA2ox1基因表達(dá)量升高，活性GAs合成降低，葉組織中GA3ox1、GA20ox1基因及GAs受體基因GID1B表達(dá)量上調(diào)，為棉桃生長(zhǎng)發(fā)育與脫水成熟提供了必要的激素水平。